Sistemas planos de estructuras (aproximación al modelo de análisis de piezas rectas de hormigón armado en estado último)

En esta tesis, se trata del establecimiento de las bases de análisis plástico de piezas de hormigón armado en servicio y estado último procurando sentar los soportes de funcionamiento que concuerdan con la realidad y normativa vigente. El intento de establecer estas bases, con el máximo rigor para su uso, ha llevado a consecuencias lejanas cualitativas y cuantitativas sobre los modelos elásticos y elastoplásticos en uso,-momento tope ect- que, incluyendo lo complejo del problema plástico que se trata, no adoptan formulaciones adecuadas, o los plantemientos analíticos, no son más coherentes con los resultados obtenidos, en el dimensionado, que otros de base más sencilla, limitándose a estrategias de análisis de sección basadas en condicones de deformación -como serían los métodos de Cross y Matrioficiales- , estableciendose un claro divorcio entre mecanismo de cálculo y geometría. Este trabajo, intenta abrir una puerta al análisis de la estructura bajo condiciones puramente de deformación y solo supone en este campo el primer paso de un largo cemino que iría de la pieza a la estructura y de ésta al edificio posteriormente, quedando así sentados los criterios básicos para el análisis plástico global de estructuras. Todo ello a partir de la imposibilidad de avanzar en el análisis de secciones, si no es penetrando en el proceso de plastificación de las mismas y el de sus armaduras, así como el de las zonas de afección de las diferentes plastificaciones locales. La inclusión de esta concepción de análisis, en lo referente a obtener gráficos reales de respuesta interna de la pieza, es posible gracias al uso, en este caso del miniordenador 9825-HP utilizado, en donde se aplica de forma reiterada los consabidos métodos de discretización elementales con los cuales se obtienen decorosas precisiones sobre los resultados. Este estudio, que en ocasiones, alude a normas, más discribir un comportamiento que sentar doctrina. Como se ha realizado solo par forjados se añade una colección de ábacos de utilización practica de éstos. Naturalmente las bases establecidas, se hacen extensivas a cualquier pieza de directriz recta de hormigón armado, en donde geometría y materiales -hormigón y acero- pueden ser variables y están contempladas dentro de programas usados. En el terreno de las conclusiones, los forjados no deben ser asimilados a vigas, como tradicionalmente venía haciendose, ya que los métodos de relajación empledos no coinciden con la realidad. Quedando estos límites plenamente establecidos en el desarrollo del trabajo. Se considera el tema relevante en lo reeferente a un análisis de la estructura tendente a un aprovechamento más adecuado de los materiales en un supuesto futuro de escasez de materia prima, quizás no lejano, y sobretodo en la posible aproximación al modelo matemático, que si bien normativa y bibliografía aludían constantemente, nunca precisaron las bases de su comportamiento.

L.A.V. Madrid-Zaragoza. Tramo Terrer-Calatayud : acondicionamiento y mejora

Este proyecto recoge las actuaciones destinadas al Acondicionamiento y Mejora de la linea de alta velocidad Madrid-Zaragoza. En concreto, la actuación que se proyecta corresponde al tramo comprendido entre las proximidades a la localidad de Terrer y la Estación de Calatayud. La línea de alta velocidad Madrid-Zaragoza en la actualidad no alcanza los 300 km/h, manteniéndose en repetidos intervalos por debajo de los 250 km/h. Hoy en día parece estar confirmado que para que los trenes de Alta Velocidad circulen a la velocidad de diseño de 350 km/h hay que sustituir la vía en balasto por vía hormigonada o vía en placa. Según lo publicado en el BOE del 24 de Julio de 2006, pag. 27705, “En España, en ensayos dinámicos de alta velocidad realizados con los trenes de la serie 102, suministrados por el consorcio TALGO-Bombardier, a velocidades superiores a 280 Km/h y específicamente por encima de los 300/320 km/h, se ha comprobado que se produce levantamiento de balasto. Este fenómeno origina daños de diversa consideración en los bajos y laterales del tren, especialmente en su mitad trasera en el sentido de la marcha. También puede obligar al torneado de las ruedas.” La denominada vía en placa o vía sin balasto es una tecnología utilizada en la superestructura ferroviaria en distintos ámbitos, tanto en metropolitanos urbanos, donde sus especiales características hacen optima su utilización, como en alta velocidad en países como Japón (de forma generalizada) o Alemania (línea Colonia-Franckfurt). Pero la vía en placa no puede montarse en los trazados actuales tal y como se han ido construyendo, pues no aguanta los grandes terraplenes y pedraplenes que se han diseñado. Otro de los aspectos que justifican el presente proyecto es la necesidad de disminución en los costes de mantenimiento derivados de la vía sobre balasto, que se reducirian drasticamente con la instauracion del sistema de via hormigonada. Además, el corredor de AV Madrid-Zaragoza-Barcelona-Frontera francesa enlaza desde 2008 las dos grandes urbes españolas y conectara en un futuro próximo con Francia. Desde su puesta en servicio hasta Barcelona ha sido utilizada por mas de 17 millones de viajeros. La tendencia es creciente y se preve que sea necesario en un futuro un aumento de la capacidad, que inevitablemente iría ligada a un aumento de la velocidad comercial de la línea. Otro factor importante en la realización de este proyecto seria su diseño para trafico mixto de viajeros y de mercancias (ya esta diseñado para trafico mixto el tramo entre el Puerto de Barcelona y la conexion con Francia) lo que supone la posibilidad de establecer nuevos servicios con destino o procedencia en los centros intermodales de Francia y otros países europeos, además del fomento de trafico de mercancias por ferrocarril, con todas las ventajas que esto acarrearia. Las actuaciones previstas consisten en un cambio de la seccion a via en placa con el fin de aumentar la velocidad de circulacion hasta los 350 km/h. Esto conlleva un nuevo diseno del trazado adecuado para la construccion de via en placa, asi como para la circulacion de trafico mixto. La actuacion desarrollada en este Proyecto de Construccion corresponde al tramo comprendido entre el Rio Piedra, situado entre los P.K. 206 y 207 de la linea actual y la Estacion de Calatayud, próxima al el P.K. 221 de la línea actual.

Sonar bat for visually impaired people

Visually impaired people have many difficulties when traveling because it is impossible for them to detect obstacles that stand in their way. Bats instead of using the sight to detect these obstacles use a method based on ultrasounds, as their sense of hearing is much more developed than that of sight. The aim of the project is to design and build a device based on the method used by the bats to detect obstacles and transmit this information to people with vision problems to improve their skills. The method involves sending ultrasonic waves and analyzing the echoes produced when these waves collide with an obstacle. The sent signals are pulses and the information needed is the time elapsed from we send a pulse to receive the echo produced. The speed of sound is fixed within the same environment, so measuring the time it takes the wave to make the return trip, we can easily know the distance where the object is located. To build the device we have to design the necessary circuits, fabricate printed circuit boards and mount the components. We also have to design a program that would work within the digital part, which will be responsible for performing distance calculations and generate the signals with the information for the user. The circuits are the emitter and the receiver. The transmitter circuit is responsible for generating the signals that we will use. We use an ultrasonic transmitter which operates at 40 kHz so the sent pulses have to be modulated with this frequency. For this we generate a 40 kHz wave with an astable multivibrator formed by NAND gates and a train of pulses with a timer. The signal is the product of these two signals. The circuit of the receiver is a signal conditioner which transforms the signals received by the ultrasonic receiver in square pulses. The received signals have a 40 kHz carrier, low voltage and very different shapes. In the signal conditioner we will amplify the voltage to appropriate levels, eliminate the component of 40 kHz and make the shape of the pulses square to use them digitally. To simplify the design and manufacturing process in the digital part of the device we will use the Arduino platform. The pulses sent and received echoes enter through input pins with suitable voltage levels. In the Arduino, our program will poll these two signals storing the time when a pulse occurs. These time values are analyzed and used to generate an audible signal with the user information. This information is stored in the frequency of the signal, so that the generated signal frequency varies depending on the distance at which the objects are. RESUMEN Las personas con discapacidad visual tienen muchas dificultades a la hora de desplazarse ya que les es imposible poder detectar los obstáculos que se interpongan en su camino. Los murciélagos en vez de usar la vista para detectar estos obstáculos utilizan un método basado en ultrasonidos, ya que su sentido del oído está mucho más desarrollado que el de la vista. El objetivo del proyecto es diseñar y construir un dispositivo basado en el método usado por los murciélagos para detectar obstáculos y que pueda ser usado por las personas con problemas en la vista para mejorar sus capacidades. El método utilizado consiste en enviar ondas de ultrasonidos y analizar el eco producido cuando estas ondas chocan con algún obstáculo. Las señales enviadas tendrán forma de pulsos y la información necesaria es el tiempo transcurrido entre que enviamos un pulso y recibimos el eco producido. La velocidad del sonido es fija dentro de un mismo entorno, por lo que midiendo el tiempo que tarda la onda en hacer el viaje de ida y vuelta podemos fácilmente conocer la distancia a la que se encuentra el objeto. Para construir el dispositivo tendremos que diseñar los circuitos necesarios, fabricar las placas de circuito impreso y montar los componentes. También deberemos diseñar el programa que funcionara dentro de la parte digital, que será el encargado de realizar los cálculos de la distancia y de generar las señales con la información para el usuario. Los circuitos diseñados corresponden uno al emisor y otro al receptor. El circuito emisor es el encargado de generar las señales que vamos a emitir. Vamos a usar un emisor de ultrasonidos que funciona a 40 kHz por lo que los pulsos que enviemos van a tener que estar modulados con esta frecuencia. Para ello generamos una onda de 40 kHz mediante un multivibrador aestable formado por puertas NAND y un tren de pulsos con un timer. La señal enviada es el producto de estas dos señales. El circuito de la parte del receptor es un acondicionador de señal que transforma las señales recibidas por el receptor de ultrasonidos en pulsos cuadrados. Las señales recibidas tienen una portadora de 40 kHz para poder usarlas con el receptor de ultrasonidos, bajo voltaje y formas muy diversas. En el acondicionador de señal amplificaremos el voltaje a niveles adecuados además de eliminar la componente de 40 kHz y conseguir pulsos cuadrados que podamos usar de forma digital. Para simplificar el proceso de diseño y fabricación en la parte digital del dispositivo usaremos la plataforma Arduino. Las señales correspondientes el envío de los pulsos y a la recepción de los ecos entraran por pines de entrada después de haber adaptado los niveles de voltaje. En el Arduino, nuestro programa sondeara estas dos señales almacenando el tiempo en el que se produce un pulso. Estos valores de tiempo se analizan y se usan para generar una señal audible con la información para el usuario. Esta información ira almacenada en la frecuencia de la señal, por lo que la señal generada variará su frecuencia en función de la distancia a la que se encuentren los objetos.

SEDAH: Servidor de datos para el estudio de la alteración hidrológica

Durante los años 2008, 2009 y 2010 se han llevado a cabo, a nivel estatal, diversas actuaciones encaminadas a evaluar la alteración ecohidrológica de las masas de agua. Esta evaluación se llevó a cabo con la metodología y aplicación IAHRIS. Durante el desarrollo de estos trabajos se constató la necesidad de crear una herramienta que permitiera una mejor adecuación de los valores de la Red Oficial de Estaciones de Aforo (ROEA) a las diferentes herramientas que permiten valorar la alteración hidrológica de los regímenes hidrológicos, con especial atención a su aplicación a través del modelo IAHRIS. La aplicación web creada, denominada SEDAR (Servidor de Datos para Estudio de la Alteración Hidrológica), ayuda a solventar esta tarea, por un lado agilizando el trámite de selección de estaciones de aforo, fechas, tipo de serie de aforo, valoración preliminar de la calidad de los datos, clasificación referencia-alterado de los caudales, exportación de datos, y por otro proporcionando información completada tanto para datos mensuales y diarios, disponiendo de esta manera de un mayor volumen de datos en los formatos nativos de IAHRIS e IRA. De este modo, se dispone de una aplicación de fácil acceso por el usuario y con gran valor para la realización de estudios de alteración hidrológica, propuestas de régimen de caudal ambiental y proyectos de restauración fluvial; además constituye una aplicación base para la incorporación de nuevas funcionalidades de mayor alcance ligadas a la obtención de datos en régimen natural o de referencia.

Restauración del sonido fílmico

La restauración fílmica del audio es un proceso bastante complejo y se ha indagado poco en este campo. Antes de restaurar cualquier archivo, se debe preservar y conservar los archivos de la mejor manera posible. La preservación son las medidas que se deben tomar para garantizar el acceso permanente y la conservación asegura le existencia del archivo en su forma más original. Mientras que la restauración se basa en el estudio de los posibles deterioros que sufren los soportes fílmicos en el tiempo y los procesos que existen para corregirlos. La restauración siempre debe conservar la mayor originalidad posible, es decir debe mantener el audio como originalmente se expuso por primera vez. En la primera etapa, se identifican los posibles deterioros que se producen en los archivos, si conocemos en qué momento fue grabada la películas y cómo fue grabada, es decir con que máquina se realizó la grabación y el soporte fílmico en el que está grabado. Tanto las máquinas como los soportes han ido evolucionando a lo largo de la historia. El estudio de los soportes fílmicos nos permite conocer las degradaciones que sufren a lo largo del tiempo los archivos y por consecuencia, conocer las posibles restauraciones. Para intentar evitar degradaciones mayores, se intenta preservar y conservar en condiciones óptimas para el soporte. Según el soporte del archivo, tendrá unas condiciones típicas de temperatura, humedad, ventilación… en las cuales el material se conserva de la mejor manera. Tras estos pasos, se procede a restaurar. La restauración más típica es con materiales fotoquímicos, pero es bastante compleja y por tanto, en el proyecto se analiza la restauración tras digitalizar los archivos fílmicos. Para poder digitalizar correctamente los archivos, debemos tener presentes las normas y reglas de digitalización que están establecidas. La digitalización permite identificar las alteraciones típicas que aparecen en los materiales fílmicos, gracias a la herramienta del espectrograma podemos conocer las posibles soluciones de restauración para cada alteración. Las alteraciones que podemos encontrar e identificar son: · Zumbidos e Interferencias. · Siseo y Silbido. · Crujidos. · Pops y Clics. · Wow. · Lagunas o Abandonos. · Ruidos intermitentes. · Reverberación. La última parte del proyecto, una vez que se tienen todas las alteraciones típicas de los archivos fílmicos identificadas, se procede al estudio de cada una de ellas con las herramientas del espectrograma y se realiza el estudio de una manera más técnica. Con el espectrograma se determinan las herramientas que solucionan cada alteración como Reverb para la reverberación, Decrackle para los crujidos… y en el marco técnico se determina las características que tiene cada herramienta, es decir el tipo de filtro, ventana… que se puede utilizar para poder restaurar el audio de cada alteración. La restauración digital es un campo aún por investigar, pero se debería de empezar a concienciar que es una solución factible. Que este tipo de restauración puede mantener el sonido original y no va a modificar los archivos, como muchas veces se piensa. Ya que el paso del tiempo, poco a poco, ira degradando y destruyendo los soportes fílmicos en los que se encuentran, y el principal objetivo que se pretende conseguir es que los materiales fílmicos perduren a lo largo de la historia. ABSTRACT. The film audio restoration is a fairly complex process and little research has been done in this field. Before restoring any files, you must preserve and keep the files in the best way possible. The preservation is the measures to be taken to ensure continued access to and preservation ensures existence of the file in its original form. The restoration is based on the study of possible damage suffered by the film media in time and the processes that exist to correct them. The restoration must always retain the most original as possible, i.e. to keep the audio as originally discussed for the first time. In the first stage, potential impairments that occur in the files are identified, if you know what time it was recorded the movies and how it was recorded, i.e. that machine recording and film media on which is recorded took place. Both machines as media have evolved throughout history. The study of film media lets us know the suffering degradations over time and result files, make possible restorations. To try to prevent further degradation, are intended to preserve and keep in good condition for support. Depending on the media file, will have typical conditions of temperature, humidity, ventilation... in which the material is preserved in the best way. After these steps, we proceed to restore. The most typical is with photochemical restoration materials, but is rather complex and therefore the restoration project is analyzed after scanning film archives. To successfully scan the files must be aware of the rules and regulations are established digitization. Digitization allows identifying the typical alterations that appear in the film materials, thanks to the tool spectrogram we know the possible restoration solutions for each alteration. The alterations that can find and identify are: · Buzz and Interference. · Hiss and Hissing. · Crackle. · Pops and Clicks. · Wow and Flutter. · Audio Dropouts. The last part of the project, when we have all the typical alterations identified film archives, proceed to the study of each of them with the tools of spectrogram and the study of a more technical way is done . With the spectrogram tools that solve every alteration as Reverb for reverb, Decrackle for cracks... and the technical framework the features that each tool is determined, i.e. the type of filter, window... that can be used are determined for to restore the audio of each alteration. Digital restoration is an area for future research, but should start aware that it is a feasible solution. This type of restoration can keep the original sound and will not modify files, as is often thought. Since the passage of time, gradually degrading and destroying anger film media in which they are, and the main objective to be achieved is that the film materials endure throughout history.

COMUNICAÇÃO ESTRATÉGICA DE IES ATRAVÉS DO HANDEBOL DE ALTO RENDIMENTO

A tese aborda como a Universidade Metodista de São Paulo (UMESP) e a Universidade de Taubaté (UNITAU) utilizam o esporte de alto rendimento como meio de divulgação estratégica. O estudo mostra qual é a relação existente entre a comunicação institucional e mercadológica das referidas IES e o handebol de alto rendimento. A tese objetiva também, apresentar as ferramentas de comunicação utilizadas por UMESP e UNITAU para divulgar suas ações de patrocínio e, por fim, avaliar o grau do fluxo de comunicação dos profissionais de comunicação e marketing das IES com gestores esportivos do handebol. A comparação entre as IES analisadas deu-se pelo uso do método de pesquisa de ‘estudos de casos múltiplos’, já a pesquisa documental e a bibliográfica foram utilizadas para a construção teórica do trabalho. Os dados dos objetos de estudo foram coletados através do uso da técnica de entrevista, estas que, adotaram a característica ‘semiestruturada’ com perguntas abertas e uso de roteiro. Concluiu-se que as universidades UMESP e UNITAU pouco exploram a imagem vitoriosa do handebol de alto rendimento que investem como meio estratégico de divulgação

ASSISTÊNCIA DE SAÚDE ÀS MULHERES MUÇULMANAS NO BRASIL: UMA ANÁLISE DA RELAÇÃO ENTRE O SISTEMA RELIGIOSO ISLÂMICO E A POLÍTICA NACIONAL DE ATENÇÃO INTEGRAL À SAÚDE DA MULHER.

A presente dissertação tem por objetivo analisar os aspectos religiosos islâmicos e as implicações das relações de gênero no islam sobre a assistência de saúde às mulheres muçulmanas, e através disto, discutir a importância do conhecimento prévio do islamismo pelos profissionais de saúde para propor uma assistência de saúde congruente a estas mulheres, tendo por referência a Política Nacional de Atenção Integral à Saúde da Mulher. Esta pesquisa tem abordagem qualitativa, com o desenvolvimento de pesquisa de campo e aplicação de um roteiro de perguntas semi-estruturado, com questões relacionadas ao islamismo e à saúde das mulheres. Ao todo, foram entrevistadas dez pessoas, sendo estas: quatro mulheres revertidas ao islam, três mulheres de família muçulmana, dois sheiks e uma assistente social. As entrevistas foram realizadas no Centro de Divulgação do Islam para a América Latina e o Caribe (CDIAL) e na Assembléia Mundial da Juventude Islâmica na América Latina (WAMY).

Evidence for two nonidentical drug-interaction sites in the human P-glycoprotein

Human P-glycoprotein (Pgp) confers multidrug resistance to cancer cells by ATP-dependent extrusion of a great many structurally dissimilar hydrophobic compounds. The manner in which Pgp recognizes these different substrates is unknown. The protein shows internal homology between its N- and C-terminal halves, each comprised of six putative transmembrane helices and a consensus ATP binding/utilization site. Photoactive derivatives of certain Pgp substrates specifically label two regions, one on each half of the protein. In this study, using [125I]iodoarylazidoprazosin ([125I]IAAP), a photoactive analog of prazosin, we have demonstrated the presence of two nonidentical drug-interaction sites within Pgp. Taking advantage of a highly susceptible trypsin cleavage site in the linker region of Pgp, we characterized the [125I]IAAP binding to the N- and C-terminal halves. cis(Z)-Flupentixol, a modulator of Pgp function, preferentially increased the affinity of [125I]IAAP for the C-terminal half of the protein (C-site) by reducing the Kd from 20 to 6 nM without changing the labeling or affinity (Kd = 42–46 nM) of the N-terminal half (N-site). Also, the concentration of vinblastine (Pgp substrate) and cyclosporin A (Pgp modulator) required for 50% inhibition of [125I]IAAP binding to the C-site was increased 5- to 6-fold by cis(Z)-flupentixol without any effect on the N-site. In addition, [125I]IAAP binding to the N-site was less susceptible than to C-site to inhibition by vanadate which blocks ATP hydrolysis and drug transport. These data demonstrate the presence of at least two nonidentical substrate interaction sites in Pgp.

Crystal structure of the ribosomal RNA domain essential for binding elongation factors

The structure of a 29-nucleotide RNA containing the sarcin/ricin loop (SRL) of rat 28 S rRNA has been determined at 2.1 Å resolution. Recognition of the SRL by elongation factors and by the ribotoxins, sarcin and ricin, requires a nearly universal dodecamer sequence that folds into a G-bulged cross-strand A stack and a GAGA tetraloop. The juxtaposition of these two motifs forms a distorted hairpin structure that allows direct recognition of bases in both grooves as well as recognition of nonhelical backbone geometry and two 5′-unstacked purines. Comparisons with other RNA crystal structures establish the cross-strand A stack and the GNRA tetraloop as defined and modular RNA structural elements. The conserved region at the top is connected to the base of the domain by a region presumed to be flexible because of the sparsity of stabilizing contacts. Although the conformation of the SRL RNA previously determined by NMR spectroscopy is similar to the structure determined by x-ray crystallography, significant differences are observed in the “flexible” region and to a lesser extent in the G-bulged cross-strand A stack.

The ribosome-in-pieces: Binding of elongation factor EF-G to oligoribonucleotides that mimic the sarcin/ricin and thiostrepton domains of 23S ribosomal RNA

An oligoribonucleotide (a 27-mer) that mimics the sarcin/ricin (S/R) domain of Escherichia coli 23S rRNA binds elongation factor EF-G; the Kd is 6.9 μM, whereas for binding to ribosomes it is 0.7 μM. Binding saturates when EF-G and the S/R RNA are equimolar; at saturation 70% of the input RNA is in complexes with EF-G. Binding of EF-G to S/R RNA does not require GTP but is inhibited by GDP; the inhibition by GDP is overcome by GTP. The effects of mutations of the S/R domain nucleotides G2655, A2660, and G2661 suggest that EF-G recognizes the conformation of the RNA rather than the identity of the nucleotides. EF-G also binds to an oligoribonucleotide (an 84-mer) that has the thiostrepton region of 23S rRNA; however, EF-G binds independently to S/R and thiostrepton oligoribonucleotides.

Catalytically inactive lipoprotein lipase expression in muscle of transgenic mice increases very low density lipoprotein uptake: Direct evidence that lipoprotein lipase bridging occurs in vivo

Lipoprotein lipase (LPL) is the central enzyme in plasma triglyceride hydrolysis. In vitro studies have shown that LPL also can enhance lipoprotein uptake into cells via pathways that are independent of catalytic activity but require LPL as a molecular bridge between lipoproteins and proteoglycans or receptors. To investigate whether this bridging function occurs in vivo, two transgenic mouse lines were established expressing a muscle creatine kinase promoter-driven human LPL (hLPL) minigene mutated in the catalytic triad (Asp156 to Asn). Mutated hLPL was expressed only in muscle and led to 3,100 and 3,500 ng/ml homodimeric hLPL protein in post-heparin plasma but no hLPL catalytic activity. Less than 5 ng/ml hLPL was found in preheparin plasma, indicating that proteoglycan binding of mutated LPL was not impaired. Expression of inactive LPL did not rescue LPL knock-out mice from neonatal death. On the wild-type (LPL2) background, inactive LPL decreased very low density lipoprotein (VLDL)-triglycerides. On the heterozygote LPL knock-out background (LPL1) background, plasma triglyceride levels were lowered 22 and 33% in the two transgenic lines. After injection of radiolabeled VLDL, increased muscle uptake was observed for triglyceride-derived fatty acids (LPL2, 1.7×; LPL1, 1.8×), core cholesteryl ether (LPL2, 2.3×; LPL1, 2.7×), and apolipoprotein (LPL1, 1.8×; significantly less than cholesteryl ether). Skeletal muscle from transgenic lines had a mitochondriopathy with glycogen accumulation similar to mice expressing active hLPL in muscle. In conclusion, it appears that inactive LPL can act in vivo to mediate VLDL removal from plasma and uptake into tissues in which it is expressed.

GCS1, an Arf Guanosine Triphosphatase-activating Protein in Saccharomyces cerevisiae, Is Required for Normal Actin Cytoskeletal Organization In Vivo and Stimulates Actin Polymerization In Vitro

Recent cloning of a rat brain phosphatidylinositol 3,4,5-trisphosphate binding protein, centaurin α, identified a novel gene family based on homology to an amino-terminal zinc-binding domain. In Saccharomyces cerevisiae, the protein with the highest homology to centaurin α is Gcs1p, the product of the GCS1 gene. GCS1 was originally identified as a gene conditionally required for the reentry of cells into the cell cycle after stationary phase growth. Gcs1p was previously characterized as a guanosine triphosphatase-activating protein for the small guanosine triphosphatase Arf1, and gcs1 mutants displayed vesicle-trafficking defects. Here, we have shown that similar to centaurin α, recombinant Gcs1p bound phosphoinositide-based affinity resins with high affinity and specificity. A novel GCS1 disruption strain (gcs1Δ) exhibited morphological defects, as well as mislocalization of cortical actin patches. gcs1Δ was hypersensitive to the actin monomer-sequestering drug, latrunculin-B. Synthetic lethality was observed between null alleles of GCS1 and SLA2, the gene encoding a protein involved in stabilization of the actin cytoskeleton. In addition, synthetic growth defects were observed between null alleles of GCS1 and SAC6, the gene encoding the yeast fimbrin homologue. Recombinant Gcs1p bound to actin filaments, stimulated actin polymerization, and inhibited actin depolymerization in vitro. These data provide in vivo and in vitro evidence that Gcs1p interacts directly with the actin cytoskeleton in S. cerevisiae.

Genetic and Biochemical Characterization of the Yeast Spo12 Protein

We have performed a genetic and biochemical analysis of the SPO12 gene, which regulates meiotic nuclear divisions in budding yeast. When sporulated, spo12 mutants undergo a single meiotic nuclear division most closely resembling meiosis II. We observed that Spo12 protein is localized to the nucleus during both meiotic divisions and that Clb1-Cdc28, Clb3-Cdc28, Clb4-Cdc28, and Clb5-Cdc28 kinase activities during meiosis were not affected by a spo12 mutation. Using two-hybrid analysis, we identified several genes, three of which are meiotically induced, that may code for proteins that interact with Spo12p. We also observed that two genes, BNS1 (Bypasses Need for Spo12p), which has homology to SPO12, and SPO13, whose mutant phenotype is like that of spo12, can partially suppress the meiotic defect of spo12 mutants when overexpressed. We found that Spo12p is also localized to the nucleus in vegetative cells and that its level peaks during G2/M. We observed that a spo12 mutation is synthetically lethal in vegetative cells with a mutation in HCT1, a gene necessary for cells to exit mitosis, suggesting that Spo12p may have a role in exit from mitosis.

Recombinant immunotoxins specific for a mutant epidermal growth factor receptor: Targeting with a single chain antibody variable domain isolated by phage display

EGFRvIII is a mutant epidermal growth factor receptor found in glioblastoma, and in carcinoma of the breast, ovary, and lung. The mutant receptor has a deletion in its extracellular domain that results in the formation of a new, tumor-specific extracellular sequence. Mice were immunized with a synthetic peptide corresponding to this sequence and purified EGFRvIII. A single chain antibody variable domain (scFv) phage display library of 8 × 106 members was made from the spleen of one immunized mouse. A scFv specific for EGFRvIII was isolated from this library by panning with successively decreasing amounts of synthetic peptide. This was used to make an immunotoxin by fusing the scFv DNA sequence to sequences coding for domains II and III of Pseudomonas exotoxin A. Purified immunotoxin had a Kd of 22 nM for peptide and a Kd of 11 nM for cell-surface EGFRvIII. The immunotoxin was very cytotoxic to cells expressing EGFRvIII, with an IC50 of 1 ng/ml (16 pM) on mouse fibroblasts transfected with EGFRvIII and an IC50 of 7–10 ng/ml (110–160 pM) on transfected glioblastoma cells. There was no cytotoxic activity at 1000 ng/ml on the untransfected parent glioblastoma cell line. The immunotoxin was completely stable upon incubation at 37°C for 24 h in human serum. The combination of good affinity, cytotoxicity and stability make this immunotoxin a candidate for further preclinical evaluation.

Site-specific chemical modification with polyethylene glycol of recombinant immunotoxin anti-Tac(Fv)-PE38 (LMB-2) improves antitumor activity and reduces animal toxicity and immunogenicity

Chemical modification of proteins with polyethylene glycol (PEGylation) can increase plasma half-lives, stability, and therapeutic potency. To make a PEGylated recombinant immunotoxin with improved therapeutic properties, we prepared a mutant of anti-Tac(Fv)-PE38 (LMB-2), a recombinant immunotoxin composed of a single-chain Fv fragment of the anti-human Tac monoclonal antibody to the IL-2 receptor α subunit fused to a 38-kDa fragment of Pseudomonas exotoxin. For site-specific PEGylation of LMB-2, one cysteine residue was introduced into the peptide connector (ASGCGPE) between the Fv and the toxin. This mutant LMB-2 (cys1-LMB-2), which retained full cytotoxic activity, was then site-specifically conjugated with 5 or 20 kDa of polyethylene glycol-maleimide. When compared with unmodified LMB-2, both PEGylated immunotoxins showed similar cytotoxic activities in vitro but superior stability at 37°C in mouse serum, a 5- to 8-fold increase in plasma half-lives in mice, and a 3- to 4-fold increase in antitumor activity. This was accompanied by a substantial decrease in animal toxicity and immunogenicity. Site-specific PEGylation of recombinant immunotoxins may increase their therapeutic potency in humans.