Inteins in pathogenic fungi: a phylogenetic tool and perspectives for therapeutic applications

Inteins or internal proteins are coding sequences that are transcribed and translated with flanking sequences (exteins). After translation, the inteins are excised by an autocatalytic process and the host protein assumes its normal conformation and develops its expected function. These parasitic genetic elements have been found in important, conserved proteins in all three domains of life. Most of the eukaryotic inteins are present in the fungi kingdom and the PRP8 intein is one of the most widespread inteins, occurring in important pathogens such as Cryptococcus neoformans (varieties grubii and neoformans), Cryptococcus gattii, Histoplasma capsulatum and Paracoccidioides brasiliensis. The knowledge of conserved and non-conserved domains in inteins have opened up new opportunities for the study of population variability in pathogenic fungi, including their phylogenetic relationships and recognition or diagnoses of species. Furthermore, inteins in pathogenic fungi should also be considered a promising therapeutic drug target, since once the autocatalytic splicing is inhibited, the host protein, which is typically vital, will not be able to perform its normal function and the fungal cell will not survive or reproduce.

The inhibitory effect of MK886 on the inflammatory process caused by Paracoccidioidomycosis brasiliensis infection in genetically selected mice

Leukotrienes are classic inflammatory response mediators considered chemotactic agents and microbicidal activity regulators in cells of the innate immune system, playing a protective role against different infectious agents. In this study, we investigated the involvement of leukotrienes in the course of murine paracoccidioidomycosis based on the following immunologic parameters: cell influx, mieloperoxydase activity, NO production, cytokine production, and fungal recovery in lungs of mice selected according to the intensity of their low (AIRmin) and high (AIRmax) acute inflammatory response. Infection by P. brasiliensis induced considerable production of IL-6, IL-10, IFN-gamma and TNF-alpha cytokines, and led to cell recruitment, as well as NO production in lungs at different study periods. In animals treated with MK886, a leukotriene biosynthesis inhibitor, IFN-gamma, IL-6 and TNF-alpha production was lower, while neutrophil influx and NO production decreased. These results may explain the higher fungal load in lungs of animals in which leukotriene synthesis was inhibited, suggesting that leukotrienes have a possible protective role in experimental paracoccidioidomycosis. AIRmax animals had lower fungal load in comparison with AIRmin ones, which can be related to the AIR phenotype regarding neutrophil migration, besides lower production of NO and pro-inflammatory cytokines. Thus, mice presenting AIRmax background are more resistant to infection by P. brasiliensis.

Cytokine production in experimental paracoccidioidomycosis of murine selected lineages for acute inflammatory response (air)

Paracoccidioidomycosis is a systemic human mycosis caused by Paracoccidioides brasiliensis (P. brasiliensis), an imperfect dimorphic fungus whose conidia are its infective form. Mice genetically selected for maximum (AIRmax) and minimum (AIRmin) acute inflammatory response were used as experimental paracoccidioidomycosis models. The animals were intraperitoneally inoculated with P. brasiliensis (strain 18) and killed 6, 12 and 24 hours or 3, 7 and 14 days after infection. In these periods, fragments from their spleen, liver and lung were removed for evaluation of the infection level by fungal cells, assessment of macrophagic activity by peritoneal and splenic macrophages - through the determination of nitric oxide (NO) concentrations and production of pro- and anti-inflammatory cytokines of lung and spleen homogenate supernatants. In the present study, it was observed that AIRmax lineages presented greater control of the infectious process than the AIRmin ones. Regarding NO production, AIRmax animals produced more metabolites in late periods, what may help control the infectious process. Concerning cytokine production, it was observed that the production of INF-gamma, TNF-alpha, IL-1, IL-6, IL-8 and IL-12 were increased in AIRmax lineages in most analyzed organs and periods, thus contributing to the greater resistance exhibited by such lineages against infection, except for IL-4 and IL-10 that showed decreased production in AIRmax lineage, reproducing its suppressive biological effect. From these results, it was observed that the AIRmax lineage was more effective in controlling the infectious process, with an important involvement of the analyzed cytokines. These findings are probably related to the genetically selected factors involved in the acute inflammatory response.

PRP8 intein in Ajellomycetaceae family pathogens: Sequence analysis, splicing evaluation and homing endonuclease activity

Fundação de Amparo à Pesquisa do Estado de São Paulo (FAPESP)

Oral Exfoliative Cytology for the Diagnosis of Paracoccidioidomycosis in a Patient with Human Immunodeficiency Virus A Case Report

BackgroundParacoccidioidomycosis is not the most common fungal disease in patients infected with human immunodeficiency virus (HIV), except for endemic regions in Latin America countriesCaseA 33-year-old man with HIV presented with mulberry-like lesions on the palate The diagnosis was made by exfoliative cytology and Papanicolaou staining Microscopic analysis revealed fungal structures with birefringent walls and exosporulation conferring an airplane radial motor appearance, or even bowel-like or goblet-like forms compatible with Paracoccidioides brasiliensisConclusionThis process spares the immunosuppressed patient from under going invasive biopsy procedures (Acta Cytol 2010,54 1127-1129)

Constituintes químicos de Hyptidendron canum (Pohl ex Benth.) R. Harley (Lamiaceae)

Chemical investigation of Hyptidendron canum stems resulted in the isolation of betulinic, ursolic and euscaphic acids. From the leaves were isolated 3β-O-β-galactopiranosilsitosterol, ursolic aldehyde, and mixtures of maslinic acid and 2α-hydroxyursolic acid, α and β-amyrin, uvaol and erythrodiol, sitosterol and stigmasterol, spathulenol and globulol. Hexane and chloroform leave fractions as well as ursolic and betulinic acids showed antifungal activities against the yeast form of Paracoccidioides brasiliensis.

Natural antibodies in paracoccidioidomycosis

Fundação de Amparo à Pesquisa do Estado de São Paulo (FAPESP)

Isolation of fungi from nature in the region of Botucatu, state of São Paulo, Brazil, an endemic area of paracoccidioidomycosis

In an attempt to isolate Paracoccidioides brasiliensis from nature 887 samples of soil from Botucatu, SP, Brazil, were collected cultured in brain heart infusion agar supplemented with dextrose, in potato dextrose agar and in yeast extract starch dextrose agar, all with antibiotics, at 25º and 37ºC. Five thermo-dependent dimorphic fungi morphologically resembling P. brasiliensis were isolated; two from armadillo holes; further studies of the biology, antigenicity and genetic features of the five dimorphic fungi are necessary to clarify their taxonomy and their possible relation to P. brasiliensis. In addition, 98 dematiaceous fungi and 581 different species of Aspergillus spp. were also isolated. Our findings emphasize that armadillos and their environment are associated with thermo-dimorphic fungi and confirm the ubiquity of pathogenic dematiaceous fungi and Aspergillus spp.

Paracoccidioidomicose: atualização epidemiológica, clínica e terapêutica

São apresentados dados de atualização epidemiológica, clínica, diagnóstica e terapêutica relativos à paracoccidioidomicose. Discute-se a importância epidemiológica resultante do isolamento do Paracoccidioides brasiliensis a partir do tatu (Dasypus novemcinctus) em regiões do Brasil e Colômbia, assim como dos resultados de inquéritos soroepidemiológicos em cães e do surgimento do primeiro caso de paracoccidioidomicose doença em cão. As dificuldades de isolamento do fungo a partir do solo são correlacionadas com novos informes de investigação epidemiológica. São apresentados aspectos clínicos das manifestações da forma aguda da doença, assim como das manifestações da neuroparacoccidioidomicose e da enfermidade associada à infecção pelo HIV. Discute-se o papel da sorologia e da técnica da PCR no diagnóstico e dos possíveis avanços no tratamento da paracoccidioidomicose com os novos derivados triazólicos.

Evaluation of different immunization protocols with P. brasiliensis antigens in Guinea pigs

O objetivo deste trabalho foi desenvolver protocolo eficiente e reprodutível de imunização em cobaias com antígenos de P. brasiliensis, visando a obtenção de modelo experimental para futuros estudos de mecanismos de proteção imunológica. Testaram-se três diferentes antígenos (particulado, solúvel e composto) e seis protocolos nos quais foram avaliadas as influências dos seguintes fatores: presença ou ausência de adjuvante completo de Freund, número de doses imunizantes e intervalo de tempo entre a última dose imunizante e o desafio. A eficiência do protocolo de imunização foi estudada pela avaliação da resposta imune celular e humoral anti-P. brasiliensis, utilizando teste cutâneo e teste de inibição da migração do macrófago, e imunodifusão, respectivamente. Observou-se que: 1. Três doses imunizantes de antígeno induziram melhor resposta do que duas doses; 2. Maior resposta imune foi conseguida com a utilização de adjuvante completo de Freund; 3. Animais desafiados depois de longo tempo (6 semanas) da última dose imunizante mostraram melhor resposta imune anti-P. brasiliensis; 4. Os antígenos solúvel e composto foram igualmente eficientes induzindo maior resposta imune humoral e celular anti-P. brasiliensis enquanto que o antígeno particulado provocou menor reatividade

Experimental paracoccidioidomycosis in hamster: transmission electron microscopy of inoculation site lesion

Estudou-se sequencialmente, à microscopia eletrônica de transmissão, a interação entre Paracoccidioides brasiliensis (Pb) e células inflamatórias em hamsters inoculados por via intratesticular. Seis horas após inoculações havia predominância de neutrófilos, estando presentes algumas células mononucleares e eosinófilos. Os neutrófilos foram progressivamente substituídos por células mononucleares. Fungos viáveis apresentavam-se fagocitados ou circunscritos por células inflamatórias, geralmente com ampla interface hospedeiro-parasita. Fungos mortos ou degenerados eram acompanhados de interfase estreita. A camada externa da parede do Pb era às vezes quebrada quando em contacto com neutrófilos, em vários pontos, sendo os fragmentos dessa parede descamados e fagocitados. Células fúngicas pequenas com um único núcleo se relacionavam com ampla interfase enquanto as células maiores e multinucleadas apresentavam paredes irregulares, por vezes, contendo lomasoma e/ou estrutura semelhante à mielina. Diferentes padrões de interação do Pb com células do hospedeiro podem ser decorrentes do a fluxo de células inflamatórias funcionalmente diferentes ao local de inoculação ou à idade dos fungos ou ambos os fatores.

Natural killer cell activity in experimental paracoccidioidomycosis of the Syrian hamster

Com o objetivo de avaliar a atividade de células natural killer na paracoccidioidomicose experimental do hamster, 80 hamsters foram infectados por via intratesticular com Paracoccidioides brasiliensis e sacrificados após 24h, 48h, 96h, 1, 2, 4, 8 e 11 semanas de infecção. Como controle foram avaliados 40 hamsters normais, não infectados. Os animais foram submetidos ao estudo da atividade citotóxica de células NK pela técnica de single-cell assay e da resposta imune humoral pelas técnicas de imunodifusão dupla e Elisa. A produção do fator inibidor da migração de macrófagos em presença de Phytohemaglutinina e antígeno de P. brasiliensis e a histopatologia das lesões foram estudadas após 1,4, 8e 11 semanas de infecção. Os animais infectados, quando comparados aos controles, apresentaram níveis de atividade NK significativamente elevados durante as 4 primeiras semanas de infecção, havendo diminuição dessa atividade a partir da 8ª semana. Foi observada correlação inversa entre atividade NK e níveis de anticorpos específicos e, associação entre diminuição da atividade NK, depressão de resposta imune celular e aumento da extensão das lesões histopatológicas. Os resultados sugerem que após ativação inicial, as células NK são incapazes de controlar a disseminação do fungo pelos tecidos. A depressão da atividade NK na fase tardia da infecção parece estar relacionada com os distúrbios imunorregulatórios associados à paracoccidioidomicose.

Paracoccidioidomycosis associated with acquired immunodificiency syndrome: report of seven cases

São apresentadas as características clínicas e evolutivas de sete pacientes (cinco masculinos e dois do sexo feminino), a maioria dos quais usuários de drogas ilícitas endovenosa, com paracoccidioidomicose associada à Síndrome da Imunodeficiência Adquirida (SIDA/AIDS). em quatro pacientes a paracoccidioidomicose comprometia os pulmões isoladamente, nos demais a doença era generalizada com envolvimento cutâneo. Apenas dois pacientes eram procedentes recentes da zona rural. O que nos faz presumir que nos demais a paracoccidioidomicose doença resultou da reativação de focos latentes da infecção. Dado o papel da imunidade medida por células na defesa do hospedeiro contra o Paracoccidioides brasiliensis, é de se prever crescente ocorrência da associação paracoccidioidomicose -SIDA/AIDS nas áreas endêmicas para ambas as enfermidades.

Virulence Factors IN Fungi of Systemic Mycoses

Fatores de virulência em fungos de micoses sistêmicaFungos patogênicos causadores de micoses sistêmicas possuem vários fatores que permitem seu crescimento nas condições adversas oferecidas pelo hospedeiro, propiciando o estabelecimento da relação parasitária e contribuindo no processo de doença. Esses fatores são conhecidos como fatores de virulência auxiliando no desenvolvimento da infecção e interferindo com a patogênese das micoses. O presente trabalho avalia os fatores de virulência em fungos patogênicos como Blastomyces dermatitidis, Coccidioides immitis, Cryptococcus neoformans, Histoplasma capsulatum e Paracoccidioides brasiliensis, em relação à termotolerância, dimorfismo, componentes da parede celular ou cápsula, bem como a produção de enzimas. Os fatores de virulência auxiliam na aderência, colonização, disseminação e habilidade do fungo para resistir a ambientes hostis e escapar dos mecanismos da resposta imune do hospedeiro.Tanto os fatores de virulência apresentados por diferentes fungos, como os mecanismos de defesa oferecidos pelo hospedeiro requerem ação e interação de processos complexos, cujo conhecimento permitirá a melhor compreensão da patogenia das micoses sistêmicas.

Differences in reactivity of paracoccidioidomycosis sera with gp43 isoforms

The glycoprotein gp43 from Paracoccidioides brasiliensis is the main antigenic component in paracoccidioidomycosis (PCM) because it is recognized by 100% of PCM patients. It has also been shown that different fungal strains produce gp43 with at least four isoform profiles. In this study, different isoform profiles from gp43, with pIs ranging from 5.8 to 8.5, were affinity purified from various P. brasiliensis (B-339, S.S., 1925 and I-9) exoantigens. Because of the isoform heterogeneity, we questioned whether those isoform profiles could be similarly recognized by acute or chronic PCM patients. By using a specific and sensitive method for detection of human IgG anti-gp43 antibodies, the monoclonal antibody capture immunoassay, we report that not all gp43 isoform profiles are equally recognized in PCM sera when anti-gp43 MAb 17c was employed as capturing antibody. Our result showed that recognition of pI 8.5 gp43 isoform was significantly lower for both acute (56%) and chronic patients (71%), compared with gp43 isoforms from the standard strain B-339. on the other hand, when anti-gp43 MAb 8a, which recognizes a different antigenic epitope was used to capture the different gp43 isoform profiles, all patient's sera reacted similarly. The results described suggest that not all the antigenic epitopes expressed by gp43 are equally present in all P. brasiliensis strains.