Identification et caractérisation de gènes chez Salmonella enterica sérovar Typhi impliqués dans l’interaction avec les macrophages humains.

Le genre bactérien Salmonella regroupe plus de 2500 sérovars, mais peu sont responsables de pathologies humaines. Salmonella enterica sérovar Typhi (S. Typhi) est reconnu pour son importance médicale à travers le globe. S. Typhi cause la fièvre typhoïde chez l’Homme, une maladie infectieuse létale caractérisée par la dissémination systémique de la bactérie vers des organes du système réticulo-endothélial. La fièvre typhoïde représente un fardeau pour la santé mondiale, notamment auprès des pays en développement où les conditions sanitaires sont désuètes. La situation se complique davantage par l’apparition de souches résistantes aux antibiotiques. De plus, les deux vaccins licenciés sont d’efficacité modérée, présentent certaines contraintes techniques et ne sont pas appropriés pour les jeunes enfants et nourrissons. La phase systémique de l’infection par Salmonella repose sur sa survie dans les macrophages du système immunitaire. Dans ce compartiment intracellulaire, la bactérie module les défenses antimicrobiennes grâce à de multiples facteurs de virulence encodés dans son génome. Les mécanismes moléculaires sollicités sont complexes et finement régulés. Malgré les progrès scientifiques réalisés précédemment, plusieurs incompréhensions persistent au sujet de l’adaptation de ce pathogène dans les macrophages de l’hôte. Pour mieux concevoir les déterminants génétiques de S. Typhi impliqués dans l’interaction avec ces cellules, une stratégie de sélection négative a été appliquée afin de vérifier systématiquement l’effet direct des gènes pendant l’infection. En premier temps, une librairie de mutants par transposon chez S. Typhi a été créée pour l’infection de macrophages humains en culture. Après 24 heures d’infection, la présence des mutants fut évaluée simultanément par analyse sur des biopuces de Salmonella. Au total, 130 gènes ont été sélectionnés pour leur contribution potentielle auprès des macrophages infectés. Ces gènes comptaient des composantes d’enveloppe bactérienne, des éléments fimbriaires, des portions du flagelle, des régulateurs, des facteurs de pathogenèse et plusieurs protéines sans fonction connue. En deuxième temps, cette collection de gènes a dirigé la création de 28 mutants de délétion définie chez S. Typhi. Les capacités d’entrée et de réplication intracellulaire de ces mutants au sein des macrophages humains ont été caractérisées. D’abord, les macrophages ont été co-infectés avec les mutants en présence de la souche sauvage, pour vérifier la compétitivité de chacun d’eux envers cette dernière. Ensuite, les mutants ont été inoculés individuellement chez les macrophages et leur infectivité fut mesurée comparativement à celle de la souche sauvage. Sommairement, 26 mutants ont présenté des défauts lorsqu’en compétition, tandis que 14 mutants se sont montrés défectueux lorsque testés seuls. Par ailleurs, 12 mutants ont exposé une déficience lors de l’infection mixte et individuelle, incluant les mutants acrA, exbDB, flhCD, fliC, gppA, mlc, pgtE, typA, waaQGP, STY1867-68, STY2346 et SPI-4. Notamment, 35 nouveaux phénotypes défectueux d’entrée ou de survie intracellulaire chez Salmonella ont été révélés par cette étude. Les données générées ici offrent plusieurs nouvelles pistes pour élucider comment S. Typhi manipule sa niche intracellulaire, menant à l’infection systémique. Les gènes décrits représentent des cibles potentielles pour atténuer la bactérie chez l’humain et pourraient contribuer au développement de meilleures souches vaccinales pour immuniser contre la fièvre typhoïde.

Carboxydothermus hydrogenoformans comme catalyseur biologique pour la conversion du monoxyde de carbone en hydrogène simultanément a la minéralisation de calcium et phosphate

La gazéification est aujourd'hui l'une des stratégies les plus prometteuses pour valoriser les déchets en énergie. Cette technologie thermo-chimique permet une réduction de 95 % de la masse des intrants et génère des cendres inertes ainsi que du gaz de synthèse (syngaz). Le syngaz est un combustible gazeux composé principalement de monoxyde de carbone (CO), d'hydrogène (H2) et de dioxyde de carbone (CO2). Le syngaz peut être utilisé pour produire de la chaleur et de l'électricité. Il est également la pierre angulaire d'un grand nombre de produits à haute valeur ajoutée, allant de l'éthanol à l'ammoniac et l'hydrogène pur. Les applications en aval de la production de syngaz sont dictées par son pouvoir calorifique, lui-même dépendant de la teneur du gaz en H2. L’augmentation du contenu du syngaz en H2 est rendu possible par la conversion catalytique à la vapeur d’eau, largement répandu dans le cadre du reformage du méthane pour la production d'hydrogène. Au cours de cette réaction, le CO est converti en H2 et CO2 selon : CO + H2O → CO2 + H2. Ce processus est possible grâce à des catalyseurs métalliques mis en contact avec le CO et de la vapeur. La conversion catalytique à la vapeur d’eau a jusqu'ici été réservé pour de grandes installations industrielles car elle nécessite un capital et des charges d’exploitations très importantes. Par conséquent, les installations de plus petite échelle et traitant des intrants de faible qualité (biomasse, déchets, boues ...), n'ont pas accès à cette technologie. Ainsi, la seule utilisation de leur syngaz à faible pouvoir calorifique, est limitée à la génération de chaleur ou, tout au plus, d'électricité. Afin de permettre à ces installations une gamme d’application plus vaste de leurs syngaz, une alternative économique à base de catalyseur biologique est proposée par l’utilisation de bactéries hyperthermophiles hydrogénogènes. L'objectif de cette thèse est d'utiliser Carboxydothermus hydrogenoformans, une bactérie thermophile carboxydotrophe hydrogénogène comme catalyseur biologique pour la conversion du monoxyde de carbone en hydrogène. Pour cela, l’impact d'un phénomène de biominéralisation sur la production d’H2 a été étudié. Ensuite, la faisabilité et les limites de l’utilisation de la souche dans un bioréacteur ont été évaluées. Tout d'abord, la caractérisation de la phase inorganique prédominante lorsque C. hydrogenoformans est inoculé dans le milieu DSMZ, a révélé une biominéralisation de phosphate de calcium (CaP) cristallin en deux phases. L’analyse par diffraction des rayons X et spectrométrie infrarouge à transformée de Fourier de ce matériau biphasique indique une signature caractéristique de la Mg-whitlockite, alors que les images obtenues par microscopie électronique à transmission ont montré l'existence de nanotiges cristallines s’apparentant à de l’hydroxyapatite. Dans les deux cas, le mode de biominéralisation semble être biologiquement induit plutôt que contrôlé. L'impact du précipité de CaP endogène sur le transfert de masse du CO et la production d’H2 a ensuite été étudié. Les résultats ont été comparés aux valeurs obtenues dans un milieu où aucune précipitation n'est observée. Dans le milieu DSMZ, le KLa apparent (0.22 ± 0.005 min-1) et le rendement de production d’H2 (89.11 ± 6.69 %) étaient plus élevés que ceux obtenus avec le milieu modifié (0.19 ± 0.015 min-1 et 82.60 ± 3.62% respectivement). La présence du précipité n'a eu aucune incidence sur l'activité microbienne. En somme, le précipité de CaP offre une nouvelle stratégie pour améliorer les performances de transfert de masse du CO en utilisant les propriétés hydrophobes de gaz. En second lieu, la conversion du CO en H2 par la souche Carboxydothermus hydrogenoformans fut étudiée et optimisée dans un réacteur gazosiphon de 35 L. Parmi toutes les conditions opérationnelles, le paramètre majeur fut le ratio du débit de recirculation du gaz sur le débit d'alimentation en CO (QR:Qin). Ce ratio impacte à la fois l'activité biologique et le taux de transfert de masse gaz-liquide. En effet, au dessus d’un ratio de 40, les performances de conversion du CO en H2 sont limitées par l’activité biologique alors qu’en dessous, elles sont limitées par le transfert de masse. Cela se concrétise par une efficacité de conversion maximale de 90.4 ± 0.3 % et une activité spécifique de 2.7 ± 0.4 molCO·g–1VSS·d–1. Malgré des résultats prometteurs, les performances du bioréacteur ont été limitées par une faible densité cellulaire, typique de la croissance planctonique de C. hydrogenoformans. Cette limite est le facteur le plus contraignant pour des taux de charge de CO plus élevés. Ces performances ont été comparées à celles obtenues dans un réacteur à fibres creuses (BRFC) inoculé par la souche. En dépit d’une densité cellulaire et d’une activité volumétrique plus élevées, les performances du BRFC à tout le moins cinétiquement limitées quand elles n’étaient pas impactées par le transfert de masse, l'encrassement et le vieillissement de la membrane. Afin de parer à la dégénérescence de C. hydrogenoformans en cas de pénurie de CO, la croissance de la bactérie sur pyruvate en tant que seule source de carbone a été également caractérisée. Fait intéressant, en présence simultanée de pyruvate et de CO, C. hydrogenoformans n’a amorcé la consommation de pyruvate qu’une fois le CO épuisé. Cela a été attribué à un mécanisme d'inhibition du métabolisme du pyruvate par le CO, faisant ainsi du pyruvate le candidat idéal pour un système in situ de secours.

Rôle de l'AmtB dans la régulation de la nitrogénase et la production d'hydrogène chez la bactérie Rhodobacter capsulatus

L’azote est l’élément le plus abondant dans l’atmosphère terrestre avec un pourcentage atteignant 78 %. Composant essentiel pour la biosynthèse des matériels organiques cellulaires, il est inutilisable sous sa forme diatomique (N2) très stable par la plupart des organismes. Seules les bactéries dites diazotrophiques comme Rhodobacter capsulatus sont capables de fixer l’azote moléculaire N2 par le biais de la synthèse d’une enzyme, la nitrogénase. Cette dernière catalyse la réduction du N2 en ammonium (NH4) qui peut alors être assimilé par d’autres organismes. La synthèse et l’activité de la nitrogénase consomment beaucoup d’énergie ce qui implique une régulation rigoureuse et son inhibition tant qu’une quantité suffisante d’ammonium est disponible. Parmi les protéines impliquées dans cette régulation, la protéine d’intérêt AmtB est un transporteur membranaire responsable de la perception et le transport de l’ammonium. Chez R. capsulatus, il a été démontré que suite à l’addition de l’ammonium, l’AmtB inhibe de façon réversible (switch off/switch on) l’activité de la nitrogénase en séquestrant la protéine PII GlnK accompagnée de l’ajout d’un groupement ADP ribose sur la sous unités Fe de l’enzyme par DraT. De plus, la formation de ce complexe à lui seul ne serait pas suffisant pour cette inactivation, ce qui suggère la séquestration d’une troisième protéine, DraG, afin d’inhiber son action qui consiste à enlever l’ADP ribose de la nitrogénase et donc sa réactivation. Afin de mieux comprendre le fonctionnement de l’AmtB dans la régulation et le transport de l’ammonium à un niveau moléculaire et par la même occasion la fixation de l’azote, le premier volet de ce mémoire a été d’introduire une mutation ponctuelle par mutagénèse dirigée au niveau du résidu conservé W237 de l’AmtB. La production d’hydrogène est un autre aspect longtemps étudié chez R. capsulatus. Cette bactérie est capable de produire de l’hydrogène à partir de composés organiques par photofermentation suite à l’intervention exclusive de la nitrogénase. Plusieurs études ont été entreprises afin d’améliorer la production d’hydrogène. Certaines d’entre elles se sont intéressées à déterminer les conditions optimales qui confèrent une production maximale de gaz tandis que d’autres s’intéressent au fonctionnement de la bactérie elle même. Ainsi, le fait que la bioproduction de H2 par fermentation soit catalysée par la nitrogénase cela implique la régulation de l’activité de cette dernière par différents mécanismes dont le switch off par ADP ribosylation de l’enzyme. De ce fait, un mutant de R. capsulatus dépourvu d’AmtB (DG9) a été étudié dans la deuxième partie de cette thèse en termes d’activité de la nitrogénase, de sa modification par ADP ribosylation avec la détection des deux protéines GlnK et DraG qui interviennent dans cette régulation pour connaitre l’influence de différents acides aminés sur la régulation de la nitrogénase et pour l‘utilisation future de cette souche dans la production d’H2 car R. capsulatus produit de l’hydrogène par photofermentation grâce à cette enzyme. Les résultats obtenus ont révélé une activité de la nitrogénase continue et ininterrompue lorsque l’AmtB est absent avec une activité maximale quand la proline est utilisée comme source d’azote durant la culture bactérienne ce qui implique donc que l’abolition de l’activité de cette protéine entraine une production continue d’H2 chez R. capsulatus lorsque la proline est utilisée comme source d’azote lors de la culture bactérienne. Par ailleurs, avec des Western blots on a pu déterminer l’absence de régulation par ADP ribosylation ainsi que les expressions respectives de GlnK et DraG inchangées entre R. capsulatus sauvage et muté. En conclusion, la nitrogénase n’est pas modifiée et inhibée lorsque l’amtB est muté ce qui fait de la souche R. capsulatus DG9 un candidat idéal pour la production de biohydrogène en particulier lorsque du glucose et de la proline sont respectivement utilisés comme source de carbone et d'azote pour la croissance.

Extensive characterization of Campylobacter jejuni chicken isolates to uncover genes involved in the ability to compete for gut colonization

Background: Campylobacter jejuni is responsible for human foodborne enteritis. This bacterium is a remarkable colonizer of the chicken gut, with some strains outcompeting others for colonization. To better understand this phenomenon, the objective of this study was to extensively characterize the phenotypic performance of C. jejuni chicken strains and associate their gut colonizing ability with specific genes. Results: C. jejuni isolates (n = 45) previously analyzed for the presence of chicken colonization associated genes were further characterized for phenotypic properties influencing colonization: autoagglutination and chemotaxis as well as adhesion to and invasion of primary chicken caecal cells. This allowed strains to be ranked according to their in vitro performance. After their in vitro capacity to outcompete was demonstrated in vivo, strains were then typed by comparative genomic fingerprinting (CGF). In vitro phenotypical properties displayed a linear variability among the tested strains. Strains possessing higher scores for phenotypical properties were able to outcompete others during chicken colonization trials. When the gene content of strains was compared, some were associated with different phenotypical scores and thus with different outcompeting capacities. Use of CGF profiles showed an extensive genetic variability among the studied strains and suggested that the outcompeting capacity is not predictable by CGF profile. Conclusion: This study revealed a wide array of phenotypes present in C. jejuni strains, even though they were all recovered from chicken caecum. Each strain was classified according to its in vitro competitive potential and its capacity to compete for chicken gut colonization was associated with specific genes. This study also exposed the disparity existing between genetic typing and phenotypical behavior of C. jejuni strains.

Perspectives de l'usage de poudre de jaunes d’oeuf comme additif alimentaire contre Campylobacter jejuni chez le poulet : mode d'immunisation et effet de l’encapsulation

La campylobactériose est une zoonose causée par Campylobacter jejuni, une bactérie commensale du poulet, considérée comme la principale source de contamination humaine. C. jejuni est rarement retrouvé dans le tube digestif des poulets avant deux ou trois semaines d'âge. Ce qui pourrait s'expliquer par la transmission d'une immunité maternelle (anticorps IgY) transmise aux poussins via le jaune d'œuf. À la Chaire de recherche en Salubrité des Viandes (CRSV), la caractérisation d'anticorps IgY extraits de jaunes d'œufs frais a montré des niveaux de production d’anticorps différents selon le mode d’immunisation et suggère, in vitro, des effets sur ce pathogène. Ce qui laisse penser qu'en tant qu'additif alimentaire, une poudre de jaunes d'œuf potentialisée permettrait de lutter contre C. jejuni chez le poulet à griller. Dans ce travail, le processus de fabrication de l'additif (déshydratation par « Spray dry » puis encapsulation) a été évalué et les différents modes d'immunisation des poules pondeuses ont également été comparés. Les anticorps ont été extraits des différentes poudres de jaunes d'œuf ou du produit final encapsulé, et caractérisés in vitro (dosage / ELISA, test de mobilité, bactéricidie, western blot). Puis, une évaluation in vivo de la capacité de ces poudres encapsulées, incorporée à 5 % dans la moulée, afin de réduire ou de bloquer la colonisation intestinale des oiseaux par C. jejuni a été testée. In vitro, les résultats ont montré des concentrations d'anticorps et d'efficacité variables selon le type de vaccination. Dans cette étude, on a observé que le « Spray dry » a concentré les anticorps dans les poudres et que ces anticorps sont restés fonctionnels contre C. jejuni. On a également observé que l'encapsulation n’entraîne pas une perte quantitative des anticorps contenus dans les poudres. Malgré les résultats in vitro encourageants, les résultats in vivo ne révèlent aucune inhibition ou réduction de la colonisation des oiseaux par C. jejuni. L’absence d’efficacité la poudre de jaunes d’œuf encapsulée dans notre étude n’est pas due à une perte quantitative et/ou qualitative des anticorps comme soutenu dans les expériences in vitro. Ce qui démontre que les recherches doivent être poursuivies afin de déterminer les conditions optimales de l'utilisation de la poudre de jaune d'œuf in vivo, en tant qu'additif alimentaire chez les poulets

Analyse du métabolisme du soufre de la bactérie autotrophique acidophile Acidithiobacillus thiooxidans ATCC 19377

Les impacts environnementaux dues à l'extraction minière sont considérables. C'est l'action des microorganismes, en utilisant leur métabolisme du soufre sur les déchets miniers, qui engendre les plus grands défis. Jusqu'à présent, peu de recherches ont été effectués sur les microorganismes environnementaux pour la compréhension globale de l'action du métabolisme du soufre dans une optique de prévention et de rémédiation des impacts environnementaux de l'extraction minière. Dans cette étude, nous avons étudié une bactérie environnementale, Acidithiobacillus thiooxidans, dans le but de comprendre le métabolisme du soufre selon le milieu de culture et le niveau d'acidité du milieu. Nous avons utilisé la transcriptomique à haut débit, RNA-seq, en association avec des techniques de biogéochimie et de microscopie à électrons pour déterminer l'expression des gènes codants les enzymes du métabolisme du soufre. Nous avons trouvé que l'expression des gènes des enzymes du métabolisme du soufre chez ce microorganisme sont dépendantes du milieu, de la phase de croissance et du niveau d'acidité présent dans le milieu. De plus, les analyses biogéochimiques montrent la présence de composés de soufre réduits et d'acide sulfurique dans le milieu. Finalement, une analyse par microscopie électronique révèle que la bactérie emmagasine des réserves de soufre dans son cytoplasme. Ces résultats permettent une meilleure compréhension de son métabolisme et nous rapprochent de la possibilité de développer une technique de prédiction des réactions ayant le potentiel de causer des impacts environnementaux dus à l'extraction minière.

L-Glutaminase production by an immobilized marine Pseudomonas sp. BTMS -51

The present study is about the Pseudomonas sp. BTMS-51 isolated from the marine sediments of Cochin Coast. In the present study, it is concluded that marine bacteria are ideal candidates for immobilization using either Ca-alginate entrapment or physical adsorption on to synthetic inert supports and the process of immobilization does not negatively influence them. Thus, Ca-alginate entrapment of the bacteria was found to be well suited for reuse of the biomass and extended operational stability during continuous operation. Adherence of the bacterium to inertsupports was observed to be strong and it imparted minimal stress on the immobilized bacterium and allowed detachment and relocation on the supports which enabled the formation of a dynamic equilibrium maintaining a stable cell loading. This is particularly desirable in the industry for extended operational stability and maintenance of consistently higher outputs. Marine Pseudomonas sp. BTMS-51 is ideal for industrial production of extra cellular L-glutaminase and immobilization on to synthetic inert support such as polyurethane foam could be an efficient technique, employing packed bed reactor for continuous production of the enzyme. Temperature and glutamine concentration had significant effects on enzyme production by cells immobilized on polyurethane foam (PUF).

Studies on the pathobiology of penaeid larvae and postlarvae

The thesis presents the results of the studies carried out on certain diseases encountered in the larvae and postlarvae of penaeid prawns raised in the hatcheries at Cochin, Madras and Mandapam Camp during September 1985- April 1988. In the preliminary survey carried out to understand the common diseases occurring in the penaeid larvae and postlarvae, seven cases of diseases and abnormalities were encountered. These included ciliate infestation, Nit_zschia closteriurn infestation, parasitic protozoaninfection, parasitic dinoflagellate infection, appendage necrosis, heteromorphic eye and abnormal eggs and deformed nauplii .The clinical signs, seasonal occurrence and incidence of each of the above cases were provided along with the information on environmental factors such as salinity, dissolved oxygen, temperature and pH of the rearing medium. The Thésis is presented in nine chapters. Chapter 1 surveys the literature on the diseases of penaeid larvae, postlarvae and adult prawns from India and abroad. This is followed by a chapter on the material and methods employed during the present investigation. In the third chapter, seven cases of diseases and abnormalities encountered in the larvae and postlarvae of Penaeus indicus and p. semisulcatus during the survey carried out in the hatcheries located at different centres of Central‘ Marine Fisheries Research Institute are presented and discussed .A bacterium responsible for appendage necrosis was isolated and its taxonomy was studied. It was Gram-negative, fermentative and motile rod. It was sensitive to vibriostatic compound, 0/129. This bacterium was found to be a new isolate of vibrio on the basis of its morphological, biological, physiological and biochemical characters and comparison of these characters with those described for other related vibrios. This new isolate of vibrio was deposited in vibro Referrence Laboratory, Centres for Disease Control, Georgia, U.S.A. and coded as vibrio sp. 2448-88.

Bioremediation of Hydrocarbons by Lysinibacillus fusiformis BTTS10

There exists a need for potential microorganism that could facilitate effective bioremediation of crude oil pollutants in the environment. Hence it was desired to isolate a potential bacterium from marine sediment, which often experiences oil pollution and develop a bioprocess for crude oil biodegradation. In the present study the sediment deposits in the beach of Munakkal, Trichur dist, Kerala, collected immediately after the major event Tsunami in 2004 was collected and analyzed by enrichment culture technique towards isolation of potential strains that could degrade crude oil and its fractions. From the results obtained it was found that the sediment deposits harbor several bacteria with potential for degrading hydrocarbons. However, among the strains obtained, isolate no. BTTS 10 showed capabilities for utilizing both alkanes and aromatic hydrocarbons and hence the same was selected for further studies.

SPATIOTEMPORAL VARIATION AND ANTIBACTERIAL ACTIVITY OF ACTINOMYCETES ISOLATED FROM HIGH ALTITUDE GRASSLAND SOILS OF TROPICAL MONTANE FOREST – KERALA, INDIA

TThe invention of novel antibiotics and other bioactive microbial metabolites continues to be an important aim in new drug discovery programmes. Actinomycetes have the potential to synthesize lots of diverse biologically vigorous secondary metabolites and in the last decades actinomycetes became the most productive source for antibiotics. Therefore in the present study we analyze the antibacterial activity of the actinomycetes isolated from grassland soil samples of Tropical Montane forest. A total of 33 actinomycete strains isolated were characterized and screened for antibacterial activities using well diffusion method against six specific pathogenic organisms. Identification of the isolates revealed that the majority of them were belonging to Streptomycetes followed by Nocardia, Micromonospora, Pseudonocardia, Streptosporangium, Nocardiopsis and Saccharomonospora. Among the 33 isolates, Gr1 strain showed antagonistic activity against all checked pathogens. Nine strains showed antibacaterial activity against Listeria, Vibrio cholera, Bacillus cereus, Staphylococcus aureus and Salmonella typhi and only 2 strains (Gr1and Gr25) showed antagonism to E. coli. The overall percentage of activity of actinomycetes isolates against each pathogenic bacterium was also calculated. While 63.63% of the actinomycetes were antagoinistic against Listeria, Vibrio cholerae, and Bacillus cereus, 60.6% of them were antagonistic to Staphylococcus aureus. Very few isolates (6.06%) showed antibacterial activity against E. coli. In general most of the actinomycetes isolates were antagonistic to grampositive bacteria such as Listeria, Bacillus and Staphylococcus than Gram-negative bacteria Vibrio cholerae, E. coli and Salmonella

Differential induction, isolation, physicochemical and molecular characterization of temperate phages of environmental Vibrio cholerae as evidence of phage mediated Horizontal Gene Transfer

The resurgence of the enteric pathogen Vibrio cholerae, the causative organism of epidemic cholera, remains a major health problem in many developing countries like India. The southern Indian state of Kerala is endemic to cholera. The outbreaks of cholera follow a seasonal pattern in regions of endemicity. Marine aquaculture settings and mangrove environments of Kerala serve as reservoirs for V. cholerae. The non-O1/non-O139 environmental isolates of V. cholerae with incomplete ‘virulence casette’ are to be dealt with caution as they constitute a major reservoir of diverse virulence genes in the marine environment and play a crucial role in pathogenicity and horizontal gene transfer. The genes coding cholera toxin are borne on, and can be infectiously transmitted by CTXΦ, a filamentous lysogenic vibriophages. Temperate phages can provide crucial virulence and fitness factors affecting cell metabolism, bacterial adhesion, colonization, immunity, antibiotic resistance and serum resistance. The present study was an attempt to screen the marine environments like aquafarms and mangroves of coastal areas of Alappuzha and Cochin, Kerala for the presence of lysogenic V. cholerae, to study their pathogenicity and also gene transfer potential. Phenotypic and molecular methods were used for identification of isolates as V. cholerae. The thirty one isolates which were Gram negative, oxidase positive, fermentative, with or without gas production on MOF media and which showed yellow coloured colonies on TCBS (Thiosulfate Citrate Bile salt Sucrose) agar were segregated as vibrios. Twenty two environmental V. cholerae strains of both O1 and non- O1/non-O139 serogroups on induction with mitomycin C showed the presence of lysogenic phages. They produced characteristic turbid plaques in double agar overlay assay using the indicator strain V. cholerae El Tor MAK 757. PCR based molecular typing with primers targeting specific conserved sequences in the bacterial genome, demonstrated genetic diversity among these lysogen containing non-O1 V. cholerae . Polymerase chain reaction was also employed as a rapid screening method to verify the presence of 9 virulence genes namely, ctxA, ctxB, ace, hlyA, toxR, zot,tcpA, ninT and nanH, using gene specific primers. The presence of tcpA gene in ALPVC3 was alarming, as it indicates the possibility of an epidemic by accepting the cholera. Differential induction studies used ΦALPVC3, ΦALPVC11, ΦALPVC12 and ΦEKM14, underlining the possibility of prophage induction in natural ecosystems, due to abiotic factors like antibiotics, pollutants, temperature and UV. The efficiency of induction of prophages varied considerably in response to the different induction agents. The growth curve of lysogenic V. cholerae used in the study drastically varied in the presence of strong prophage inducers like antibiotics and UV. Bacterial cell lysis was directly proportional to increase in phage number due to induction. Morphological characterization of vibriophages by Transmission Electron Microscopy revealed hexagonal heads for all the four phages. Vibriophage ΦALPVC3 exhibited isometric and contractile tails characteristic of family Myoviridae, while phages ΦALPVC11 and ΦALPVC12 demonstrated the typical hexagonal head and non-contractile tail of family Siphoviridae. ΦEKM14, the podophage was distinguished by short non-contractile tail and icosahedral head. This work demonstrated that environmental parameters can influence the viability and cell adsorption rates of V. cholerae phages. Adsorption studies showed 100% adsorption of ΦALPVC3 ΦALPVC11, ΦALPVC12 and ΦEKM14 after 25, 30, 40 and 35 minutes respectively. Exposure to high temperatures ranging from 50ºC to 100ºC drastically reduced phage viability. The optimum concentration of NaCl required for survival of vibriophages except ΦEKM14 was 0.5 M and that for ΦEKM14 was 1M NaCl. Survival of phage particles was maximum at pH 7-8. V. cholerae is assumed to have existed long before their human host and so the pathogenic clones may have evolved from aquatic forms which later colonized the human intestine by progressive acquisition of genes. This is supported by the fact that the vast majority of V. cholerae strains are still part of the natural aquatic environment. CTXΦ has played a critical role in the evolution of the pathogenicity of V. cholerae as it can transmit the ctxAB gene. The unusual transformation of V. cholerae strains associated with epidemics and the emergence of V. cholera O139 demonstrates the evolutionary success of the organism in attaining greater fitness. Genetic changes in pathogenic V. cholerae constitute a natural process for developing immunity within an endemically infected population. The alternative hosts and lysogenic environmental V. cholerae strains may potentially act as cofactors in promoting cholera phage ‘‘blooms’’ within aquatic environments, thereby influencing transmission of phage sensitive, pathogenic V. cholerae strains by aquatic vehicles. Differential induction of the phages is a clear indication of the impact of environmental pollution and global changes on phage induction. The development of molecular biology techniques offered an accessible gateway for investigating the molecular events leading to genetic diversity in the marine environment. Using nucleic acids as targets, the methods of fingerprinting like ERIC PCR and BOX PCR, revealed that the marine environment harbours potentially pathogenic group of bacteria with genetic diversity. The distribution of virulence associated genes in the environmental isolates of V. cholerae provides tangible material for further investigation. Nucleotide and protein sequence analysis alongwith protein structure prediction aids in better understanding of the variation inalleles of same gene in different ecological niche and its impact on the protein structure for attaining greater fitness of pathogens. The evidences of the co-evolution of virulence genes in toxigenic V. cholerae O1 from different lineages of environmental non-O1 strains is alarming. Transduction studies would indicate that the phenomenon of acquisition of these virulence genes by lateral gene transfer, although rare, is not quite uncommon amongst non-O1/non-O139 V. cholerae and it has a key role in diversification. All these considerations justify the need for an integrated approach towards the development of an effective surveillance system to monitor evolution of V. cholerae strains with epidemic potential. Results presented in this study, if considered together with the mechanism proposed as above, would strongly suggest that the bacteriophage also intervenes as a variable in shaping the cholera bacterium, which cannot be ignored and hinting at imminent future epidemics.

Vom Biofilm zur planktonischen Lebensform

Im ersten Teil dieser Dissertation stand die Analyse der Motilitätsentwicklung bei Vertretern der Gattung Methylobacterium im Vordergrund. Diese zu den pink pigmentierten fakultativ methylotrophen Mikroorganismen (PPFMs) gehörenden Prokaryoten sind in der Umwelt weit verbreitet. Besonders häufig besiedeln die Mikroben pflanzliche Oberflächen und können als so genannte Phytosymbionten in einer wechselseitigen Beziehung zu pflanzlichen Organismen stehen. In aquatischer Umgebung können Methylobakterien Flagellen aufweisen. Hierbei handelt es sich um spezielle Fortbewegungsorganellen, die den Mikroben eine aktive Beweglichkeit ermöglichen. Die Ausbildung polarer Einzelflagellen bei Methylobacterium-Zellen in planktonischer Lebensweise konnte unter Anwendung verschiedener mikroskopischer Techniken dokumentiert werden. Quantitative Beweglichkeitsstudien zeigten einen charakteristischen Entwicklungsverlauf, korreliert mit den Wachstumsphasen der Bakterienkulturen und machten deutlich, dass die Motilitätsrate durch Umweltfaktoren, wie z. B. die Nährstoffversorgung, beeinflusst werden kann. Es konnte gezeigt werden, dass die Pflanzen-assoziierten PPFMs in der Lage sind, zwischen einer sessilen und planktonischen Lebensweise zu wechseln und dass sowohl die zelluläre Beweglichkeit als auch die Biofilm-Bildung der Prokaryoten ein reversibles, reaktivierbares Verhalten darstellt. Weiterhin konnte belegt werden, dass die Motilität der epiphytischen Mikroben bezüglich der Besiedelung von Pflanzen, z. B. bei der Ausbreitung auf Keimblatt-Oberflächen von Sonnenblumen (Helianthus annuus), keine zentrale Rolle spielt und eine endophytische Lebensweise unwahrscheinlich ist. Ziel der Arbeit war weiterhin die Charakterisierung und Identifizierung eines aus der Phyllosphäre der Echten Feige (Ficus carica, Standort Griechenland) isolierten Bakterien-Stammes (Mtb. sp. Fc1). Die fakultativ methylotrophe Stoffwechseleigenschaft, sowie die auffällige rötliche Pigmentierung belegen, dass es sich um einen Vertreter der PPFMs handelt. Die Analyse morphologischer, physiologischer und biochemischer Eigenschaften bestätigte in Übereinstimmung mit molekularphylogenetischen Untersuchungen zur Klassifizierung und taxonomischen Einordnung, dass es sich um Pflanzen-assoziierte Mikroben der Gattung Methylobacterium handelt. Analysen der 16S rDNA sowie partieller Sequenzen der für Methylobakterien etablierten Marker-Gene mxaF und gyrB verdeutlichten die phylogenetische Stellung und die evolutionären Beziehungen des Ficus-Isolates. Obwohl enge Verwandtschaftsverhältnisse zu anderen Methylobacterium-Arten ermittelt werden konnten, war eine Identifizierung als valide beschriebene Spezies nicht möglich. Die Resultate legen den Schluss nahe, dass es sich um eine neue, unbeschriebene Spezies der epiphytisch lebenden Methylobakterien handelt.

Inverse Metabolic Engineering of Synechocystis PCC 6803 for Improved Growth Rate and Poly-3-hydroxybutyrate Production

Synechocystis PCC 6803 is a photosynthetic bacterium that has the potential to make bioproducts from carbon dioxide and light. Biochemical production from photosynthetic organisms is attractive because it replaces the typical bioprocessing steps of crop growth, milling, and fermentation, with a one-step photosynthetic process. However, low yields and slow growth rates limit the economic potential of such endeavors. Rational metabolic engineering methods are hindered by limited cellular knowledge and inadequate models of Synechocystis. Instead, inverse metabolic engineering, a scheme based on combinatorial gene searches which does not require detailed cellular models, but can exploit sequence data and existing molecular biological techniques, was used to find genes that (1) improve the production of the biopolymer poly-3-hydroxybutyrate (PHB) and (2) increase the growth rate. A fluorescence activated cell sorting assay was developed to screen for high PHB producing clones. Separately, serial sub-culturing was used to select clones that improve growth rate. Novel gene knock-outs were identified that increase PHB production and others that increase the specific growth rate. These improvements make this system more attractive for industrial use and demonstrate the power of inverse metabolic engineering to identify novel phenotype-associated genes in poorly understood systems.

Patrones de resistencia bacteriana en infecciones urinarias en pacientes ambulatorios. JAVESALUD IPS. 2011-2012

Introducción: El aumento de la resistencia bacteriana, el uso inadecuado de antibióticos y las formulaciones empíricas, en infecciones urinarias, obligan a establecer las características epidemiológicas y de resistencia de nuestro medio. Método: Se revisaron todos los urocultivos positivos (RUFC mayor a 100000) solicitados en JAVESALUD entre junio/2011 y marzo/2012 y las historias clínicas correspondientes, con el objeto de realizar análisis descriptivo de variables demográficas, microorganismos aislados y resistencia bacteriana. Posteriormente se identificaron los factores de riesgo que favorecen aparición de multirresistencia en los pacientes mediante una regresión logística binaria. Resultados: Se obtuvieron 204 urocultivos, correspondientes a 120 pacientes. El 87% fueron mujeres (edad promedio 58,9 años). La bacteria más aislada: E. coli (64%). La resistencia antibiótica fue: ampicilina 57,39%, ciprofloxacina 28,9%, nitrofurantoína 9,71% y TMP/SMX 32,47%. La multirresistencia (24,3%) muestra asociación con el antecedente de múltiples tratamientos recibidos (p 0.015) y las infecciones urinarias a repetición (p 0.005). Discusión: La distribución por géneros y la resistencia son similares a lo reportados en la literatura, sin embargo, la frecuencia de infecciones por E. coli resulta menor a lo reportado. Los altos niveles de multirresistencia se encuentran relacionados con el tipo de pacientes manejados en la institución. Los manejos empíricos, con nitrofurantoína se deben limitar a los pacientes que cumplan a cabalidad con los criterios diagnósticos de infección urinaria simple. El urocultivo es fundamental en el manejo de pacientes con infecciones a repetición que hayan recibido múltiples tratamientos y que consulten de manera repetida al servicio de medicina general.

Anàlisi polifàsica de soques de "Pseudomonas fluorescens" potencials agents de biocontrol de malalties de fruiters

Molts bacteris del grup fluorescent del gènere Pseudomonas són capaços de controlar malalties de les plantes causades per fongs i bacteris fitopatògens (ACBs) o mostren activitat com a bacteris promotors del creixement de les plantes (BPCPs). S'han descrit diversos metabòlits que intervenen de manera important en la seva activitat com a ACBs i BPCPs entre els quals en destaquen el 2,4-diacetilfloroglucinol (Phl), àcid fenazin-1-carboxílic (PCA), Pirrolnitrina (Prn), àcid cianhídric (HCN), àcid 3-indolacètic (IAA), sideròfors i quitinases. L'objectiu principal del nostre treball ha estat la comparació de les característiques d'un grup de Pseudomonas del grup fluorescent utilitzant una aproximació polifàsica amb la finalitat d'establir possibles relacions entre algunes de les característiques i la capacitat d'actuar com a ACB o BPCP. Atesa la importància en el biocontrol de la producció de metabòlits com Phl, PCA i Prn, l'objectiu preliminar ha estat la recerca i obtenció de soques productores d'aquests metabòlits. Per assolir aquest objectiu s'ha emprat una aproximació molecular basada en la detecció dels gens biosintètics implicats en la seva producció en lloc de la detecció directa dels metabòlits per evitar els efectes que poden tenir les condicions de cultiu en la inducció o repressió de la seva síntesi. S'han realitzat diferents protocols basats (i) en la cerca assistida de productors mitjançant l'ús de marcadors fenotípics i posterior confirmació per PCR i, (ii) en l'ús de la PCR per a la detecció dels gens directament dels extractes bacterians, d'enriquiments d'aquests extractes i la realització de la hibridació en colònies per al posterior aïllament. La cerca assistida de productors de Phl mitjançant marcadors fenotípics i posteriorment la utilització de tècniques moleculars (amplificació per PCR del gen phlD), ha estat el millor mètode en el tipus de mostres processades en el nostre treball, on la proporció de productors és relativament baixa. En total s'han aïllat a partir de diversos ambients 4 soques portadores dels gens de la síntesi de PCA, 15 de Phl i 1 de Prn. S'ha constituït una col·lecció de 72 soques de Pseudomonas del grup fluorescent que inclou 18 aïllats propis portadors dels gens biosintètics necessaris per la producció de Phl PCA i Prn; 6 soques de referència procedents de col·leccions de cultius tipus, 14 soques productores dels diferents antibiòtics cedides per altres investigadors i una selecció de 34 soques procedents d'un treball previ realitzat en el nostre grup de recerca. A la col·lecció s'hi troben soques candidates a ACB i BPCP de diverses malalties i plantes. Les 72 soques s'han caracteritzat fenotípica i genotípicament. La caracterització fenotípica s'ha portat a terme mitjançant la identificació a nivell d'espècie amb galeries API 20NE i proves bioquímiques específiques; la producció de metabòlits com PCA, Phl, Prn, IAA, HCN, quitinases i sideròfors mitjançant l'ús de diferents tècniques; antagonisme in vitro en diversos medis enfront dos fongs (Stemphylium vesicarium i Penicillium expansum) i tres bacteris fitopatògens (Erwinia amylovora, Pseudomonas syringae pv. syringae i Xanthomonas arboricola pv. juglandis); l'eficàcia de la inhibició de la infecció en bioassaigs in vivo sobre material vegetal enfront els fongs P. expansum en poma i S. vesicarium en fulles de perera i enfront el bacteri E. amylovora en fruits immadurs de perera i, finalment, en assaigs de promoció de creixement en dos portaempelts comercials de Prunus. Cal destacar que P. expansum causa la podridura blava en pomes i peres en postcollita, S. vesicarium la taca bruna de la perera i E. amylovora el foc bacterià de les rosàcies. El nombre de soques de Pseudomonas, sobre el total de les 72 estudiades, productores d'IAA (4) i quitinases (6) és baix, mentre que és elevat en el cas del HCN (32), que a més està associat a la producció de Phl. Els resultats obtinguts en l'antagonisme in vitro han mostrat en el cas dels bacteris que és dependent del patogen indicador i del medi de cultiu. La presència o absència de ferro no sembla ser un factor que potencií l'antagonisme. En el cas dels fongs no s'ha observat però, influència del medi de cultiu emprat. En el total de 72 soques s'ha observat un percentatge baix de soques que manifesten antagonisme en tots els medis assajats vers 3 o 4 dels patògens (7). Solament 2 d'aquestes 7 soques han mostrat ser també efectives en bioassaigs d'inhibició de les infeccions causades per 2 dels 3 patògens assajats. Algunes de les soques efectives en els bioassaigs no són antagonistes in vitro en cap dels medis assajats enfront el mateix patogen. En el cas de la promoció del creixement, s'han observat més soques promotores del creixement del portaempelts de prunera Marianna 2624 que no en l'híbrid de presseguer-ametller GF677 i les eficàcies assolides són també majors en el cas de Marianna 2624, detectant una elevada especificitat soca/portaempelts La caracterització genotípica s'ha realitzat mitjançant l'anàlisi dels polimorfismes en la longitud dels fragments de restricció de DNA ribosomal (RFLP-rDNA) i l'anàlisi dels polimorfismes en la longitud dels fragments de macrorestricció genòmica de DNA cromosòmic separats per electroforesi en camp polsant (MRFLP-PFGE). Ambdues anàlisis van mostrar una gran heterogeneïtat genètica entre les soques caracteritzades i no s'ha pogut relacionar les agrupacions obtingudes amb les característiques fenotípiques o capacitat d'actuar com a ACB o BPCP. Els patrons de macrorestricció genòmica (MRFLP-PFGE) del bacteri model P. fluorescens EPS288 són estables en el temps i independents de les condicions de cultiu assajades al laboratori o en mostres naturals, mostrant ser una tècnica eficaç en la identificació de reaïllats de mostres naturals inoculades prèviament amb el bacteri. Una selecció de soques que comparteixen el fet de produir floroglucinol s'han caracteritzat mitjançant RFLP i seqüenciació del gen phlD. S'ha establert una relació entre les agrupacions obtingudes en les anàlisis RFLP-rDNA, RFLP-phlD i les seqüències del gen. En l'anàlisi filogenètica de les seqüències del gen phlD s'ha observat un elevat grau de polimorfisme obtenint-se 3 agrupacions principals. Les agrupacions semblen relacionar-se amb els patrons de producció de metabòlits (Phl, HCN i Prn en una primera agrupació; Phl i HCN en la segona i solament Phl en la tercera), però aquestes no s'han pogut relacionar amb l'origen geogràfic de les soques o la seva activitat com a ACBs i/o BPCP. Amb les dades obtingudes de la caracterització fenotípica i genotípica s'ha realitzat una anàlisi multivariant (correspondències, correlacions d'Spearman i de freqüències amb variables categòriques). S'ha demostrat la importància de disposar d'una tècnica que permeti depurar una col·lecció de soques descartant les soques genèticament idèntiques, ja que influeixen en els resultats de les anàlisis. Pels tres patògens assajats com a indicadors i els dos portaempelts emprats, no s'ha observat cap correlació entre la inhibició de la infecció o la promoció del creixement amb les característiques fenotípiques i genotípiques de les soques que fos significatiu i consistent en les tres tècniques emprades.