The role of mechanistic target of rapamycin (mTOR) pathway and synaptic protein GABAA-R in cortical GABAergic cell connectivity

Quelque 30 % de la population neuronale du cortex mammalien est composée d’une population très hétérogène d’interneurones GABAergiques. Ces interneurones diffèrent quant à leur morphologie, leur expression génique, leurs propriétés électrophysiologiques et leurs cibles subcellulaires, formant une riche diversité. Après leur naissance dans les éminences ganglioniques, ces cellules migrent vers les différentes couches corticales. Les interneurones GABAergiques corticaux exprimant la parvalbumin (PV), lesquels constituent le sous-type majeur des interneurones GABAergiques, ciblent spécifiquement le soma et les dendrites proximales des neurones principaux et des neurones PV+. Ces interneurones sont nommés cellules à panier (Basket Cells –BCs) en raison de la complexité morphologique de leur axone. La maturation de la connectivité distincte des BCs PV+, caractérisée par une augmentation de la complexité de l’axone et de la densité synaptique, se déroule graduellement chez la souris juvénile. Des travaux précédents ont commencé à élucider les mécanismes contrôlant ce processus de maturation, identifiant des facteurs génétiques, l’activité neuronale ainsi que l’expérience sensorielle. Cette augmentation marquante de la complexité axonale et de la synaptogénèse durant cette phase de maturation suggère la nécessité d’une synthèse de protéines élevée. La voie de signalisation de la cible mécanistique de la rapamycine (Mechanistic Target Of Rapamycin -mTOR) a été impliquée dans le contrôle de plusieurs aspects neurodéveloppementaux en régulant la synthèse de protéines. Des mutations des régulateurs Tsc1 et Tsc2 du complexe mTOR1 causent la sclérose tubéreuse (TSC) chez l’humain. La majorité des patients TSC développent des problèmes neurologiques incluant des crises épileptiques, des retards mentaux et l’autisme. D’études récentes ont investigué le rôle de la dérégulation de la voie de signalisation de mTOR dans les neurones corticaux excitateurs. Toutefois, son rôle dans le développement des interneurones GABAergiques corticaux et la contribution spécifique de ces interneurones GABAergiques altérés dans les manifestations de la maladie demeurent largement inconnus. Ici, nous avons investigué si et comment l’ablation du gène Tsc1 perturbe le développement de la connectivité GABAergique, autant in vitro que in vivo. Pour investiguer le rôle de l’activation de mTORC1 dans le développement d’une BC unique, nous avons délété le gène Tsc1 en transfectant CRE-GFP dirigé par un promoteur spécifique aux BCs dans des cultures organotypiques provenant de souris Tsc1lox. Le knockdown in vitro de Tsc1 a causé une augmentation précoce de la densité des boutons et des embranchements terminaux formés par les BCs mutantes, augmentation renversée par le traitement à la rapamycine. Ces données suggèrent que l’hyperactivation de la voie de signalisation de mTOR affecte le rythme de la maturation des synapses des BCs. Pour investiguer le rôle de mTORC1 dans les interneurones GABAergiques in vivo, nous avons croisé les souris Tsc1lox avec les souris Nkx2.1-Cre et PV-Cre. À P18, les souris Tg(Nkx2.1-Cre);Tsc1flox/flox ont montré une hyperactivation de mTORC1 et une hypertrophie somatique des BCs de même qu’une augmentation de l’expression de PV dans la région périsomatique des neurones pyramidaux. Au contraire, à P45 nous avons découvert une réduction de la densité des punctas périsomatiques PV-gephyrin (un marqueur post-synaptique GABAergique). L’étude de la morphologie des BCs en cultures organotypiques provenant du knock-out conditionnel Nkx2.1-Cre a confirmé l’augmentation initiale du rythme de maturation, lequel s’effondre ensuite aux étapes développementales tardives. De plus, les souris Tg(Nkx2.1Cre);Tsc1flox/flox montrent des déficits dans la mémoire de travail et le comportement social et ce d’une façon dose-dépendante. En somme, ces résultats suggèrent que l’activation contrôlée de mTOR régule le déroulement de la maturation et la maintenance des synapses des BCs. Des dysfonctions de la neurotransmission GABAergique ont été impliquées dans des maladies telles que l’épilepsie et chez certains patients, elles sont associées avec des mutations du récepteur GABAA. De quelle façon ces mutations affectent le processus de maturation des BCs demeuret toutefois inconnu. Pour adresser cette question, nous avons utilisé la stratégie Cre-lox pour déléter le gène GABRA1, codant pour la sous-unité alpha-1 du récepteur GABAA dans une unique BC en culture organotypique. La perte de GABRA1 réduit l’étendue du champ d’innervation des BCs, suggérant que des variations dans les entrées inhibitrices en raison de l’absence de la sous-unité GABAAR α1 peuvent affecter le développement des BCs. La surexpression des sous-unités GABAAR α1 contenant des mutations identifiées chez des patients épileptiques ont montré des effets similaires en termes d’étendue du champ d’innervation des BCs. Pour approfondir, nous avons investigué les effets de ces mutations identifiées chez l’humain dans le développement des épines des neurones pyramidaux, lesquelles sont l’endroit privilégié pour la formation des synapses excitatrices. Somme toute, ces données montrent pour la première fois que différentes mutations de GABRA1 associées à des syndromes épileptiques peuvent affecter les épines dendritiques et la formation des boutons GABAergiques d’une façon mutation-spécifique.

Les mécanismes sous-jacents aux effets pathologiques cardiaques de l’angiotensine II dans le remodelage électrique et contractile entre les sexes

L’insuffisance cardiaque (IC) est associée à un taux de mortalité et d’hospitalisations élevé causant un fardeau économique important. Les deux causes majeures de décès de l’IC sont les arythmies ventriculaires létales et les sidérations myocardiques. Il est maintenant reconnu que l’angiotensine II (ANGII) est l'un des principaux médiateurs de l’IC. Ses effets délétères découlent de l’activation du récepteur de type 1 de l’ANGII (AT1) et entraînent le développement d’hypertrophie. Toutefois, son rôle dans la genèse d’arythmies demeure incompris. De ce fait, l'étude des mécanismes électriques et contractiles sous-jacents aux effets pathologiques de l’ANGII s’avère essentielle afin de mieux comprendre et soigner cette pathologie. Il est souvent perçu que les femmes sont protégées envers les maladies cardiovasculaires. Cependant, le nombre total de femmes décédant d’IC est plus grand que le nombre d’hommes. Également, l’impact des facteurs de risque diffère entre chaque sexe. Ces différences existent, mais les mécanismes sous-jacents sont encore peu connus. De plus, les femmes reçoivent fréquemment un diagnostic ou un traitement inapproprié en raison d’un manque d’information sur les différences entre les sexes dans la manifestation d’une pathologie. Ce manque de données peut découler du fait que les sujets de sexe féminin sont souvent sous-représentés dans les essais cliniques ou la recherche fondamentale ce qui a grandement limité l’avancement de nos connaissances sur ~50 % de la population. Ainsi, il semble plus que nécessaire d’approfondir notre compréhension des différences entre les sexes, notamment dans la progression de l’IC. L’utilisation d’un modèle de souris transgénique surexprimant le récepteur AT1 (souris AT1R) a permis d’étudier les changements électriques, structurels et contractiles avant et après le développement d’hypertrophie. Premièrement, chez les souris AT1R mâles, un ralentissement de la conduction ventriculaire a été observé indépendamment de l’hypertrophie. Ce résultat était expliqué par une réduction de la densité du courant Na+, mais pas de l’expression du canal. Ensuite, le rôle des protéines kinases C (PKC) dans la régulation du canal Na+ par l’ANGII a été exploré. Les évidences ont suggéré que la PKCα était responsable de la modulation de la diminution du courant Na+ chez les souris AT1R mâles et dans les cardiomyocytes humains dérivés de cellules souches induites pluripotentes (hiPSC-CM) en réponse à un traitement chronique à l’ANGII. Ensuite, les différences entre les sexes ont été comparées chez la souris AT1R. Une plus grande mortalité a été constatée chez les femelles AT1R suggérant qu’elles sont plus sensibles à la surexpression de AT1R. Le remodelage électrique ventriculaire a donc été comparé entre les souris AT1R des deux sexes. Les courants ioniques étaient altérés de façon similaire entre les sexes excluant ainsi leur implication dans la mortalité plus élevée chez les femelles. Ensuite, l’homéostasie calcique et la fonction cardiaque ont été étudiées. Il a été démontré que les femelles développaient une hypertrophie et une dilatation ventriculaire plus sévère que les mâles. De plus, les femelles AT1R avaient de petits transitoires calciques, une extrusion du Ca2+ plus lente ainsi qu’une augmentation de la fréquence des étincelles Ca2+ pouvant participer à des troubles contractiles et à la venue de post-dépolarisations précoces. En conclusion, l’ANGII est impliquée dans le remodelage électrique, structurel et calcique associé à l'émergence de l’IC. De surcroît, ces altérations affectent plus sévèrement les femelles soulignant la présence de différences entre les sexes dans le développement de l’IC.

The role of mechanistic target of rapamycin (mTOR) pathway and synaptic protein GABAA-R in cortical GABAergic cell connectivity

Quelque 30 % de la population neuronale du cortex mammalien est composée d’une population très hétérogène d’interneurones GABAergiques. Ces interneurones diffèrent quant à leur morphologie, leur expression génique, leurs propriétés électrophysiologiques et leurs cibles subcellulaires, formant une riche diversité. Après leur naissance dans les éminences ganglioniques, ces cellules migrent vers les différentes couches corticales. Les interneurones GABAergiques corticaux exprimant la parvalbumin (PV), lesquels constituent le sous-type majeur des interneurones GABAergiques, ciblent spécifiquement le soma et les dendrites proximales des neurones principaux et des neurones PV+. Ces interneurones sont nommés cellules à panier (Basket Cells –BCs) en raison de la complexité morphologique de leur axone. La maturation de la connectivité distincte des BCs PV+, caractérisée par une augmentation de la complexité de l’axone et de la densité synaptique, se déroule graduellement chez la souris juvénile. Des travaux précédents ont commencé à élucider les mécanismes contrôlant ce processus de maturation, identifiant des facteurs génétiques, l’activité neuronale ainsi que l’expérience sensorielle. Cette augmentation marquante de la complexité axonale et de la synaptogénèse durant cette phase de maturation suggère la nécessité d’une synthèse de protéines élevée. La voie de signalisation de la cible mécanistique de la rapamycine (Mechanistic Target Of Rapamycin -mTOR) a été impliquée dans le contrôle de plusieurs aspects neurodéveloppementaux en régulant la synthèse de protéines. Des mutations des régulateurs Tsc1 et Tsc2 du complexe mTOR1 causent la sclérose tubéreuse (TSC) chez l’humain. La majorité des patients TSC développent des problèmes neurologiques incluant des crises épileptiques, des retards mentaux et l’autisme. D’études récentes ont investigué le rôle de la dérégulation de la voie de signalisation de mTOR dans les neurones corticaux excitateurs. Toutefois, son rôle dans le développement des interneurones GABAergiques corticaux et la contribution spécifique de ces interneurones GABAergiques altérés dans les manifestations de la maladie demeurent largement inconnus. Ici, nous avons investigué si et comment l’ablation du gène Tsc1 perturbe le développement de la connectivité GABAergique, autant in vitro que in vivo. Pour investiguer le rôle de l’activation de mTORC1 dans le développement d’une BC unique, nous avons délété le gène Tsc1 en transfectant CRE-GFP dirigé par un promoteur spécifique aux BCs dans des cultures organotypiques provenant de souris Tsc1lox. Le knockdown in vitro de Tsc1 a causé une augmentation précoce de la densité des boutons et des embranchements terminaux formés par les BCs mutantes, augmentation renversée par le traitement à la rapamycine. Ces données suggèrent que l’hyperactivation de la voie de signalisation de mTOR affecte le rythme de la maturation des synapses des BCs. Pour investiguer le rôle de mTORC1 dans les interneurones GABAergiques in vivo, nous avons croisé les souris Tsc1lox avec les souris Nkx2.1-Cre et PV-Cre. À P18, les souris Tg(Nkx2.1-Cre);Tsc1flox/flox ont montré une hyperactivation de mTORC1 et une hypertrophie somatique des BCs de même qu’une augmentation de l’expression de PV dans la région périsomatique des neurones pyramidaux. Au contraire, à P45 nous avons découvert une réduction de la densité des punctas périsomatiques PV-gephyrin (un marqueur post-synaptique GABAergique). L’étude de la morphologie des BCs en cultures organotypiques provenant du knock-out conditionnel Nkx2.1-Cre a confirmé l’augmentation initiale du rythme de maturation, lequel s’effondre ensuite aux étapes développementales tardives. De plus, les souris Tg(Nkx2.1Cre);Tsc1flox/flox montrent des déficits dans la mémoire de travail et le comportement social et ce d’une façon dose-dépendante. En somme, ces résultats suggèrent que l’activation contrôlée de mTOR régule le déroulement de la maturation et la maintenance des synapses des BCs. Des dysfonctions de la neurotransmission GABAergique ont été impliquées dans des maladies telles que l’épilepsie et chez certains patients, elles sont associées avec des mutations du récepteur GABAA. De quelle façon ces mutations affectent le processus de maturation des BCs demeuret toutefois inconnu. Pour adresser cette question, nous avons utilisé la stratégie Cre-lox pour déléter le gène GABRA1, codant pour la sous-unité alpha-1 du récepteur GABAA dans une unique BC en culture organotypique. La perte de GABRA1 réduit l’étendue du champ d’innervation des BCs, suggérant que des variations dans les entrées inhibitrices en raison de l’absence de la sous-unité GABAAR α1 peuvent affecter le développement des BCs. La surexpression des sous-unités GABAAR α1 contenant des mutations identifiées chez des patients épileptiques ont montré des effets similaires en termes d’étendue du champ d’innervation des BCs. Pour approfondir, nous avons investigué les effets de ces mutations identifiées chez l’humain dans le développement des épines des neurones pyramidaux, lesquelles sont l’endroit privilégié pour la formation des synapses excitatrices. Somme toute, ces données montrent pour la première fois que différentes mutations de GABRA1 associées à des syndromes épileptiques peuvent affecter les épines dendritiques et la formation des boutons GABAergiques d’une façon mutation-spécifique.

Adherence of Plasmodium falciparum infected erythrocytes to CHO-745 cells and inhibition of binding by protein A in the presence of human serum

Adhesion of erythrocytes infected with the malaria parasite Plasmodium falciparum to human host receptors is a process associated with severe malarial pathology. A number of in vitro cell lines are available as models for these adhesive processes, including Chinese hamster ovary (CHO) cells which express the placental adhesion receptor chondroitin-4-sulphate (CSA) on their surface. CHO-745 cells, a glycosaminoglycan-negative mutant CHO cell line lacking CSA and other reported P. falciparum adhesion receptors, are often used for recombinant expression of host receptors and for receptor binding studies. In this study we show that P. falciparum-infected erythrocytes can be easily selected for adhesion to an endogenous receptor on the surface of CHO-745 cells, bringing into question the validity of using these cells as a tool for P. falciparum adhesin expression studies. The adhesive interaction between CHO-745 cells and parasitized erythrocytes described here is not mediated by the known P. falciparum adhesion receptors CSA, CD36, or ICAM-1. However, we found that CHO-745-selected parasitized erythrocytes bind normal human IgM and that adhesion to CHO-745 cells is inhibited by protein A in the presence of serum, but not in its absence, indicating a non-specific inhibitory effect. Thus, protein A, which has been used as an inhibitor for a recently described interaction between infected erythrocytes and the placenta, may not be an appropriate in vitro inhibitor for understanding in vivo adhesive interactions. (c) 2005 Australian Society for Parasitology Inc. Published by Elsevier Ltd. All rights reserved.

Nur77 regulates lipolysis in skeletal muscle cells - Evidence for cross-talk between the beta-adrenergic and an orphan nuclear hormone receptor pathway

Skeletal muscle is a major mass peripheral tissue that accounts for similar to 40% of total body weight and 50% of energy expenditure and is a primary site of glucose disposal and fatty acid oxidation. Consequently, muscle has a significant role in insulin sensitivity, obesity, and the blood-lipid profile. Excessive caloric intake is sensed by the brain and induces beta-adrenergic receptor (beta-AR)- mediated adaptive thermogenesis. beta-AR null mice develop severe obesity on a high fat diet. However, the target gene(s), target tissues(s), and molecular mechanism involved remain obscure. We observed that 30 - 60 min of beta-AR agonist ( isoprenaline) treatment of C2C12 skeletal muscle cells strikingly activated (> 100-fold) the expression of the mRNA encoding the nuclear hormone receptor, Nur77. In contrast, the expression of other nuclear receptors that regulate lipid and carbohydrate metabolism was not induced. Stable transfection of Nur77-specific small interfering RNAs (siNur77) into skeletal muscle cells repressed endogenous Nur77 mRNA expression. Moreover, we observed attenuation of gene and protein expression associated with the regulation of energy expenditure and lipid homeostasis, for example AMP-activated protein kinase gamma 3, UCP3, CD36,adiponectin receptor 2, GLUT4, and caveolin-3. Attenuation of Nur77 expression resulted in decreased lipolysis. Finally, in concordance with the cell culture model, injection and electrotransfer of siNur77 into mouse tibialis cranialis muscle resulted in the repression of UCP3 mRNA expression. This study demonstrates regulatory cross-talk between the nuclear hormone receptor and beta-AR signaling pathways. Moreover, it suggests Nur77 modulates the expression of genes that are key regulators of skeletal muscle lipid and energy homeostasis. In conclusion, we speculate that Nur77 agonists would stimulate lipolysis and increase energy expenditure in skeletal muscle and suggest selective activators of Nur77 may have therapeutic utility in the treatment of obesity.

Rev-erb beta regulates the expression of genes involved in lipid absorption in skeletal muscle cells - Evidence for cross-talk between orphan nuclear receptors and myokines

Rev-erbbeta is an orphan nuclear receptor that selectively blocks trans-activation mediated by the retinoic acid-related orphan receptor-alpha (RORalpha). RORalpha has been implicated in the regulation of high density lipoprotein cholesterol, lipid homeostasis, and inflammation. Rev-erbbeta and RORalpha are expressed in similar tissues, including skeletal muscle; however, the pathophysiological function of Rev-erbbeta has remained obscure. We hypothesize from the similar expression patterns, target genes, and overlapping cognate sequences of these nuclear receptors that Rev-erbbeta regulates lipid metabolism in skeletal muscle. This lean tissue accounts for > 30% of total body weight and 50% of energy expenditure. Moreover, this metabolically demanding tissue is a primary site of glucose disposal, fatty acid oxidation, and cholesterol efflux. Consequently, muscle has a significant role in insulin sensitivity, obesity, and the blood-lipid profile. We utilize ectopic expression in skeletal muscle cells to understand the regulatory role of Rev-erbbeta in this major mass peripheral tissue. Exogenous expression of a dominant negative version of mouse Rev-erbbeta decreases the expression of many genes involved in fatty acid/lipid absorption (including Cd36, and Fabp-3 and -4). Interestingly, we observed a robust induction (> 15-fold) in mRNA expression of interleukin-6, an exercise-induced myokine that regulates energy expenditure and inflammation. Furthermore, we observed the dramatic repression (> 20- fold) of myostatin mRNA, another myokine that is a negative regulator of muscle hypertrophy and hyperplasia that impacts on body fat accumulation. This study implicates Rev-erbbeta in the control of lipid and energy homoeostasis in skeletal muscle. In conclusion, we speculate that selective modulators of Rev-erbbeta may have therapeutic utility in the treatment of dyslipidemia and regulation of muscle growth.

Oxidation of protein in human low-density lipoprotein exposed to peroxyl radicals facilitates uptake by monocytes; protection by antioxidants in vitro

Generation of neoepitopes on apolipoprotein B within oxidised low-density lipoprotein (LDL) is important in the unregulated uptake of LDL by monocytic scavenger receptors (CD36, SR-AI, LOX-1). Freshly isolated LDL was oxidised by peroxyl radicals generated from the thermal decomposition of an aqueous azo-compound. We describe that formation of carbonyl groups on the protein component is early as protein oxidation was seen after 90min. This is associated with an increased propensity for LDL uptake by U937 monocytes. Three classes of antioxidants (quercetin, dehydroepiandrosterone (DHEA) and ascorbic acid) have been examined for their capacity to inhibit AAPH-induced protein oxidation, (protein carbonyls, Δ electrophoretic mobility and LDL uptake by U937 monocytes). CD36 expression was assessed by flow cytometry and was seen to be unaltered by oxidised LDL uptake. All three classes were effective antioxidants, quercetin (P<0.01), ascorbic acid (P<0.01), DHEA (P<0.05). As LDL protein is the control point for LDL metabolism, the degree of oxidation and protection by antioxidants is likely to be of great importance for (patho)-physiological uptake of LDL by monocytes. © 2003 Elsevier B.V. All rights reserved.

Palmitate induces insulin resistance and a pro-atherogenic phenotype in monocytes

The present study investigated the effect of the two most abundant FFA in plasma – palmitate and oleate – on insulin sensitivity and vascular function (monocyte phenotype and adhesion to endothelium) using in vitro cell culture models and Wistar rats. Palmitate at 300µM for 6h induced insulin resistance in THP-1 monocytes and L6 monocytes. The ceramide synthesis pathway partly accounted for the palmitate-induced insulin resistance in THP-1 monocytes but not for L6 myotubes. Oleate treatment did not induce insulin resistance in either cell type and co-incubation with oleate protected cells from palmitate-induced insulin resistance. Palmitate at 300µN for 24h significantly increased cell surface CD11b and CD36 expression in U937 monocytes. The increase in CD11b and CD36 expression was effectively inhibited by Fumonisin B1, an inhibitor of ceramide synthesis. Oleate treatment did not show any effect on CD11b and CD36 expression and co-incubation with oleate antagonised the effect of palmitate on CD11b and CD36 expression in U937 monocytes. The increase in CD11b expression did not affect U937 monocyte adhesion to ICAM-1. Treating Wistar rats with palmitate for 6h caused a transient delay in glucose disposal and an increase in adhesion of U937 monocytes to the aortic endothelium, particularly at bifurcations. In conclusion, the present study demonstrates that the saturated free fatty acid palmitate induces insulin resistance and a pro-atherogenic phenotype for monocytes, whereas the unsaturated free fatty acid oleate does not. In vivo studies also confirmed that palmitate induces insulin resistance and an increase in monocyte adhesion to aorta.

Phospholipid chlorohydrin induces leukocyte adhesion to Apoe(-/-) mouse arteries via upregulation of P-selectin

HOCl-modified low-density lipoprotein (LDL) has proinflammatory effects, including induction of inflammatory cytokine production, leukocyte adhesion, and ROS generation, but the components responsible for these effects are not completely understood. HOCl and the myeloperoxidase-H2O2-halide system can modify both protein and lipid moieties of LDL and react with unsaturated phospholipids to form chlorohydrins. We investigated the proinflammatory effects of 1-stearoyl-2-oleoyl-sn-3-glycerophosphocholine (SOPC) chlorohydrin on artery segments and spleen-derived leukocytes from ApoE-/- and C57 Bl/6 mice. Treatment of ApoE-/- artery segments with SOPC chlorohydrin, but not unmodified SOPC, caused increased leukocyte-arterial adhesion in a time- and concentration-dependent manner. This could be prevented by pretreatment of the artery with P-selectin or ICAM-1-blocking antibodies, but not anti-VCAM-1 antibody, and immunohistochemistry showed that P-selectin expression was upregulated. However, chlorohydrin treatment of leukocytes did not increase expression of adhesion molecules LFA-1 or PSGL-1, but caused increased release of ROS from PMA-stimulated leukocytes by a CD36-dependent mechanism. The SOPC chlorohydrin-induced adhesion and ROS generation could be abrogated by pretreatment of the ApoE-/- mice with pravastatin or a nitrated derivative, NCX 6550. These findings suggest that phospholipid chlorohydrins formed in HOCl-treated LDL could contribute to the proinflammatory effects observed for this modified lipoprotein in vitro.

Palmitate promotes monocyte atherogenicity via de novo ceramide synthesis

Elevated plasma free fatty acids (FAs) are associated with increased risk of cardiovascular disease. This study investigates the effects of the saturated FA palmitate and unsaturated FA oleate on monocyte phenotype and function. Incubation of human U937 and THP-1 monocytes with palmitate for 24h increased cell surface expression of integrin CD11b and scavenger receptor CD36 in a concentration-dependent manner with some decrease in mitochondrial reducing capacity at high concentration (300µM). Monocytes incubated with palmitate, but not oleate, showed increased uptake of oxidized LDL and increased adhesion to rat aortic endothelium, particularly at bifurcations. The palmitate-induced increase in CD11b and CD36 expression was associated with increased cellular C16 ceramide and sphingomyelin, loss of reduced glutathione, and increased reactive oxygen species (ROS). Increased monocyte surface CD11b and CD36 was inhibited by fumonisin B1, an inhibitor of de novo ceramide synthesis, but not by the superoxide dismutase mimetic MnTBap. In contrast, MnTBap prevented the mitochondrial ROS increase and metabolic inhibition due to 300µM palmitate. This study demonstrates that in viable monocytes, palmitate but not oleate increases expression of surface CD11b and CD36. Palmitate increases monocyte adhesion to the aortic wall and promotes uptake of oxidized LDL and this involves de novo ceramide synthesis.

Fatty acids, monocytes and ageing

Elevated free fatty acids (FFA) are a feature of ageing and a risk factor for metabolic disorders such as cardiovascular disease (CVD) and type-2 diabetes (T2D). Elevated FFA contribute to insulin resistance, production of inflammatory cytokines and expression of adhesion molecules on immune cells and endothelial cells, risk factors for CVD and T2D. Molecular mechanisms of FFA effects on monocyte function and how FFA phenotype is affected by healthy ageing remain poorly understood. This thesis evaluated the effects of the two major FFA in plasma, oleate and palmitate on monocyte viability, cell surface antigen expression, and inflammatory activation in THP-1 monocytes. Palmitate but not oleate increased cell surface expression of CD11b and CD36 after 24h, independent of mitochondrial superoxide, but dependent on de novo synthesis of ceramides. LPS-mediated cytokine production in THP-1 monocytes was enhanced and decreased following incubation with palmitate and oleate respectively. In a model of monocyte-macrophage differentiation, palmitate induced a pro-inflammatory macrophage phenotype which required de novo ceramide synthesis, whilst oleate reduced cytokine secretion, producing a macrophage with enhanced clearance apoptotic cells. Plasma fatty acid analysis in young and mid-life populations revealed age-related increases in both the SFA and MUFA classes, especially the medium and very long chain C14 and C24 fatty acids, which were accompanied by increases in the estimated activities of desaturase enzymes. Changes were independently correlated with increased PBMC CD11b, plasma TNF-a and insulin resistance. In conclusion, the pro-atherogenic phenotype, enhanced LPS responses in monocytes, and pro-inflammatory macrophage in the presence of palmitate but not oleate is reliant upon de novo ceramide synthesis. Age-related increases in inflammation, cell surface integrin expression are related to increases in both the MUFA and SFA fatty acids, which in part may be explained by altered de novo fatty acid synthesis.

Macrophage polarisation by fatty acids is PPARgamma-dependent

Elevated plasma free fatty acids (FAs) are associated with increased risk of cardiovascular disease. We investigated the effects of the saturated FA palmitate and unsaturated FA oleate on monocyte phenotype and function. Palmitate increased cell surface expression of integrin CD11b and scavenger receptor CD36 in a concentration-dependent manner with some decrease in mitochondrial reducing capacity at high concentration (300µM). Monocytes incubated with palmitate, but not oleate, showed increased uptake of oxidized LDL and increased adhesion to rat aortic endothelium, particularly at bifurcations. The palmitate-induced increase in CD11b and CD36 expression was associated with increased cellular C16 ceramide and sphingomyelin, loss of reduced glutathione, and increased reactive oxygen species (ROS). Increased monocyte surface CD11b and CD36 was inhibited by fumonisin B1, an inhibitor of de novo ceramide synthesis, but not by the superoxide dismutase mimetic MnTBap. In contrast, MnTBap prevented the mitochondrial ROS increase and metabolic inhibition due to 300µM palmitate. This study demonstrates that in viable monocytes, palmitate but not oleate increases expression of surface CD11b and CD36. Palmitate increases monocyte adhesion to the aortic wall and promotes uptake of oxidized LDL and this involves de novo ceramide synthesis. We have also explored whether specific dietary fatty acids drive monocyte to macrophage polarisation via metabolic pathways. Here we show that monocytes pre-incubated with the saturated fatty acid palmitate increase production of inflammatory cytokines such as TNFa and IL-6 in response to a phorbol myristate differentiation trigger. This increases mitochondrial superoxide production, reduces dependency on oxidative phosphorylation through ceramide-dependent inhibition of PPARgamma activity and increases TNFa production, again via a mechanism that requires ceramide production.

Les mécanismes sous-jacents aux effets pathologiques cardiaques de l’angiotensine II dans le remodelage électrique et contractile entre les sexes

L’insuffisance cardiaque (IC) est associée à un taux de mortalité et d’hospitalisations élevé causant un fardeau économique important. Les deux causes majeures de décès de l’IC sont les arythmies ventriculaires létales et les sidérations myocardiques. Il est maintenant reconnu que l’angiotensine II (ANGII) est l'un des principaux médiateurs de l’IC. Ses effets délétères découlent de l’activation du récepteur de type 1 de l’ANGII (AT1) et entraînent le développement d’hypertrophie. Toutefois, son rôle dans la genèse d’arythmies demeure incompris. De ce fait, l'étude des mécanismes électriques et contractiles sous-jacents aux effets pathologiques de l’ANGII s’avère essentielle afin de mieux comprendre et soigner cette pathologie. Il est souvent perçu que les femmes sont protégées envers les maladies cardiovasculaires. Cependant, le nombre total de femmes décédant d’IC est plus grand que le nombre d’hommes. Également, l’impact des facteurs de risque diffère entre chaque sexe. Ces différences existent, mais les mécanismes sous-jacents sont encore peu connus. De plus, les femmes reçoivent fréquemment un diagnostic ou un traitement inapproprié en raison d’un manque d’information sur les différences entre les sexes dans la manifestation d’une pathologie. Ce manque de données peut découler du fait que les sujets de sexe féminin sont souvent sous-représentés dans les essais cliniques ou la recherche fondamentale ce qui a grandement limité l’avancement de nos connaissances sur ~50 % de la population. Ainsi, il semble plus que nécessaire d’approfondir notre compréhension des différences entre les sexes, notamment dans la progression de l’IC. L’utilisation d’un modèle de souris transgénique surexprimant le récepteur AT1 (souris AT1R) a permis d’étudier les changements électriques, structurels et contractiles avant et après le développement d’hypertrophie. Premièrement, chez les souris AT1R mâles, un ralentissement de la conduction ventriculaire a été observé indépendamment de l’hypertrophie. Ce résultat était expliqué par une réduction de la densité du courant Na+, mais pas de l’expression du canal. Ensuite, le rôle des protéines kinases C (PKC) dans la régulation du canal Na+ par l’ANGII a été exploré. Les évidences ont suggéré que la PKCα était responsable de la modulation de la diminution du courant Na+ chez les souris AT1R mâles et dans les cardiomyocytes humains dérivés de cellules souches induites pluripotentes (hiPSC-CM) en réponse à un traitement chronique à l’ANGII. Ensuite, les différences entre les sexes ont été comparées chez la souris AT1R. Une plus grande mortalité a été constatée chez les femelles AT1R suggérant qu’elles sont plus sensibles à la surexpression de AT1R. Le remodelage électrique ventriculaire a donc été comparé entre les souris AT1R des deux sexes. Les courants ioniques étaient altérés de façon similaire entre les sexes excluant ainsi leur implication dans la mortalité plus élevée chez les femelles. Ensuite, l’homéostasie calcique et la fonction cardiaque ont été étudiées. Il a été démontré que les femelles développaient une hypertrophie et une dilatation ventriculaire plus sévère que les mâles. De plus, les femelles AT1R avaient de petits transitoires calciques, une extrusion du Ca2+ plus lente ainsi qu’une augmentation de la fréquence des étincelles Ca2+ pouvant participer à des troubles contractiles et à la venue de post-dépolarisations précoces. En conclusion, l’ANGII est impliquée dans le remodelage électrique, structurel et calcique associé à l'émergence de l’IC. De surcroît, ces altérations affectent plus sévèrement les femelles soulignant la présence de différences entre les sexes dans le développement de l’IC.

Rôle des récepteurs aux protéines G (GPR55, GPR91 et GPR99) dans la croissance et le guidage axonal au cours du développement du système visuel

Lors de l’attribution du prix Nobel de chimie aux docteurs Robert Leftkowitz et Brian Kobika pour leurs travaux essentiels sur les récepteurs couplés à des protéines G (RCPGs), Sven Lindin, membre du comité Nobel, a affirmé que « jusqu'à la moitié » des médicaments « reposent sur une action ciblant les RCPG ». En raison de leurs rôles importants, leurs mécanismes d'activation et l’action de leurs ligands, les RCPG demeurent les cibles potentielles de la majorité des recherches pour le développement de nouveaux médicaments et de leurs applications cliniques. Dans cette optique, nous avons concentré nos recherches à travers cette thèse pour élucider les rôles, les mécanismes d’action et les effets des ligands de trois RCPG : GPR55; GPR91 et GPR99 au cours du développement des axones des cellules ganglionnaires de la rétine (CGRs). Les résultats de nos études confirment l’expression des récepteurs lors du développement embryonnaire, postnatal et adulte des CGRs ainsi qu’au cours de l’établissement de la voie rétinothalamique. In vitro, la modulation pharmacologique et génétique de l’activité de ces RCPGs réorganise la morphologie du cône de croissance des CGRs, celle des neurones corticaux et elle modifie la croissance axonale globale. De plus, les effets de la stimulation avec des ligands des ces trois RCPGs sur le guidage axonal varient d’aucun effet (GPR91 et GPR99) à la répulsion ou l’attraction (GPR55). La voie de signalisation MAPK-ERK1/2 joue un rôle essentiel dans la médiation des effets des ligands de ces récepteurs avec une implication de la voie de RhoA à hautes concentrations pour l’agoniste endogène de GPR55. In vivo, cette recherche démontre également l’implication de GPR55 dans les processus de sélection des cibles thalamiques et de raffinement au cours du développement du système nerveux visuel.

Conséquence du choc hypotonique sur le transport sodique des cellules épithéliales alvéolaires de type II

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