984 resultados para translocação de Ca2
Resumo:
A adenosina um nuclesido ubquo envolvido na regulao de controlo do tnus vascular do tecido cavernoso, desempenhando um papel importante na fisiopatologia da Disfuno Ertil (DE) resistente aos frmacos relaxantes musculares clssicos. Apesar da importncia comprovada dos recetores da adenosina na fisiopatologia da DE no homem, pouca informao conhecida no que diz respeito expresso e localizao dos recetores purinrgicos no Tecido Cavernoso de Ratazana (TCR). Neste trabalho avaliou-se o fentipo dos recetores purinrgicos responsveis pela regulao do tnus do tecido ertil de ratazana por imunofluorescncia indireta aplicada microscopia confocal em co-culturas de clulas endoteliais e musculares lisas do TCR. Para alm da caracterizao imunofenotpica, desenvolveu-se uma tcnica que permite diferenciar funcionalmente em tempo real (por microscopia confocal funcional) clulas musculares lisas e clulas endoteliais isoladas de TCR em co-cultura marcadas com a sonda fluorescente Fluo-4NW. Esta tcnica permite distinguir cada um dos subtipos celulares mediante o padro e a magnitude das oscilaes dos nveis intracelulares de Ca2+ ([Ca2+]i) em resposta ao ATP (agonista P2) e fenilefrina (PE, agonista -adrenrgico). Nas clulas musculares lisas, observou-se uma resposta mais acentuada ao agonista -adrenrgico, PE, e uma resposta menos significativa ao ATP. O contrrio foi observado relativamente s clulas endoteliais. A incubao das clulas musculares lisas e endoteliais com ATP (300 M) causou um aumento dos nveis de [Ca2+]i. O efeito do ATP (300 M) parece envolver a ativao de recetores dos subtipos P2X1 e P2X3 sensveis ao bloqueio com NF023 (3M) e A317491 (100 nM), respetivamente. J o aumento dos nveis [Ca2+]i produzido pelo ADP (300 M) parece envolver a ativao de recetores P2Y1, P2Y12 e P2Y13 mediante o antagonismo produzido pelos antagonistas MRS 2179 (0,3M), AR-C66096 (0,1 M) e MRS 2211 (10M), respetivamente. Os dois tipos celulares expressam imunorreatividade contra recetores A2A, A2B, P2X1, P2X3, P2Y1, P2Y12 e P2Y13.
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Febs Journal (2009)276:1776-1786
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The S100 proteins are 10-12 kDa EF-hand proteins that act as central regulators in a multitude of cellular processes including cell survival, proliferation, differentiation and motility. Consequently, many S100 proteins are implicated and display marked changes in their expression levels in many types of cancer, neurodegenerative disorders, inflammatory and autoimmune diseases. The structure and function of S100 proteins are modulated by metal ions via Ca2+ binding through EF-hand motifs and binding of Zn2+ and Cu2+ at additional sites, usually at the homodimer interfaces. Ca2+ binding modulates S100 conformational opening and thus promotes and affects the interaction with p53, the receptor for advanced glycation endproducts and Toll-like receptor 4, among many others. Structural plasticity also occurs at the quaternary level, where several S100 proteins self-assemble into multiple oligomeric states, many being functionally relevant. Recently, we have found that the S100A8/A9 proteins are involved in amyloidogenic processes in corpora amylacea of prostate cancer patients, and undergo metal-mediated amyloid oligomerization and fibrillation in vitro. Here we review the unique chemical and structural properties of S100 proteins that underlie the conformational changes resulting in their oligomerization upon metal ion binding and ultimately in functional control. The possibility that S100 proteins have intrinsic amyloid-forming capacity is also addressed, as well as the hypothesis that amyloid self-assemblies may, under particular physiological conditions, affect the S100 functions within the cellular milieu.
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S100A6 is a small EF-hand calcium- and zinc-binding protein involved in the regulation of cell proliferation and cytoskeletal dynamics. It is overexpressed in neurodegenerative disorders and a proposed marker for Amyotrophic Lateral Sclerosis (ALS). Following recent reports of amyloid formation by S100 proteins, we investigated the aggregation properties of S100A6. Computational analysis using aggregation predictors Waltz and Zyggregator revealed increased propensity within S100A6 helices HI and HIV. Subsequent analysis of Thioflavin-T binding kinetics under acidic conditions elicited a very fast process with no lag phase and extensive formation of aggregates and stacked fibrils as observed by electron microscopy. Ca2+ exerted an inhibitory effect on the aggregation kinetics, which could be reverted upon chelation. An FT-IR investigation of the early conformational changes occurring under these conditions showed that Ca2+ promotes anti-parallel -sheet conformations that repress fibrillation. At pH 7, Ca2+ rendered the fibril formation kinetics slower: time-resolved imaging showed that fibril formation is highly suppressed, with aggregates forming instead. In the absence of metals an extensive network of fibrils is formed. S100A6 oligomers, but not fibrils, were found to be cytotoxic, decreasing cell viability by up to 40%. This effect was not observed when the aggregates were formed in the presence of Ca2+. Interestingly, native S1006 seeds SOD1 aggregation, shortening its nucleation process. This suggests a cross-talk between these two proteins involved in ALS. Overall, these results put forward novel roles for S100 proteins, whose metal-modulated aggregation propensity may be a key aspect in their physiology and function.
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Resumo A tumorignese um processo de transformao celular que se desenrola tipicamente em vrias etapas. Os diferentes nveis de evoluo tumoral resultam da acumulao sucessiva de mutaes genticas numa clula normal que lhe conferem uma vantagem selectiva no respectivo meio tecidular. As mutaes podem manifestar-se sob a forma de alteraes nucleotdicas pontuais ao nvel da sequncia de DNA, levando a uma desregulao da funo proteca ou formao de protenas no-funcionais, ou atravs de alteraes cromossmicas numricas ou estruturais. Na leucemia, por exemplo, os genes hbridos que resultam de translocaes cromossmicas desempenham um importante papel no processo tumorignico. Estes genes so transcritos sob a forma de um RNA mensageiro de fuso, o qual traduzido numa protena hbrida com funo oncognica. Frequentemente, os subtipos de doena leucmica esto associados com translocaes cromossmicas que envolvem 2 pontos de quebra recorrentes e especficos. disto exemplo a leucemia mielide crnica, em que uma translocação recproca entre os cromossomas 9 e 22 conduz formao de um gene de fuso BCR-ABL1. Em diferentes subtipos de doena, existe tambm uma pequena proporo de casos que apresenta translocaes cromossmicas complexas, que envolvem um ou mais pontos de quebra adicionais em outras localizaes genmicas alm das que esto implicadas na formao dos genes de fuso. Por vezes, os pontos de quebra esto tambm associados a deleces extensas de material gentico que se pensa terem uma funo importante na tumorignese. No entanto, o papel destas regies genmicas no desenvolvimento tumoral no tem sido um motivo recorrente de estudo. Neste contexto, o objectivo desta dissertao foi o de determinar o potencial papel tumorignico de alteraes gnicas adicionais ocorridas nos pontos de quebra de translocaes cromossmicas complexas. Para a prossecuo do objectivo proposto, foram estudados 5 rearranjos cromossmicos distintos associados com diferentes tipos de doena hematolgica maligna, nomeadamente a leucemia linfoblstica aguda de clulas B (2 casos), leucemia mielide aguda, neoplasma mieloproliferativo e sndrome mielodisplsico/neoplasma ieloproliferativo, no classificvel. O mapeamento dos pontos de quebra foi efectuado utilizando a hibridao fluorescente in situ e diferentes metodologias de biologia molecular, tendo como base a informao inicial da anlise citogentica. Em casos seleccionados, o papel dos novos genes candidatos foi avaliado in vitro utilizando modelos de linhas celulares, nomeadamente no que respeita s funes de controlo da proliferao celular e de regulao transcricional. De entre os 5 casos estudados, quatro deles evidenciaram translocaes complexas envolvendo 3 cromossomas, nomeadamente t(12;21;5)(p13;q22;q13), t(12;6;15)(p13;p24~25;q22), t(9;11;19)(p22;q23;p13) e t(X;20;16)(p11;q13;q23). No caso remanescente, foi observada uma translocação dicntrica dic(9;12)(p11;p11) acompanhada de deleces extensas em ambos os pontos de quebra. Nos casos com t(12;21;5) e t(9;11;19) as translocaes estavam associadas com a presena de genes de fuso recorrentes, nomeadamente TV6(12p13)-RUNX1(21q22) e TLL(11q23)-MLLT3(9p22), indicando que se tratavam de rearranjos complexos das translocaes t(12;21) e t(9;11) associadas com a leucemia linfoblstica aguda de clulas B e a leucemia mielide aguda, respectivamente. O papel dos pontos de quebra adicionais foi estudado em detalhe no caso com t(9;11;19). Atravs da metodologia de long distance inverse-polymerase chain reaction, foram identificados os pontos de quebra na sequncia de DNA dos 3 cromossomas envolvidos na translocação. Alm dos pontos de quebra nos genes MLL e MLLT3, foi observado que o local de quebra no cromossoma 19 interrompeu a sequncia de um novo gene, designado CCDC94,conduzindo sua haplo-insuficincia nas clulas com t(9;11;19). Atravs de ensaios de reverse transcription-polymerase chain reaction verificmos que o gene CCDC94 expresso ubiquitariamente em tecidos humanos normais. A anlise informtica da sequncia prevista da protena CCDC94 indicou uma elevada identidade de aminocidos com a protena cwf16, envolvida na regulao do ciclo celular da levedura Schizosaccharomyces pombe. Atravs da clonagem do DNA complementar de CCDC94 em vectores de expresso, e aps a transfeco destes em culturas de linhas celulares in vitro, observmos que este gene codifica uma protena de localizao exclusivamente nuclear. A expresso ectpica da protena CCDC94 diminuiu a progresso do ciclo celular e a proliferao das clulas em cultura. Inversamente, a supresso do transcrito do gene CCDC94 atravs de interferncia de RNA conduziu a um aumento significativo da proliferao celular, confirmando que CCDC94 regula negativamente a proliferao e a progresso do ciclo celular. Estes resultados mostram que os pontos de quebra adicionais, presentes em translocaes cromossmicas complexas em leucemia, podem resultar na haplo-insuficincia de genes controladores dos mecanismos proliferativos, cooperando desta forma com a aco das protenas de fuso para proporcionar ao clone leucmico uma proliferao celular descontrolada. Nos restantes 3 casos estudados no foram identificados genes de fuso. Ao invs, todos aqueles apresentaram deleces de extenso varivel associadas com os pontos de quebra cromossmicos. No caso com t(12;6;15), identificmos uma deleco de 1.2 megabases de DNA na banda 12p13 que resultou na eliminao de 9 genes incluindo ETV6 e CDKN1B. O gene ETV6 codifica um factor de transcrio que essencial para a formao das diferentes linhagens hematopoiticas na medula ssea, enquanto CDKN1B traduzido numa protena responsvel por bloquear a entrada das clulas na fase G1 do ciclo celular e,consequentemente, por travar a proliferao celular. Neste contexto, os resultados obtidos indicam que a perda simultnea de ETV6 e de CDKN1B, atravs de uma translocação cromossmica complexa, constituiu uma aco cooperativa na leucemognese. A mesma noo pode aplicar-se ao caso com dic(9;12), no qual pelo menos 2 genes que codificam para factores de transcrio importantes na linhagem hematopoitica, PAX5 no cromossoma 9 e ETV6 no cromossoma 12, estavam deleccionados como resultado do rearranjo cromossmico. Dado que o factor de transcrio PAX5 regula negativamente a expresso do gene FLT3, que desempenha uma funo pr-proliferativa, expectvel que a haplo-insuficincia de PAX5 no caso com dic(9;12) ter tido como consequncia uma elevao dos nveis de expresso de FLT3, contribuindo deste modo para uma proliferao celular aumentada. A t(X;20;16) foi identificada num doente com trombocitmia essencial (TE), uma doena que est intimamente relacionada com alteraes de vias intracelulares reguladas por citocinas. Neste caso, atravs da utilizao de um array genmico, identificmos a presena de pequenas deleces associadas com os pontos de quebra nos cromossomas 16 e 20. No cromossoma 16 apenas um gene, MAF, estava deleccionado, enquanto no cromossoma 20 a deleco tinha abrangido 3 genes. Dos genes deleccionados, dois deles, NFATC2 (20q13) e MAF (16q23), codificam protenas que operam como reguladores transcricionais de citocinas hematopoiticas. Dado que NFATC2 se localiza numa regio que constitui um alvo frequente de deleces em neoplasmas ieloproliferativos, incluindo a trombocitmia essencial,efectumos um estudo detalhado do papel deste gene na proliferao megacarioctica e na regulao da expresso de uma citocina hematopoitica (GM-CSF), implicada na maturao das diferentes linhagens mielides. Utilizando um modelo de linha celular de trombocitmia essencial, verificmos que a supresso do transcrito do gene NFATC2 in vitro, por interferncia de RNA, estava associada com um aumento da proliferao celular. Em concordncia, o bloqueio da activao da protena NFATC2 atravs de um inibidor especfico da sua interaco com a calcineurina, conduziu a um aumento da proliferao celular in vitro. Utilizando a PCR quantitativa em tempo real, detectou-se um aumento da produo do RNA de GM-CSF em ambos os ensaios celulares, indicando que o factor de transcrio NFATC2 pode regular negativamente a expresso de GM-CSF em clulas de trombocitmia essencial. No geral, estes resultados mostram que a reduo dos nveis fisiolgicos do transcrito NFATC2, ou a reduo da respectiva actividade proteica, esto relacionados com a proliferao de megacariocitos atravs do aumento da produo de GM-CSF. De acordo com estes resultados, verificmos que as clulas dos doentes com TE apresentam nveis mais baixos do transcrito NFATC2 do que a populao normal. Dado que o factor de transcrio MAF desempenha igualmente um papel como regular transcricional de citocinas, plausvel que a haplo-insuficincia dos genes NFATC2 e MAF, resultante do rearranjo cromossmico complexo t(X;20;16), teve um efeito cooperativo importante na patognese da trombocitmia essencial atravs da alterao do padro normal de expresso das citocinas hematopoiticas. Em sntese, efectumos nesta dissertao um estudo citogentico de 4 translocaes cromossmicas complexas incluindo t(12;21;5), t(12;6;15), t(9;11;19) e t(X;20;16), e de uma translocação dicntrica dic(9;12), associadas com diferentes neoplasmas hematolgicos. Em casos seleccionados efectumos tambm um estudo molecular detalhado das regies dos pontos de quebra. Esta anlise permitiu-nos identificar 2 genes, CCDC94 no cromossoma 19 e NFATC2 no cromossoma 20, cuja haplo-insuficincia pode promover o aumento da proliferao celular das clulas leucmicas. A partir destes estudos podem ser retiradas 2 noes principais: (i) Os pontos de quebra adicionais, que ocorrem em translocaes complexas associadas com a formao de genes de fuso, podem ter como consequncia a desregulao de genes controladores da proliferao celular (e.g., CCDC94); (ii) As translocaes complexas caracterizadas pela ausncia de genes de fuso recorrentes podero estar preferencialmente associadas com a presena de deleces, envolvendo um ou mais genes, nos pontos de quebra; nestas situaes, sero necessrios pelo menos 2 genes com funes celulares semelhantes (e.g., NFATC2 e MAF) ou complementares (e.g., ETV6 e CDKN1B) para, quando deleccionados, promoverem de forma cooperativa a leucemognese. Nestes termos, o modelo de alteraes genticas sequenciais que caracteriza o desenvolvimento do cancro pode ser substitudo por um modelo em que vrios genes-alvo so simultaneamente desregulados pela formao de uma translocação cromossmica complexa, evitando deste modo a necessidade de ocorrncia de alteraes genticas subsequentes.----------------------ABSTRACT: Tumourigenesis is a multistep process which results from the accumulation of successive genetic mutations in a normal cell. In leukemia for instance, recurrent translocations play a part in this process by generating fusion genes which lead to the production of hybrid proteins with an oncogenic role. However, a minor subset of chromosomal translocations referred to as complex or variant involves extra breakpoints at variable genome locations in addition to those implicated in the formation of fusion genes. We aimed to describe in this work the role, if any, of genes located at extra breakpoint locations or which are affected by breakpoint-adjacent deletions through the study of 5 leukemia patients.Two of the patients presented with TV6(12p13)-RUNX1(21q22) and MLL(11q23)- MLLT3(9p22) fusion genes as a result of a t(12;21;5) and a t(9;11;19), respectively. Detailed molecular characterization of the extra breakpoint at chromosome 19 in the latter case revealed that a novel ubiquitously expressed gene, CCDC94, with a potential role in cell cycle regulation, was disrupted by the breakpoint. We demonstrated using in vitro cellular assays that this gene codifies for a nuclear protein which negatively regulates cell cycle progression. These data shows that extra breakpoint locations of complex translocations may result in haplo-insufficiency of critical proliferation genes, thereby cooperating with the generation of hybrid proteins to provide unrestrained cell proliferation. In the other 3 patients there were reakpoint-associated deletions which precluded the formation of putative fusion genes. In a case with a t(12;6;15) we characterized a deletion at 12p13 which eliminated ETV6 and 8 other genes including CDKN1B. These findings indicate that concomitant loss of ETV6 and CDKN1B, which encodes a cyclin-dependent kinase inhibitor responsible for blocking entry of cells into the G1 phase of the cell cycle, acted cooperatively to promote leukemogenic proliferation. The same notion applied to a case with a dic(9;12) in which 2 genes encoding hematopoietic transcription factors - ETV6 and PAX5 (9p13)- were deleted as a result of breakpoint-adjacent deletions. Similarly, we found that 2 transcription factor genes involved in the regulation of cytokine expression, NFATC2 (20q13) and MAF (16q23), were involved in deletions contiguous to the breakpoints in a patient with a t(X;20;16). In vitro suppression of NFATC2 mRNA or inhibiton of NFATC2 protein activity enhanced cell proliferation as a result of an increase in the production of a myeloid-lineage stimulating hematopoietic cytokine, GM-CSF. These results suggest that haplo-insufficiency of NFATC2 and MAF genes had a cooperative effect in inducing cell proliferation as a result of a disregulation of cytokine production. Two main conclusions may be drawn from our studies: (i) In complex translocations associated with the production of fusion genes, additional breakpoints may cooperate in tumourigenesis by targeting genes that control cell proliferation; (ii) In complex translocations associated with small breakpoint-adjacent deletions, at least 2 genes with similar or complementary functions need to be deregulated to promote tumourigenesis.
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During myocardial ischemia and reperfusion both purines and pyrimidines are released into the extracellular milieu, thus creating a signaling wave that propagates to neighboring cells via membrane-bound P2 purinoceptors activation. Cardiac fibroblasts (CF) are important players in heart remodeling, electrophysiological changes and hemodynamic alterations following myocardial infarction. Here, we investigated the role UTP on calcium signaling and proliferation of CF cultured from ventricles of adult rats. Co-expression of discoidin domain receptor 2 and -smooth muscle actin indicate that cultured CF are activated myofibroblasts. Intracellular calcium ([Ca2+]i) signals were monitored in cells loaded with Fluo-4 NW. CF proliferation was evaluated by the MTT assay. UTP and the selective P2Y4 agonist, MRS4062, caused a fast desensitizing [Ca2+]i rise originated from thapsigargin-sensitive internal stores, which partially declined to a plateau providing the existence of Ca2+ in the extracellular fluid. The biphasic [Ca2+]i response to UTP was attenuated respectively by P2Y4 blockers, like reactive blue-2 and suramin, and by the P2Y11 antagonist, NF340. UTP and the P2Y2 receptor agonist MRS2768 increased, whereas the selective P2Y11 agonist NF546 decreased, CF growth; MRS4062 was ineffective. Blockage of the P2Y11receptor or its coupling to adenylate cyclase boosted UTP-induced CF proliferation. Confocal microscopy and Western blot analysis confirmed the presence of P2Y2, P2Y4 and P2Y11 receptors. Data indicate that besides P2Y4 and P2Y2 receptors which are responsible for UTP-induced [Ca2+]i transients and growth of CF, respectively, synchronous activation of the previously unrecognized P2Y11 receptor may represent an important target for anti-fibrotic intervention in cardiac remodeling.
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RESUMO: Sessenta e trs derivados de hidantona foram utilizados para avaliar possveis efeitos de modulao na actividade das bombas de efluxo (BE) na Salmonella NCTC 13349 utilizando um mtodo fluorimtrico semi-automtico. Nenhum dos compostos apresentaram actividade anti-bacteriana at concentraes de 240 mg/L. Entre todos os compostos, SZ-7 demonstrou possuir propriedades de modulao de effluxo na presena de glucose. Para testar esta actividade, estirpes de Salmonella resistentes ciprofloxacina, induzidas a elevados nveis de resistncia com sobre-expresso de BE, foram expostas ao SZ-7. Este derivado afectou a susceptibilidade das estirpes ciprofloxacina. Uma vez que os 63 compostos estudados apresentaram pouco efeito inibitrio /cumulativo, apesar de serem conhecidos pelos seus efeitos moduladores de BE-dependentes de ies em eucariotas, foi questionado o papel dos ies na regulao de BE bacterianas, que podero influenciar a eficcia de novos compostos. Para este estudo, utilizamos a Escherichia coli AG100 como modelo, devido ao extenso conhecimento no que respeita a estrutura e actividade das BE. Devido importncia de ies de clcio (Ca2+) nos canais de transporte membranar e na actividade de ATPases, a sua actividade na modulao do efluxo foi investigada. De resultados anteriormente obtidos concluiu-se que a pH 5 o efluxo independente de energia metablica; contudo, a pH 8 absolutamente dependente, sendo que o Ca2+ indispensvel para manter a actividade das ATPases bacterianas. A acumulao/effluxo de EtBr pela E. coli AG100 foi determinada na presena/ausncia de Ca2+, clorpromazina (inibidor de ligao de Ca2+ a protenas), e cido etilenodiamino tetra-actico (quelante de Ca2+). Acumulao/effluxo aumentou a pH 8, contudo o Ca2+ reverte estes efeitos evidenciando a sua importncia no funcionamento das BE bacterianas. Em resumo este trabalho colocou em evidncia que muitos aspectos bioqumicos e bioenergticos devem ser tomados em considerao no estudo da resistncia bacteriana mediada por BE.------- ABSTRACT: Sixty-three hydantoin derivatives were evaluated for their modulating effects on efflux pump (EP) activity of Salmonella NCTC 13349 utilizing a semi-automatic fluorometric method. None of the compounds presented antibacterial activities at concentrations as high as 240 mg/L. Among all compounds, SZ-7 showed possible efflux modulating activity in the presence of glucose, indicative of a potential EP inhibitor. To verify its potential effects, ciprofloxacin-resistant Salmonella strains, induced to high level resistance with over-expressing EPs, were exposed to SZ-7. This derivative affected the susceptibility of the ciprofloxacin-resistant strains. Since the 63 compounds studied had very low inhibitory/accumulative effects, even though their known for being efficient in modulating ion-driven eukaryotic EPs, we questioned whether ions had a leading role in regulating bacterial EPs, influencing the effectiveness of new compounds. For this study we used Escherichia coli AG100 as a model, due to the extensive knowledge on its EPs structure and activity. Owing the importance of calcium ions (Ca2+) for membrane transport channels and activity of ATPases, the role of Ca2+ was investigated. From previous results we concluded that at pH 5 efflux is independent of metabolic energy; however, at pH 8 it is entirely dependent of metabolic energy and the Ca2+ ions are essential to maintain the activity of bacterial ATPases. Accumulation and efflux of ethidium bromide (EtBr) by E. coli AG100 was determined in the presence and absence of Ca2+, chlorpromazine (inhibitor of Ca2+-binding to proteins), and ethylenediaminetetraacetic acid (Ca2+ chelator). Accumulation of EtBr increased at pH 8; however Ca2+ reversed these effects providing information as to the importance of this ion in the regulation of bacterial EP systems. Overall this work puts in evidence that many biochemical and bioenergetic aspects related to the strains physiology need to be taken into consideration in bacterial drug resistance mediated by EPs.
Resumo:
Resumo: RodZ um componente do sistema morfogentico das clulas bacterianas. uma protena transmembranar que localiza em bandas ao longo do eixo longitudinal da clula. Em Bacillus subtilis, RodZ consiste numa poro citoplasmtica, RodZn, e em uma parte extra-citoplasmtica, RodZc. RodZn contm um domnio em helixturn- helix (HTH), enquanto que RodZc pode ser dividido num domnio coiled-coil e num domnio terminal C, de funo desconhecida. Um segmento transmembranar (TM) nico separa RodZn de RodZc. A eliminao de rodZ causa alongamento do nucleide e leva produo de clulas polares nucleadas. Aqui, mostramos que RodZn estruturado, estvel e em hlice . Descobrimos que as substituies Y32A e L33A na suposta hlice de reconhecimento (3) do motivo HTH, bem como as substituies Y49A e F53A, fora do motivo HTH (4), causam diviso assimtrica, mas apenas as ltimas levam deslocalizao sub-celular de RodZ. Sugerimos que as hlices 3 e 4 so utilizadas para uma interaco protena-protena ou protena- DNA essencial para diviso celular enquanto que 4 deve contactar um componente do citosqueleto, possivelmente MreB, uma vez que a correcta localizao sub-celular de RodZ depende desta protena. Em todos os mutantes as clulas polares so anucleadas, pelo que conclumos que o alongamento do nucleide no um prrequisito para diviso assimtrica. RodZc largamente no estruturado mas com contedo de folha , sendo estabilizado pelo domnio coiled-coil. Mostramos uma relao homloga entre RodZc e a bomba de transporte Na+/Ca2+ NCX1 e identificmos dois resduos no domnio C, G265 e N275, essenciais para a manuteno da forma celular. Estes resduos fazem parte de um motivo em gancho que pode actuar como um local de interaco com um ligando desconhecido. RodZn e RodZc so monomricos em soluo. Contudo, na membrana, RodZ interage consigo prpria num sistema de dois hbridos (Split-Ubiquitin) em levedura, sugerindo que possa formar multmeros in vivo.-----------ABSTRACT: RodZ is a transmembrane component of the bacterial core morphogenic apparatus. RodZ localizes in bands long the longitudinal axis of the cell, and it is though to functionally link the cell wall to the actin cytoskeleton. In Bacillus subtilis, RodZ consists of a cytoplasmic moiety, RodZn, and an extracytoplasmic moiety, RodZc. RodZn contains a predicted helix-turn-helix domain, whereas RodZc is thought to contain a coiled-coil region and a terminal C domain of unknown function. A single transmembrane domain separates RodZn from RodZc. Deletion of rodZ causes elongation of the nucleoid and leads to the production of polar minicells containing DNA. Here, we have studied the structure and function of RodZn and RodZc. We show that RodZn is a stable, folded, -helical domain. We discovered that the Y32A and L33A substitutions within the presumptive recognition helix (3) of the HTH motif, as well as the Y49A and F53A substitutions outside of the HTH motif (in 4) cause asymmetric cell division. However, only the substitutions in 4 cause sub-celular delocalization of RodZ. We suggest that 3 and 4 are used for a protein-protein or protein-DNA interaction important for cell division, whereas 4 is likely to contact a cytoskeletal component, presumably MreB. The polar cells formed by all the mutants are anucleate. We conclude that nucleoid elongation is not a prerequisite for asymmetric division. RodZc appears to be a largely unstructured domain, with some -sheet content, and is stabilized by the coiled-coil region. We show a homology relationship between RodZc and the NCX1 Na+/Ca2+ transporter and we found two residues within the C domain, G265 and N275, that are important for cell shape determination. These residues are predicted to be essential determinants of a claw-like motif, which may act as a binding site for an unknown ligand. Both the isolated RodZn and RodZc proteins are monomeric in solution. However, because full-length RodZ interacts with itself in a split-ubiquitin yeast two-hybrid assay, we suggest that it may dimerize or form higher order multimers in vivo.
Resumo:
Dissertao para obteno do Grau de Mestre em Engenharia Qumica e Bioqumica
Resumo:
A peritonite bacteriana espontnea ocorre em 30% dos cirrticos com ascite e, neste grupo, apresenta altas taxas de morbidade e mortalidade. Os fatores predisponentes incluem a diminuio da defesa imunolgica encontrada no homem nas fases avanadas da cirrose, o supercrescimento da flora intestinal e a translocação bacteriana da luz dos intestinos aos linfonodos mesentricos. As manifestaes clnicas variam de graves a leves ou ausentes, sendo sempre necessria a anlise do lquido asctico. O diagnstico de peritonite bacteriana espontnea se faz pela contagem de neutrfilos > 250/mm no lquido asctico associado ou no ao crescimento de bactria na cultura. As enterobactrias predominam como causa da infeco, sendo a Echerichia coli a bactria mais freqentemente isolada. O diagnstico precoce e o tratamento adequado provocaram a queda das taxas de mortalidade nas duas ltimas dcadas. O uso endovenoso de cefalosporinas de terceira gerao mostra-se eficaz em 70% a 95% dos casos. A recorrncia de peritonite bacteriana espontnea comum e pode ser prevenida com norfloxacina oral, de uso contnuo. O surgimento de resistncia bacteriana tem estimulado a procura de novas opes para a profilaxia da peritonite bacteriana espontnea; os probiticos constituem nova abordagem promissora, mas que necessita melhor avaliao. Recomenda-se a profilaxia primria de curta durao aos cirrticos com ascite que apresentem episdio de hemorragia digestiva alta.
Resumo:
A hemoterapia moderna baseia-se na utilizao correcta dos diversos componentes sanguneos, associados a um maior controle de qualidade do sangue, o que a torna mais segura e, actualmente, muitos doentes sao beneficiados pois, a transfuso de componentes sanguineos, em situaoes vrias, est na linha da frente na manuteno da vida e em casos extremos, o ltimo recurso que salva vidas. A qualidade e a segurana nas transfuses de sangue so grandes preocupaes da rea mdica, autoridades de sade e doente1. O sangue obtido pelos Centros de Sangue provem de dadores voluntrios, dotados de uma enorme sensibilidade social, que periodicamente assumem uma postura benevola e altruista e consequentemente mantm os bancos de sangue providos de um produto imprescindivel no tratamento de diversas patologias. O produto final disponvel concentrado de eritrcitos (CEs), plasma e concentrado plaquetrio tem de assumir um carcter seguro e vivel de modo a que os riscos para o doente sejam diminutos2. O controlo de qualidade aplicado a todo o sangue doado realiza provas de conformidade nas unidades com especificaes previamente definidas, sendo a hmolise um dos parmetros importantes na avaliao da qualidade dos concentrados de eritrcitos, pois, pode ocasionar implicaes clinicas para o receptor. Para alm disso a avaliao da concentrao de hemoglobina (Hg) no sangue doado mostra-se um controlo imprescindivel que salvaguarda a qualidade e segurana do componente a transfundir3;4.At se obter um CE h todo um processo moroso e de responsabilidade vital. Todo o sangue obtido passa por vrias etapas fundamentais at obteno do componente pretendido (analise, produo e armazenamento). Os CEs obtidos quando armazenados, num ambiente de refrigerao, tm uma vida til de 42 dias. Aps este perodo, o sangue deve ser inutilizado por se verificar alteraes bioqumicas, biomecnicas, e imunolgicas nos CEs e por consequncia a sua instabilidade vital no que ao tratamento de patologias, para as quais este componente est indicado, diz respeito5. Foi realizado um estudo experimental com o objetivo de avaliar a contribuio da Anexina V na apoptose celular nos concentrados de eritrcitos, constatando a degradao dos mesmos ao longo de todo o perodo de armazenamento e validar o paradigma que a cincia preconiza: Os CEs aps os 42 dias armazenados, em condies especficas (2 a 6 centgrados), so inviaveis para transfundir6;7. A avaliao dos nveis de apoptose por citometria de fluxo geralmente realizada por mtodos que utilizam Anexina V como marcador vital, que se associa aos resduos de fosfatidilserina, externalizados no incio do processo apopttico. A Anexina V uma protena humana endgena dependente do io Ca+2, amplamente distribuda intracelularmente em altas concentraes na placenta e em concentraes mais baixas nos eritrcitos, plaquetas e moncitos. Apresenta como principal caracterstica a capacidade de se ligar fosfatidilserina, um fosfolipdo presente na camada interna da bicamada lipdica, que durante a apoptose celular translocada para a camada externa da membrana celular. A determinao da Anexina V normalmente utilizada para verificar se as clulas so viveis, apoptticas ou necrticas por meio de diferenas na integridade da membrana plasmtica. Assim, ao conjugar a Anexina V ao FITC (Isotiocianato de fluorescena) possvel identificar e quantificar as clulas apoptticas por citometria de fluxo7. Numa amostra de 15 CEs, a qual foi induzida a hemlise, verificou-se, por citometria de fluxo, que a viabilidade deste componente se desvanesce ao longo do tempo, confirmando assim que o tratamento, manuseamento e armazenamento do sangue compromete a vitalidade terapeutica deste insubstituivel produto vital.
Resumo:
Uma caraterstica comum a muitas doenas neurodegenerativas a formao de agregados proteicos e amilides, no que se designa a cascata amilode. O foco deste trabalho o estudo do homodmero S100A9 e do heterodmero S100A8/A9, duas das protenas da resposta neuroinflamatria, que se encontram elevadas na vizinhana de depsitos proteicos, nomeadamente na doena de Alzheimer. Estas protenas pertencem famlia das S100, que possuem dois domnios EF-hand de ligao a Ca2+, e ligam tambm cobre e zinco. Este estudo visa contribuir esclarecer se as protenas S100A8 e A100A9 estaro envolvidas na cascata de agregao amilide, por formao direta de agregados das S100, ou mediante a associao com ies metlicos, cuja disfuno caracterstica em doenas neurodegenerativas. O primeiro passo do trabalho consistiu em expressar e purificar a S100A9 e a S100A8/A9, optimizando o processo. Os estudos de estabilidade trmica na presena e ausncia de Ca2+, Cu2+ e Zn2+, revelaram que a S100A8/A9 termodinamicamente mais estvel que a S100A9. Os trs ies metlicos so destabilizadores da S100A9, diminuindo a sua estabilidade trmica. Para a estabilidade trmica da S100A8/A9 os mesmos ies no mostraram ter um efeito significativo, pelo que se sugere uma conformao diferente com o core hidrofbico mais blindado, aumentando a estabilidade. Realizaram-se tambm ensaios cinticos de agregao, que revelram que a S100A9 apresenta uma agregao heterognea, no dependente de nucleao na presena dos metais. No caso da S100A8/A9, os trs ies metlicos potenciam a agregao. Por fim, analisou-se a hiptese de S100A9 e S100A8/A9 como moduladores de agregao do pptido A1-42. O A1-42 mostrou ter influncia na agregao da S100A9 e da S100A8/A9, podendo estas protenas ser potenciadoras da agregao. Este trabalho revelou que a agregao das protenas em estudo influenciada e potenciada pela ligao dos ies metlicos, pelo que se sugere que estes tenham um papel crucial na formao de agregados de S100A8/A9 e de S100A9.
Resumo:
The weak fixation of biomaterials within the bone structure is one of the major reasons of implants failures. Calcium phosphate (CaP) coatings are used in bone tissue engineering to improve implant osseointegration by enhancing cellular adhesion, proliferation and differentiation, leading to a tight and stable junction between implant and host bone. It has also been observed that materials compatible with bone tissue either have a CaP coating or develop such a calcified surface upon implantation. Thus, the development of bioactive coatings becomes essential for further improvement of integration with the surrounding tissue. However, most of current applied CaP coatings methods (e.g. physical vapor deposition), cannot be applied to complex shapes and porous implants, provide poor structural control over the coating and prevent incorporation of bioactive organic compounds (e.g. antibiotics, growth factors) because of the used harsh processing conditions. Layer-by-layer (LbL) is a versatile technology that permits the building-up of multilayered polyelectrolyte films in mild conditions based on the alternate adsorption of cationic and anionic elements that can integrate bioactive compounds. As it is recognized in nature s biomineralization process the presence of an organic template to induce mineral deposition, this work investigate a ion based biomimetic method where all the process is based on LbL methodology made of weak natural-origin polyelectrolytes. A nanostructured multilayer component, with 5 or 10 bilayers, was produced initially using chitosan and chondroitin sulphate polyelectrolyte biopolymers, which possess similarities with the extracellular matrix and good biocompatibility. The multilayers are then rinsed with a sequential passing of solutions containing Ca2+ and PO43- ions. The formation of CaP over the polyelectrolyte multilayers was confirmed by QCM-D, SEM and EDX. The outcomes show that 10 polyelectrolyte bilayer condition behaved as a better site for initiating the formation of CaP as the precipitation occur at earlier stages than in 5 polyelectrolyte bilayers one. This denotes that higher number of bilayers could hold the CaP crystals more efficiently. This work achieved uniform coatings that can be applied to any surface with access to the liquid media in a low-temperature method, which potentiates the manufacture of effective bioactive biomaterials with great potential in orthopedic applications.
Resumo:
Foi enfocada a contribuição de nutrientes da água escorrida pelo caule (CE), na ciclagem hidroquímica em floresta primária explorada, em Benevides, PA. A concentração de nutrientes na CE foi avaliada de dezembro de 1993 a abril de 1995, mediante coletores tipo colarinho, construídos com espuma de silicone, acoplados por tubos a recipientes plásticos. O monitoramento de CE se restringiu a doze árvores, nas quais foram coletadas mensalmente amostras para análise química de K+, Na+, Ca2+ e Mg2+ por espectrofotometria de absorção atômica, o N-NH4+, N-NO3 - e P-PO4 3- por colorimetria, em espectofotômetro de fluxo contínuo, o N-total por micro Kjeldahl e pH por potenciometria. A quantidade de nutrientes trazidos pela CE foi maior no início da época chuvosa, exibindo marcante variabilidade temporal para K+, Na+, Ca2+, Mg2+, N-total, SO4 2-, enquanto que o oposto aconteceu com PO4 3-. A magnitude na concentração dos nutrientes decresceu na seguinte ordem: K+ > Na+ > Ca2+ > N-t > SO4 2- > Mg2+ > PO4 3-. A distribuição e a intensidade de chuva não influenciam marcantemente o pH na CE.
Resumo:
O rio Puraquequara, e seu afluente direito, o igarap gua Branca, localizam-se fora da zona urbana de Manaus e esto com a bacia ainda protegida por floresta primria. Tm caractersticas geolgicas, pedolgicas e climatolgicas de igaraps naturais de terra-firme da Amaznia Central. Foram coletadas amostras de gua nos meses de novembro de 1998 (perodo seco) e abril de 1999 (perodo chuvoso) e determinados os parmetros temperatura, pH, turbidez, condutividade, alcalinidade, dureza, DQO, Ca2+, Mg2+, Na+, K+, SiO2, NO3-, NO2-, PO4(3-), SO4(2-), Cl-, NH4+ e Fe total. As guas apresentaram pH entre 3,8 e 4,1 passando a menos cidas na estiagem. A alcalinidade e a turbidez so, em geral, mais elevadas na estiagem, enquanto a condutividade, dureza e DQO so maiores no perodo mais chuvoso. SiO2 e o Cl- foram os nions mais abundantes, com contribuio maior do primeiro no Puraquequara e menor no gua Branca, enquanto o Cl- tem comportamento oposto. Na+, Fe total e NH4+ so os ctions mais abundantes e predominam, no geral, no perodo mais seco. O NH4+ o nico ction que tende a aumentar sua contribuio para jusante do igarap no perodo mido. Os teores de K+ so mais elevados do que os de Mg2+ e este que os de Ca2+, e so todos superados pelo Na+. Os teores da NH4+ e NO3-, acima de 0,2 mg/L e 0,5 mg/L, respectivamente, so indcios de contaminao. Essas caractersticas definem as guas da bacia como muito diludas, com predominncia dos nions sobre os ctions e correlacionveis as guas de cor preta.
