A new ultrasonic signal amplification method for detection bacteria

A new method is presented that increases the sensitivity of ultrasound-based techniques for detection of bacteria. The technique was developed for the detection of catalase-positive microorganisms. It uses a bubble trapping medium containing hydrogen peroxide that is mixed with the sample for microbiological evaluation. The enzyme catalase is present in catalase-positive bacteria, which induces a rapid hydrolysis of hydrogen peroxide, forming bubbles which remain in the medium. This reaction results in the amplification of the mechanical changes that the microorganisms produce in the medium. The effect can be detected by means of ultrasonic wave amplitude continuous measurement since the bubbles increase the ultrasonic attenuation significantly. It is shown that microorganism concentrations of the order of 105 cells ml−1 can be detected using this method. This allows an improvement of three orders of magnitude in the ultrasonic detection threshold of microorganisms in conventional culture media, and is competitive with modern rapid microbiological methods. It can also be used for the characterization of the enzymatic activity.

Molecular immune responses of the mosquito Anopheles gambiae to bacteria and malaria parasites

Immune responses of the malaria vector mosquito Anopheles gambiae were monitored systematically by the induced expression of five RNA markers after infection challenge. One newly isolated marker encodes a homologue of the moth Gram-negative bacteria-binding protein (GNBP), and another corresponds to a serine protease-like molecule. Additional previously described markers that respond to immune challenge encode the antimicrobial peptide defensin, a putative galactose lectin, and a putative serine protease. Specificity of the immune responses was indicated by differing temporal patterns of induction of specific markers in bacteria-challenged larvae and adults, and by variations in the effectiveness of different microorganisms and their components for marker induction in an immune-responsive cell line. The markers exhibit spatially distinct patterns of expression in the adult female mosquito. Two of them are highly expressed in different regions of the midgut, one in the anterior and the other in the posterior midgut. Marker induction indicates a significant role of the midgut in insect innate immunity. Immune responses to the penetration of the midgut epithelium by a malaria parasite occur both within the midgut itself and elsewhere in the body, suggesting an immune-related signaling process.

VanX, a bacterial d-alanyl-d-alanine dipeptidase: Resistance, immunity, or survival function?

The zinc-containing d-alanyl-d-alanine (d-Ala-d-Ala) dipeptidase VanX has been detected in both Gram-positive and Gram-negative bacteria, where it appears to have adapted to at least three distinct physiological roles. In pathogenic vancomycin-resistant enterococci, vanX is part of a five-gene cluster that is switched on to reprogram cell-wall biosynthesis to produce peptidoglycan chain precursors terminating in d-alanyl-d-lactate (d-Ala-d-lactate) rather than d-Ala-d-Ala. The modified peptidoglycan exhibits a 1,000-fold decrease in affinity for vancomycin, accounting for the observed phenotypic resistance. In the glycopeptide antibiotic producers Streptomyces toyocaensis and Amylocatopsis orientalis, a vanHAX operon may have coevolved with antibiotic biosynthesis genes to provide immunity by reprogramming cell-wall termini to d-Ala-d-lactate as antibiotic biosynthesis is initiated. In the Gram-negative bacterium Escherichia coli, which is never challenged by the glycopeptide antibiotics because they cannot penetrate the outer membrane permeability barrier, the vanX homologue (ddpX) is cotranscribed with a putative dipeptide transport system (ddpABCDF) in stationary phase by the transcription factor RpoS (σs). The combined action of DdpX and the permease would permit hydrolysis of d-Ala-d-Ala transported back into the cytoplasm from the periplasm as cell-wall crosslinks are refashioned. The d-Ala product could then be oxidized as an energy source for cell survival under starvation conditions.

A minimal gene set for cellular life derived by comparison of complete bacterial genomes.

The recently sequenced genome of the parasitic bacterium Mycoplasma genitalium contains only 468 identified protein-coding genes that have been dubbed a minimal gene complement [Fraser, C.M., Gocayne, J.D., White, O., Adams, M.D., Clayton, R.A., et al. (1995) Science 270, 397-403]. Although the M. genitalium gene complement is indeed the smallest among known cellular life forms, there is no evidence that it is the minimal self-sufficient gene set. To derive such a set, we compared the 468 predicted M. genitalium protein sequences with the 1703 protein sequences encoded by the other completely sequenced small bacterial genome, that of Haemophilus influenzae. M. genitalium and H. influenzae belong to two ancient bacterial lineages, i.e., Gram-positive and Gram-negative bacteria, respectively. Therefore, the genes that are conserved in these two bacteria are almost certainly essential for cellular function. It is this category of genes that is most likely to approximate the minimal gene set. We found that 240 M. genitalium genes have orthologs among the genes of H. influenzae. This collection of genes falls short of comprising the minimal set as some enzymes responsible for intermediate steps in essential pathways are missing. The apparent reason for this is the phenomenon that we call nonorthologous gene displacement when the same function is fulfilled by nonorthologous proteins in two organisms. We identified 22 nonorthologous displacements and supplemented the set of orthologs with the respective M. genitalium genes. After examining the resulting list of 262 genes for possible functional redundancy and for the presence of apparently parasite-specific genes, 6 genes were removed. We suggest that the remaining 256 genes are close to the minimal gene set that is necessary and sufficient to sustain the existence of a modern-type cell. Most of the proteins encoded by the genes from the minimal set have eukaryotic or archaeal homologs but seven key proteins of DNA replication do not. We speculate that the last common ancestor of the three primary kingdoms had an RNA genome. Possibilities are explored to further reduce the minimal set to model a primitive cell that might have existed at a very early stage of life evolution.

Type 1 fimbrial expression enhances Escherichia coli virulence for the urinary tract.

Type 1 fimbriae are adhesion organelles expressed by many Gram-negative bacteria. They facilitate adherence to mucosal surfaces and inflammatory cells in vitro, but their contribution to virulence has not been defined. This study presents evidence that type 1 fimbriae increase the virulence of Escherichia coli for the urinary tract by promoting bacterial persistence and enhancing the inflammatory response to infection. In a clinical study, we observed that disease severity was greater in children infected with E. coli O1:K1:H7 isolates expressing type 1 fimbriae than in those infected with type 1 negative isolates of the same serotype. The E. coli O1:K1:H7 isolates had the same electrophoretic type, were hemolysin-negative, expressed P fimbriae, and carried the fim DNA sequences. When tested in a mouse urinary tract infection model, the type 1-positive E. coli O1:K1:H7 isolates survived in higher numbers, and induced a greater neutrophil influx into the urine, than O1:K1:H7 type 1-negative isolates. To confirm a role of type 1 fimbriae, a fimH null mutant (CN1016) was constructed from an O1:K1:H7 type 1-positive parent. E. coli CN1016 had reduced survival and inflammatogenicity in the mouse urinary tract infection model. E. coli CN1016 reconstituted with type 1 fimbriae (E. coli CN1018) had restored virulence similar to that of the wild-type parent strain. These results show that type 1 fimbriae in the genetic background of a uropathogenic strain contribute to the pathogenesis of E. coli in the urinary tract.

A chromosomal locus required for copper resistance, competitive fitness, and cytochrome c biogenesis in Pseudomonas fluorescens.

A chromosomal locus required for copper resistance and competitive fitness was cloned from a strain of Pseudomonas fluorescens isolated from copper-contaminated agricultural soil. Sequence analysis of this locus revealed six open reading frames with homology to genes involved in cytochrome c biogenesis in other bacteria, helC, cycJ, cycK, tipB, cycL, and cycH, with the closest similarity being to the aeg-46.5(yej) region of the Escherichia coli chromosome. The proposed functions of these genes in other bacteria include the binding, transport, and coupling of heme to apocytochrome c in the periplasm of these Gram-negative bacteria. Putative heme-binding motifs were present in the predicted products of cycK and cycL, and TipB contained a putative disulfide oxidoreductase active site proposed to maintain the heme-binding site of the apocytochrome in a reduced state for ligation of heme. Tn3-gus mutagenesis showed that expression of the genes was constitutive but enhanced by copper, and confirmed that the genes function both in copper resistance and production of active cytochrome c. However, two mutants in cycH were copper-sensitive and oxidase-positive, suggesting that the functions of these genes, rather than cytochrome c oxidase itself, were required for resistance to copper.

Mucosal and systemic immune responses to a recombinant protein expressed on the surface of the oral commensal bacterium Streptococcus gordonii after oral colonization.

To circumvent the need to engineer pathogenic microorganisms as live vaccine-delivery vehicles, a system was developed which allowed for the stable expression of a wide range of protein antigens on the surface of Gram-positive commensal bacteria. The human oral commensal Streptococcus gordonii was engineered to surface express a 204-amino acid allergen from hornet venom (Ag5.2) as a fusion with the anchor region of the M6 protein of Streptococcus pyogenes. The immunogenicity of the M6-Ag5.2 fusion protein was assessed in mice inoculated orally and intranasally with a single dose of recombinant bacteria, resulting in the colonization of the oral/pharyngeal mucosa for 10-11 weeks. A significant increase of Ag5.2-specific IgA with relation to the total IgA was detected in saliva and lung lavages when compared with mice colonized with wild-type S. gordonii. A systemic IgG response to Ag5.2 was also induced after oral colonization. Thus, recombinant Gram-positive commensal bacteria may be a safe and effective way of inducing a local and systemic immune response.

Applicazione della spettrometria di massa MALDI-TOF in microbiologia clinica

Riassunto La spettrometria di massa (MS) nata negli anni ’70 trova oggi, grazie alla tecnologia Matrix-Assisted Laser Desorption Ionization-Time of Flight (MALDI-TOF), importanti applicazioni in diversi settori: biotecnologico (per la caratterizzazione ed il controllo di qualità di proteine ricombinanti ed altre macromolecole), medico–clinico (per la diagnosi di laboratorio di malattie e per lo sviluppo di nuovi trattamenti terapeutici mirati), alimentare ed ambientale. Negli ultimi anni, questa tecnologia è diventata un potente strumento anche per la diagnosi di laboratorio in microbiologia clinica, rivoluzionando il flusso di lavoro per una rapida identificazione di batteri e funghi, sostituendo l’identificazione fenotipica convenzionale basata su saggi biochimici. Attualmente mediante MALDI-TOF MS sono possibili due diversi approcci per la caratterizzazione dei microrganismi: (1) confronto degli spettri (“mass spectra”) con banche dati contenenti profili di riferimento (“database fingerprints”) e (2) “matching” di bio-marcatori con banche dati proteomiche (“proteome database”). Recentemente, la tecnologia MALDI-TOF, oltre alla sua applicazione classica nell’identificazione di microrganismi, è stata utilizzata per individuare, indirettamente, meccanismi di resistenza agli antibiotici. Primo scopo di questo studio è stato verificare e dimostrare l’efficacia identificativa della metodica MALDI-TOF MS mediante approccio di comparazione degli spettri di differenti microrganismi di interesse medico per i quali l’identificazione risultava impossibile a causa della completa assenza o presenza limitata, di spettri di riferimento all’interno della banca dati commerciale associata allo strumento. In particolare, tale scopo è stato raggiunto per i batteri appartenenti a spirochete del genere Borrelia e Leptospira, a miceti filamentosi (dermatofiti) e protozoi (Trichomonas vaginalis). Secondo scopo di questo studio è stato valutare il secondo approccio identificativo basato sulla ricerca di specifici marcatori per differenziare parassiti intestinali di interesse medico per i quali non è disponibile una banca dati commerciale di riferimento e la sua creazione risulterebbe particolarmente difficile e complessa, a causa della complessità del materiale biologico di partenza analizzato e del terreno di coltura nei quali questi protozoi sono isolati. Terzo ed ultimo scopo di questo studio è stata la valutazione dell’applicabilità della spettrometria di massa con tecnologia MALDI-TOF per lo studio delle resistenze batteriche ai carbapenemi. In particolare, è stato messo a punto un saggio di idrolisi dei carbapenemi rilevata mediante MALDI-TOF MS in grado di determinare indirettamente la produzione di carbapenemasi in Enterobacteriaceae. L’efficacia identificativa della metodica MALDI-TOF mediante l’approccio di comparazione degli spettri è stata dimostrata in primo luogo per batteri appartenenti al genere Borrelia. La banca dati commerciale dello strumento MALDI-TOF MS in uso presso il nostro laboratorio includeva solo 3 spettri di riferimento appartenenti alle specie B. burgdorferi ss, B. spielmani e B. garinii. L’implementazione del “database” con specie diverse da quelle già presenti ha permesso di colmare le lacune identificative dovute alla mancanza di spettri di riferimento di alcune tra le specie di Borrelia più diffuse in Europa (B. afzelii) e nel mondo (come ad esempio B. hermsii, e B. japonica). Inoltre l’implementazione con spettri derivanti da ceppi di riferimento di specie già presenti nel “database” ha ulteriormente migliorato l’efficacia identificativa del sistema. Come atteso, il ceppo di isolamento clinico di B. lusitaniae (specie non presente nel “database”) è stato identificato solo a livello di genere corroborando, grazie all’assenza di mis-identificazione, la robustezza della “nuova” banca dati. I risultati ottenuti analizzando i profili proteici di ceppi di Borrelia spp. di isolamento clinico, dopo integrazione del “database” commerciale, indicano che la tecnologia MALDI-TOF potrebbe essere utilizzata come rapida, economica ed affidabile alternativa ai metodi attualmente utilizzati per identificare ceppi appartenenti a questo genere. Analogamente, per il genere Leptospira dopo la creazione ex-novo della banca dati “home-made”, costruita con i 20 spettri derivati dai 20 ceppi di riferimento utilizzati, è stata ottenuta una corretta identificazione a livello di specie degli stessi ceppi ri-analizzati in un esperimento indipendente condotto in doppio cieco. Il dendrogramma costruito con i 20 MSP-Spectra implementati nella banca dati è formato da due rami principali: il primo formato dalla specie non patogena L. biflexa e dalla specie a patogenicità intermedia L. fainei ed il secondo che raggruppa insieme le specie patogene L. interrogans, L. kirschneri, L. noguchii e L. borgpetersenii. Il secondo gruppo è ulteriormente suddiviso in due rami, contenenti rispettivamente L. borgpetersenii in uno e L. interrogans, L. kirschneri e L. noguchii nell’altro. Quest’ultimo, a sua volta, è suddiviso in due rami ulteriori: il primo comprendente la sola specie L. noguchii, il secondo le specie L. interrogans e L. kirshneri non separabili tra loro. Inoltre, il dendrogramma costruito con gli MSP-Spectra dei ceppi appartenenti ai generi Borrelia e Leptospira acquisiti in questo studio, e appartenenti al genere Brachyspira (implementati in un lavoro precedentemente condotto) mostra tre gruppi principali separati tra loro, uno per ogni genere, escludendo possibili mis-identificazioni tra i 3 differenti generi di spirochete. Un’analisi più approfondita dei profili proteici ottenuti dall’analisi ha mostrato piccole differenze per ceppi della stessa specie probabilmente dovute ai diversi pattern proteici dei distinti sierotipi, come confermato dalla successiva analisi statistica, che ha evidenziato picchi sierotipo-specifici. È stato, infatti, possibile mediante la creazione di un modello statistico dedicato ottenere un “pattern” di picchi discriminanti in grado di differenziare a livello di sierotipo sia i ceppi di L. interrogans sia i ceppi di L. borgpetersenii saggiati, rispettivamente. Tuttavia, non possiamo concludere che i picchi discriminanti da noi riportati siano universalmente in grado di identificare il sierotipo dei ceppi di L. interrogans ed L. borgpetersenii; i picchi trovati, infatti, sono il risultato di un’analisi condotta su uno specifico pannello di sierotipi. È stato quindi dimostrato che attuando piccoli cambiamenti nei parametri standardizzati come l’utilizzo di un modello statistico e di un programma dedicato applicato nella routine diagnostica è possibile utilizzare la spettrometria di massa MALDI-TOF per una rapida ed economica identificazione anche a livello di sierotipo. Questo può significativamente migliorare gli approcci correntemente utilizzati per monitorare l’insorgenza di focolai epidemici e per la sorveglianza degli agenti patogeni. Analogamente a quanto dimostrato per Borrelia e Leptospira, l’implementazione della banca dati dello spettrometro di massa con spettri di riferimento di miceti filamentosi (dermatofiti) si è rilevata di particolare importanza non solo per l’identificazione di tutte le specie circolanti nella nostra area ma anche per l’identificazione di specie la cui frequenza nel nostro Paese è in aumento a causa dei flussi migratori dalla zone endemiche (M. audouinii, T. violaceum e T. sudanense). Inoltre, l’aggiornamento del “database” ha consentito di superare la mis-identificazione dei ceppi appartenenti al complesso T. mentagrophytes (T. interdigitale e T. mentagrophytes) con T. tonsurans, riscontrata prima dell’implementazione della banca dati commerciale. Il dendrogramma ottenuto dai 24 spettri implementati appartenenti a 13 specie di dermatofiti ha rivelato raggruppamenti che riflettono quelli costruiti su base filogenetica. Sulla base dei risultati ottenuti mediante sequenziamento della porzione della regione ITS del genoma fungino non è stato possibile distinguere T. interdigitale e T. mentagrophytes, conseguentemente anche gli spettri di queste due specie presentavano picchi dello stesso peso molecoalre. Da sottolineare che il dendrogramma costruito con i 12 profili proteici già inclusi nel database commerciale e con i 24 inseriti nel nuovo database non riproduce l’albero filogenetico per alcune specie del genere Tricophyton: gli spettri MSP già presenti nel database e quelli aggiunti delle specie T. interdigitale e T. mentagrophytes raggruppano separatamente. Questo potrebbe spiegare le mis-identificazioni di T. interdigitale e T. mentagrophytes con T. tonsurans ottenute prima dell’implementazione del database. L’efficacia del sistema identificativo MALDI-TOF è stata anche dimostrata per microrganismi diversi da batteri e funghi per i quali la metodica originale è stata sviluppata. Sebbene tale sistema identificativo sia stato applicato con successo a Trichomonas vaginalis è stato necessario apportare modifiche nei parametri standard previsti per l’identificazione di batteri e funghi. Le interferenze riscontrate tra i profili proteici ottenuti per i due terreni utilizzati per la coltura di questo protozoo e per i ceppi di T. vaginalis hanno, infatti, reso necessario l’utilizzo di nuovi parametri per la creazione degli spettri di riferimento (MSP-Spectra). L’importanza dello sviluppo del nuovo metodo risiede nel fatto che è possibile identificare sulla base del profilo proteico (e non sulla base di singoli marcatori) microorganismi cresciuti su terreni complessi che potrebbero presentare picchi nell'intervallo di peso molecolare utilizzato a scopo identificativo: metaboliti, pigmenti e nutrienti presenti nel terreno possono interferire con il processo di cristallizzazione e portare ad un basso punteggio identificativo. Per T. vaginalis, in particolare, la “sottrazione” di picchi dovuti a molecole riconducibili al terreno di crescita utilizzato, è stata ottenuta escludendo dall'identificazione l'intervallo di peso molecolare compreso tra 3-6 kDa, permettendo la corretta identificazione di ceppi di isolamento clinico sulla base del profilo proteico. Tuttavia, l’elevata concentrazione di parassita richiesta (105 trofozoiti/ml) per una corretta identificazione, difficilmente ottenibile in vivo, ha impedito l’identificazione di ceppi di T. vaginalis direttamente in campioni clinici. L’approccio identificativo mediante individuazione di specifici marcatori proteici (secondo approccio identificativo) è stato provato ed adottato in questo studio per l’identificazione e la differenziazione di ceppi di Entamoeba histolytica (ameba patogena) ed Entamoeba dispar (ameba non patogena), specie morfologiacamente identiche e distinguibili solo mediante saggi molecolari (PCR) aventi come bersaglio il DNA-18S, che codifica per l’RNA della subunità ribosomiale minore. Lo sviluppo di tale applicazione ha consentito di superare l’impossibilità della creazione di una banca dati dedicata, a causa della complessità del materiale fecale di partenza e del terreno di coltura impiagato per l’isolamento, e di identificare 5 picchi proteici in grado di differenziare E. histolytica da E. dispar. In particolare, l’analisi statistica ha mostrato 2 picchi specifici per E. histolytica e 3 picchi specifici per E. dispar. L’assenza dei 5 picchi discriminanti trovati per E. histolytica e E. dispar nei profili dei 3 differenti terreni di coltura utilizzati in questo studio (terreno axenico LYI-S-2 e terreno di Robinson con e senza E. coli) permettono di considerare questi picchi buoni marcatori in grado di differenziare le due specie. La corrispondenza dei picchi con il PM di due specifiche proteine di E. histolytica depositate in letteratura (Amoebapore A e un “unknown putative protein” di E. histolytica ceppo di riferimento HM-1:IMSS-A) conferma la specificità dei picchi di E. histolytica identificati mediante analisi MALDI-TOF MS. Lo stesso riscontro non è stato possibile per i picchi di E. dispar in quanto nessuna proteina del PM di interesse è presente in GenBank. Tuttavia, va ricordato che non tutte le proteine E. dispar sono state ad oggi caratterizzate e depositate in letteratura. I 5 marcatori hanno permesso di differenziare 12 dei 13 ceppi isolati da campioni di feci e cresciuti in terreno di Robinson confermando i risultati ottenuti mediante saggio di Real-Time PCR. Per un solo ceppo di isolamento clinico di E. histolytica l’identificazione, confermata mediante sequenziamento della porzione 18S-rDNA, non è stata ottenuta mediante sistema MALDI-TOF MS in quanto non sono stati trovati né i picchi corrispondenti a E. histolytica né i picchi corrispondenti a E. dispar. Per questo ceppo è possibile ipotizzare la presenza di mutazioni geno/fenotipiche a livello delle proteine individuate come marcatori specifici per E. histolytica. Per confermare questa ipotesi sarebbe necessario analizzare un numero maggiore di ceppi di isolamento clinico con analogo profilo proteico. L’analisi condotta a diversi tempi di incubazione del campione di feci positivo per E. histolytica ed E. dipar ha mostrato il ritrovamento dei 5 picchi discriminanti solo dopo 12 ore dall’inoculo del campione nel terreno iniziale di Robinson. Questo risultato suggerisce la possibile applicazione del sistema MALDI-TOF MS per identificare ceppi di isolamento clinico di E. histolytica ed E. dipar nonostante la presenza di materiale fecale che materialmente può disturbare e rendere difficile l’interpretazione dello spettro ottenuto mediante analisi MALDI-TOF MS. Infine in questo studio è stata valutata l’applicabilità della tecnologia MALDI-TOF MS come saggio fenotipico rapido per la determinazione di ceppi produttori di carbapenemasi, verificando l'avvenuta idrolisi del meropenem (carbapeneme di riferimento utilizzato in questo studio) a contatto con i ceppi di riferimento e ceppi di isolamento clinico potenzialmente produttori di carbapenemasi dopo la messa a punto di un protocollo analitico dedicato. Il saggio di idrolisi del meropenem mediante MALDI-TOF MS ha dimostrato la presenza o l’assenza indiretta di carbapenemasi nei 3 ceppi di riferimento e nei 1219 (1185 Enterobacteriaceae e 34 non-Enterobacteriaceae) ceppi di isolamento clinico inclusi nello studio. Nessuna interferenza è stata riscontrata per i ceppi di Enterobacteriaceae variamente resistenti ai tre carbapenemi ma risultati non produttori di carbapenemasi mediante i saggi fenotipici comunemente impiegati nella diagnostica routinaria di laboratorio: nessuna idrolisi del farmaco è stata infatti osservata al saggio di idrolisi mediante MALDI-TOF MS. In un solo caso (ceppo di K. pneumoniae N°1135) è stato ottenuto un profilo anomalo in quanto presenti sia i picchi del farmaco intatto che quelli del farmaco idrolizzato. Per questo ceppo resistente ai tre carbapenemi saggiati, negativo ai saggi fenotipici per la presenza di carbapenemasi, è stata dimostrata la presenza del gene blaKPC mediante Real-Time PCR. Per questo ceppo si può ipotizzare la presenza di mutazioni a carico del gene blaKPC che sebbene non interferiscano con il suo rilevamento mediante PCR (Real-Time PCR positiva), potrebbero condizionare l’attività della proteina prodotta (Saggio di Hodge modificato e Test di Sinergia negativi) riducendone la funzionalità come dimostrato, mediante analisi MALDI-TOF MS, dalla presenza dei picchi relativi sia all’idrolisi del farmaco sia dei picchi relativi al farmaco intatto. Questa ipotesi dovrebbe essere confermata mediante sequenziamento del gene blaKPC e successiva analisi strutturale della sequenza amminoacidica deducibile. L’utilizzo della tecnologia MALDI-TOF MS per la verifica dell’avvenuta idrolisi del maropenem è risultato un saggio fenotipico indiretto in grado di distinguere, al pari del test di Hodge modificato impiegato comunemente nella routine diagnostica in microbiologia, un ceppo produttore di carbapenemasi da un ceppo non produttore sia per scopi diagnostici che per la sorveglianza epidemiologica. L’impiego del MALDI-TOF MS ha mostrato, infatti, diversi vantaggi rispetto ai metodi convenzionali (Saggio di Hodge modificato e Test di Sinergia) impiegati nella routine diagnostica di laboratorio i quali richiedono personale esperto per l’interpretazione del risultato e lunghi tempi di esecuzione e di conseguenza di refertazione. La semplicità e la facilità richieste per la preparazione dei campioni e l’immediata acquisizione dei dati rendono questa tecnica un metodo accurato e rapido. Inoltre, il metodo risulta conveniente dal punto di vista economico, con un costo totale stimato di 1,00 euro per ceppo analizzato. Tutte queste considerazioni pongono questa metodologia in posizione centrale in ambito microbiologico anche nel caso del rilevamento di ceppi produttori di carbapenemasi. Indipendentemente dall’approccio identificativo utilizzato, comparato con i metodi convenzionali il MALDI-TOF MS conferisce in molti casi un guadagno in termini di tempo di lavoro tecnico (procedura pre-analititca per la preparazione dei campioni) e di tempo di ottenimento dei risultati (procedura analitica automatizzata). Questo risparmio di tempo si accentua quando sono analizzati in contemporanea un maggior numero di isolati. Inoltre, la semplicità e la facilità richieste per la preparazione dei campioni e l’immediata acquisizione dei dati rendono questo un metodo di identificazione accurato e rapido risultando più conveniente anche dal punto di vista economico, con un costo totale di 0,50 euro (materiale consumabile) per ceppo analizzato. I risultati ottenuti dimostrano che la spettrometria di massa MALDI-TOF sta diventando uno strumento importante in microbiologia clinica e sperimentale, data l’elevata efficacia identificativa, grazie alla disponibilità sia di nuove banche dati commerciali sia di aggiornamenti delle stesse da parte di diversi utenti, e la possibilità di rilevare con successo anche se in modo indiretto le antibiotico-resistenze.

Novel microbicidal agents derived from Naja atra cardiotoxin 1 (CTX-1)

During my PhD course, I focused my research on antimicrobial peptides (AMPs), in particular on the aspects of their computational design and development. This work led to the development of a new family of AMPs that I designed, starting from the amino acid sequence of a snake venom toxin, the cardiotoxin 1 (CTX-1) of Naja atra. Naja atra atra cardiotoxin 1, produced by Chinese cobra snakes belonging to Elapidae family, is included in the three-finger toxin family and exerts high cytotoxicity and antimicrobial activity too. This toxin family is characterized by specific folding of three beta-sheet loops (“fingers”) extending from the central core and by four conserved disulfide bridges. Using as template the first loop of this toxin, different sequences of 20 amino acids linear cationic peptides have been designed in order to avoid toxic effects but to maintain and strengthen the antimicrobial activity. As a result, the sequence NCP-0 (Naja Cardiotoxin Peptide-0) was designed as ancestor and subsequently other 4 variant sequences of NCP0 were developed. These variant sequences have shown microbicidal activity towards a panel of reference strains of Gram-positive and Gram-negative bacteria, fungi and an enveloped virus. In particular, the sequence designed as NCP-3 (Naja Cardiotoxin Peptide-3) and its variants NCP-3a and NCP-3b have shown the best antimicrobial activity together with low cytotoxicity against eukaryotic cells and low hemolytic activity. Bactericidal activity has been demonstrated by minimum bactericidal concentration (MBC) assay at values below 10 μg/ml for Pseudomonas aeruginosa ATCC 27853, Acinetobacter baumannii ( clinical isolates), Moraxella catharralis ATCC 25238, MRSA ATCC 43400, while towards Staphylococcus aureus ATCC 25923, Enterococcus hirae ATCC 10541 and Streptococcus agalactiae ATCC 13813 the bactericidal activity was demonstrated even below 1.6 μg/ml concentration. This potent antimicrobial activity was confirmed even for unicellular fungi Candida albicans, Candida glabrata and Malassezia pachydermatis (MBC 32.26-6.4 μg/ml), and also against the fast-growing mycobacteria Mycobacterium smegmatis DSMZ 43756 and Mycobacterium fortuitum DSMZ 46621 (MBC 100 μg/ml). Moreover, NCP-3 has shown a virucidal activity on the enveloped virus Bovine Herpesvirus 1 (BoHV1) belonging to herpesviridae family. The bactericidal activity is maintained in a high salt concentration (125 and 250 mM NaCl) medium and PB +20% Mueller Hinton Medium for E. coli, MRSA and Pseudomonas aeruginosa reference strains. Considering these in vitro obtained data, we propose NCP-3 and its variants NCP-3a and NCP-3b as promising antimicrobial candidates. For this reason, the whole novel AMPs family has been protected by a national patent (n°102015000015951).

Estado sanitário do jacaré-de-papo-amarelo (Caiman latirostris) em paisagens antropizadas no Estado de São Paulo

O jacaré-de-papo (Caiman latirostris) é considerado um crocodiliano de médio porte que apresenta uma ampla distribuição latitudinal na América do Sul. Possivelmente a espécie possui a situação mais complexa entre os crocodilianos brasileiros quanto ao aspecto da conservação, basicamente porque suas populações encontram-se fragmentadas em grande parte de sua área de distribuição original e por utilizarem áreas com fortes atividades antrópicas. Embora a espécie possua aparentemente um processo adaptativo frente a estas pressões, um aspecto fisiológico pode ainda sofrer rápida alteração quando submetido a elas: o estado sanitário. Desta maneira, este estudo objetivou determinar o estado sanitário do maior predador aquático, utilizando duas áreas distintas no Estado de São Paulo, através da determinação dos perfis hematológicos e bioquímicos do sangue, além da caracterização da microbiota oral, servindo de modelo à conservação da espécie em ambientes alterados. No primeiro capítulo foram determinados o perfil hematológico e bioquímico do sangue utilizando-se 29 indivíduos (19 machos e 10 fêmeas) capturados em Angatuba e 11 indivíduos (2 machos, 4 fêmeas e 5 filhotes) capturados em Cubatão. Diferenças estatísticas significativas foram encontradas nos valores de creatinina na comparação entre fêmeas de ambas as áreas de estudo (p = 0,033) e nos valores de alanina aminotransferase (p = 0,003), hemácias (p = 0,034), hemoglobina (p = 0,049) e volume corpuscular médio (p = 0,027) quando da comparação entre sexos. No segundo capítulo determinou-se a microbiota oral destes animais através do isolamento, identificação e caracterização bacteriana, em conjunto com o teste de perfil de susceptibilidade aos antimicrobianos. Foram determinados 14 diferentes tipos de bactérias na área de Angatuba, sendo uma classificada como baciliforme aeróbio Gram-positivo, uma como bacilo Gram-negativo e 12 classificadas como Enterobactérias Gram-negativas. Na área de Cubatão foram isolados cinco tipos de bactérias, sendo quatro classificadas como Enterobactérias Gram-negativas e uma como baciliforme aeróbio Gram-positivo. Considerando que o uso de antimicrobianos é um processo primário no tratamento de animais e pessoas, principalmente nos casos que envolvam infecções provocadas pela interação homem x animais, para ambas as áreas de estudo, as quinolonas Enrofloxacina e Norfloxacina, além do aminoglicosídeo Gentamicina, foram os antimicrobianos que apresentaram os menores índices de resistência frente aos isolados testados.

Structure of circulin B and implications for antimicrobial activity of the cyclotides

The solution structure of one of the first members of the cyclotide family of macrocyclic peptides to be discovered, circulin B has been determined and compared with that of circulin A and related cyclotides. Cyclotides are mini-proteins derived from plants that have the characteristic features of a head-to-tail cyclised peptide backbone and a knotted arrangement of their three disulfide bonds. First discovered because of their uterotonic or anti-HIV activity, they have also been reported to have activity against a range of Gram positive and Gram negative bacteria as well as fungi. The aim of the current study was to develop structure-activity relationships to rationalise this antimicrobial activity. Comparison of cyclotide structures and activities suggests that the presence and location of cationic residues may be a requirement for activity against Gram negative bacteria. Understanding the topological differences associated with the antimicrobial activity of the cyclotides is of significant interest and potentially may be harnessed for pharmaceutical applications.

Culturable bacterial symbionts isolated from two distinct sponge species (Pseudoceratina clavata and Rhabdastrella globostellata) from the Great Barrier Reef display similar phylogenetic diversity

The diversity of the culturable microbial communities was examined in two sponge species-Pseudoceratina clavata and Rhabdastrella globostellata. Isolates were characterized by 16S rRNA gene sequencing and phylogenetic analysis. The bacterial community structures represented in both sponges were found to be similar at the phylum level by the same four phyla in this study and also at a finer scale at the species level in both Firmicutes and Alphaproteobacteria. The majority of the Alphaproteobacteria isolates were most closely related to isolates from other sponge species including alpha proteobacterium NW001 sp. and alpha proteobacterium MBIC3368. Members of the low %G + C gram-positive (phylum Firmicutes), high %G + C gram-positive (phylum Actinobacteria), and Cytophaga-Flavobacterium-Bacteroides (phylum Bacteroidetes) phyla of domain Bacteria were also represented in both sponges. In terms of culturable organisms, taxonomic diversity of the microbial community in the two sponge species displays similar structure at phylum level. Within phyla, isolates often belonged to the same genus-level monophyletic group. Community structure and taxonomic composition in the two sponge species P. clavata and Rha. globostellata share significant features with those of other sponge species including those from widely separated geographical and climatic regions of the sea.

Automated synthesis and evaluation of potential new anti-microbial agents

A series of N1-benzylideneheteroarylcarboxamidrazones was prepared in an automated fashion, and tested against Mycobacterium fortuitum in a rapid screen for antimycobacterial activity. Many of the compounds from this series were also tested against Mycobacterium tuberculosis, and the usefulness as M.fortuitum as a rapid, initial screen for anti-tubercular activity evaluated. Various deletions were made to the N1-benzylideneheteroarylcarboxamidrazone structure in order to establish the minimum structural requirements for activity. The N1-benzylideneheteroarylcarbox-amidrazones were then subjected to molecular modelling studies and their activities against M.fortuitum and M.tuberculosis were analysed using quantitative structure-analysis relationship (QSAR) techniques in the computational package TSAR (Oxford Molecular Ltd.). A set of equations predictive of antimycobacterial activity was hereby obtained. The series of N1-benzylidenehetero-arylcarboxamidrazones was also tested against a multidrug-resistant strain of Staphylococcus aureus (MRSA), followed by a panel of Gram-positive and Gram-negative bacteria, if activity was observed for MRSA. A set of antimycobacterial N1-benzylideneheteroarylcarboxamidrazones was hereby discovered, the best of which had MICs against m. fortuitum in the range 4-8μgml-1 and displayed 94% inhibition of M.tuberculosis at a concentration of 6.25μgml-1. The antimycobacterial activity of these compounds appeared to be specific, since the same compounds were shown to be inactive against other classes of organisms. Compounds which were found to be sufficiently active in any screen were also tested for their toxicity against human mononuclear leucocytes. Polyethylene glycol (PEG) was used as a soluble polymeric support for the synthesis of some fatty acid derivatives, containing an isoxazoline group, which may inhibit mycolic acid synthesis in mycobacteria. Both the PEG-bound products and the cleaved, isolated products themselves were tested against M.fortuitum and some low levels of antimycobacterial activity were observed, which may serve as lead compounds for further studies.

Chitosan gel film bandages: correlating structure, composition, and antimicrobial properties

Chitosan gel films were successfully obtained by evaporation cast from chitosan solutions in aqueous acidic solutions of organic acids (lactic and acetic acid) as gel film bandages, with a range of additives that directly influence film morphology and porosity. We show that the structure and composition of a wide range of 128 thin gel films, is correlated to the antimicrobial properties, their biocompatibility and resistance to biodegradation. Infrared spectroscopy and solid-state 13C nuclear magnetic resonance spectroscopy was used to correlate film molecular structure and composition to good antimicrobial properties against 10 of the most prevalent Gram positive and Gram negative bacteria. Chitosan gel films reduce the number of colonies after 24 h of incubation by factors of ∼105–107 CFU/mL, compared with controls. For each of these films, the structure and preparation condition has a direct relationship to antimicrobial activity and effectiveness. These gel film bandages also show excellent stability against biodegradation with lysozyme under physiological conditions (5% weight loss over a period of 1 month, 2% in the first week), allowing use during the entire healing process. These chitosan thin films and subsequent derivatives hold potential as low-cost, dissolvable bandages, or second skin, with antimicrobial properties that prohibit the most relevant intrahospital bacteria that infest burn injuries.