Base-Paired and Base-Stacked Structures of the Anti-HIV Drug Lamivudine: A Nucleoside DNA-Mimicry with Unprecedented Topology

We have prepared a DNA-mimicry of nucleosides in which the anti-HIV drug lamivudine (beta-L-2',3'-dideoxy-3'-thiacytidine, 3TC) self-assembles into a base-paired and helically base-stacked hexagonal structure. Face-to-face and face-to-tail stacked 3TC=3TC dimers base-paired through two hydrogen bonds between neutral cytosines by either N-H center dot center dot center dot O or N-H center dot center dot center dot N atoms give rise to a right-handed DNA-mimicry of lamivudine with an unusual highly symmetric hexagonal lattice and topology. In addition, a base-paired and base-stacked supramolecular architecture of lamivudine hemihydrochloride hemihydrate was also obtained as a result of our crystal screenings. This structure is formed through partially face-to-face stacked lamivudine pairs held together by protonated and neutral fragments. However, no helical stacking occurs in this structure in which lamivudine also adopts unusual conformations as the C1'-endo and C1'-exo sugar puckers and cytosine orientations intermediate between the anti and syn conformations. As a conclusion drawn from the nucleoside duplex, the hexagonal DNA-mimicry of lamivudine reveals that such double-stranded helices can be assembled without counterions and organic solvents but with higher crystallographic symmetry instead, because only water crystallizes together with lamivudine in this structure.

Sonothrombolysis for acute ischemic stroke: a systematic review of randomized controlled trials

Object. Sonothrombolysis has recently been considered an emerging modality for the treatment of stroke. The purpose of the present paper was to review randomized clinical studies concerning the effects of sonothrombolysis associated with tissue plasminogen activator (tPA) on acute ischemic stroke. Methods. Systematic searches for literature published between January 1996 and July 2011 were performed for studies regarding sonothrombolysis combined with tPA for acute ischemic stroke. Only randomized controlled trials were included. Data extraction was based on ultrasound variables, patient characteristics, and outcome variables (rate of intracranial hemorrhages and arterial recanalization). Results. Four trials were included in this study; 2 trials evaluated the effect of transcranial Doppler (TCD) ultrasonography on sonothrombolysis, and 2 addressed transcranial color-coded duplex (TCCD) ultrasonography. The frequency of ultrasound waves varied from 1.8 to 2 MHz. The duration of thrombus exposure to ultrasound energy ranged from 60 to 120 minutes. Sample sizes were small, recanalization was evaluated at different time points (60 and 120 minutes), and inclusion criteria were heterogeneous. Sonothrombolysis combined with tPA did not lead to an increase in symptomatic intracranial hemorrhagic complications. Two studies demonstrated that patients treated with ultrasound combined with tPA had statistically significant higher rates of recanalization than patients treated with tPA alone. Conclusions. Despite the heterogeneity and the limitations of the reviewed studies, there is evidence that sonothrombolysis associated with tPA is a safe procedure and results in an increased rate of recanalization in the setting of acute ischemic stroke when wave frequencies and energy intensities of diagnostic ultrasound systems are used. (http://thejns.org/doi/abs/10.3171/2011.10.FOCUS11251)

Brazilian guidelines for the application of transcranial ultrasound as a diagnostic test for the confirmation of brain death

Neurosonological studies, specifically transcranial Doppler (TCD) and transcranial color-coded duplex (TCCD), have high level of specificity and sensitivity and they are used as complementary tests for the diagnosis of brain death (BD). A group of experts, from the Neurosonology Department of the Brazilian Academy of Neurology, created a task force to determine the criteria for the following aspects of diagnosing BD in Brazil: the reliability of TCD methodology; the reliability of TCCD methodology; neurosonology training and skills; the diagnosis of encephalic circulatory arrest; and exam documentation for BD. The results of this meeting are presented in the current paper.

The contrast-enhanced Doppler ultrasound with perfluorocarbon exposed sonicated albumin does not improve the diagnosis of renal artery stenosis compared with angiography

There are no studies investigating the effect of the contrast infusion on the sensitivity and specificity of the main Doppler criteria of renal artery stenosis (RAS). Our aim was to evaluate the accuracy of these Doppler criteria prior to and following the intravenous administration of perfluorocarbon exposed sonicated albumin (PESDA) in patients suspected of having RAS. Thirty consecutive hypertensive patients (13 males, mean age of 57 ± 10 years) suspected of having RAS by clinical clues, were submitted to ultrasonography (US) of renal arteries before and after enhancement using continuous infusion of PESDA. All patients underwent angiography, and haemodynamically significant RAS was considered when ≥50%. At angiography, it was detected RAS ≥50% in 18 patients, 5 with bilateral stenosis. After contrast, the examination time was slightly reduced by approximately 20%. In non-enhanced US the sensitivity was better when based on resistance index (82.9%) while the specificity was better when based on renal aortic ratio (89.2%). The predictive positive value was stable for all indexes (74.0%–88.0%) while negative predictive value was low (44%–51%). The specificity and positive predictive value based on renal aortic ratio increased after PESDA injection respectively, from 89 to 97.3% and from 88 to 95%. In hypertensives suspected to have RAS the sensitivity and specificity of Duplex US is dependent of the criterion evaluated. Enhancement with continuous infusion of PESDA improves only the specificity based on renal aortic ratio but do not modify the sensitivity of any index.

L'Aquila 2010 : nuove residenze per la riconfigurazione di un tessuto urbano

Prima di procedere con il progetto sono state fatte sezioni storiche dell’area, in epoche indicative, per comprendere quelle che sono le invarianti e le caratteristiche di tale tessuto. Da qui si è dedotto lo schema generatore dell’insediamento che parte dall’identificazione degli assi viari (pedonali e carrabili) già presenti nell’area, che fanno diretto riferimento allo schema cardo-decumanico generatore dell’impianto angioino della città. Con il tracciamento si individuano gli isolati base, che con variazioni formali e tipologiche hanno originato gli edifici di progetto. I corpi di fabbrica generatori della planimetria, dialogano e rimangono a stretto contatto con i pochi edifici agibili, per i quali sono previsti consolidamenti e ristrutturazioni, qualora necessari. Inevitabile è stato il confronto con l’orografia, prestando particolare attenzione a non annullare con l’inserimento degli edifici il dislivello presente, ma lasciarlo percepire chiaramente: l’attacco a terra di ogni edificio avviene gradualmente, passando dai due piani fuori terra a monte ai tre, quattro a valle. Ovviamente non tutti gli assi sono stati trattati allo stesso modo, ma conseguentemente alla loro funzione e carattere di utilizzo. Analizzando la struttura viaria dell’intera area, si presentano schematicamente due anelli di circonvallazione del centro urbano: uno più esterno, di più recente costruzione, rappresentato da via XX Settembre, e uno più vecchio, che rimane rasente al centro storico, costituito dal viale Duca Degli Abruzzi, che prosegue in viale Giovanni XXIII e termina nel viadotto Belvedere. Quest’ultimo asse rappresenta sicuramente un importante collegamento cittadino, sia per la vicinanza al centro, sia per le porzioni di città messe in comunicazione; nonostante ciò il viadotto ha subito, all’altezza di viale Nicolò Persichetti, uno smottamento dopo il 6 aprile, ed essendo un elemento di scarso valore architettonico e spaziale, la sua presenza è stata ripensata. Compiendo una deviazione su via XX Settembre al termine di viale Duca Degli Abruzzi, che va a sfruttare la già presente via Fonte Preturo, non si va a rivoluzionante l’odierno assetto, che confluisce comunque, qualche centinaio di metri dopo, in via XX Settembre è si eliminano le connotazioni negative che il viadotto avrebbe sul rinnovato ingresso al centro storico. La vivibilità tende a favorire così collegamento e all’eterogeneità degli spazi più che la separazione fisica e psicologica: il concetto di città fa riferimento alla vita in comune; per favorirla è importante incentivare i luoghi di aggregazione, gli spazi aperti. Dalle testimonianze degli aquilani la vita cittadina vedeva il centro storico come principale luogo d’incontro sociale. Esso era animato dal numeroso “popolo” di studenti, che lo manteneva attivo e vitale. Per questo nelle intenzioni progettuali si pone l’accento su una visione attiva di città con un carattere unitario come sostiene Ungers3. La funzione di collegamento, che crea una struttura di luoghi complementari, può essere costituita dal sistema viario e da quello di piazze (luoghi sociali per eccellenza). Via Fontesecco ha la sua terminazione nell’omonima piazza: questo spazio urbano è sfruttato, nella conformazione attuale, come luogo di passaggio, piuttosto che di sosta, per questo motivo deve essere ricalibrato e messo in relazione ad un sistema più ampio di quello della sola via. In questo sistema di piazze rientra anche la volontà di mettere in relazione le emergenze architettoniche esistenti nell’area e nelle immediate vicinanze, quali la chiesa e convento dell’Addolorata, Palazzo Antonelli e la chiesa di San Domenico (che si attestano tutte su spazi aperti), e la chiesa di San Quinziano su via Buccio di Ranallo. In quest’ottica l’area d’intervento è intesa come appartenente al centro storico, parte del sistema grazie alla struttura di piazze, e allo stesso tempo come zona filtro tra centro e periferia. La struttura di piazze rende l’area complementare alla trama di pieni e vuoti già presente nel tessuto urbano cittadino; la densità pensata nel progetto, vi si accosta con continuità, creando un collegamento con l’esistente; allontanandosi dal centro e avvicinandosi quindi alle più recenti espansioni, il tessuto muta, concedendo più spazio ai vuoti urbani e al verde. Via Fontesecco, il percorso che delimita il lato sud dell’area, oltre ad essere individuata tra due fronti costruiti, è inclusa tra due quinte naturali: il colle dell’Addolorata (con le emergenze già citate) e il colle Belvedere sul quale s’innesta ora il viadotto. Questi due fronti naturali hanno caratteri molto diversi tra loro: il colle dell’Addolorata originariamente occupato da orti, ha un carattere urbano, mentre il secondo si presenta come una porzione di verde incolto e inutilizzato che può essere sfruttato come cerniera di collegamento verticale. Lo stesso declivio naturale del colle d’Addolorata che degrada verso viale Duca Degli Abruzzi, viene trattato nel progetto come una fascia verde di collegamento con il nuovo insediamento universitario. L’idea alla base del progetto dell’edilizia residenziale consiste nel ricostruire insediamenti che appartengano parte della città esistente; si tratta quindi, di una riscoperta del centro urbano e una proposta di maggior densità. Il tessuto esistente è integrato per ottenere isolati ben definiti, in modo da formare un sistema ben inserito nel contesto. Le case popolari su via Fontesecco hanno subito con il sisma notevoli danni, e dovendo essere demolite, hanno fornito l’occasione per ripensare all’assetto del fronte, in modo da integrarlo maggiormente con il tessuto urbano retrostante e antistante. Attualmente la conformazione degli edifici non permette un’integrazione ideale tra i percorsi di risalita pedonale al colle dell’Addolorata e la viabilità. Le scale terminano spesso nella parte retrostante gli edifici, senza sfociare direttamente su via Fontesecco. Si è quindi preferito frammentare il fronte, che rispecchiasse anche l’assetto originario, prima cioè dell’intervento fascista, e che consentisse comunque una percezione prospettica e tipologica unitaria, e un accesso alla grande corte retrostante. Il nuovo carattere di via Fontesecco, risultante dalle sezioni stradali e dalle destinazioni d’uso dei piani terra degli edifici progettuali, è quello di un asse commerciale e di servizio per il quartiere. L’intenzione, cercando di rafforzare l’area di progetto come nuovo possibile ingresso al centro storico, è quella di estendere l’asse commerciale fino a piazza Fontesecco, in modo da rendere tale spazio di aggregazione vitale: “I luoghi sono come monadi, come piccoli microcosmi, mondi autonomi, con tutte le loro caratteristiche, pregi e difetti, inseriti in un macrocosmo urbano più grande, che partendo da questi piccoli mondi compone una metropoli e un paesaggio”.4[...] Arretrando verso l’altura dell’Addolorata è inserita la grande corte del nuovo isolato residenziale, anch’essa con servizi (lavanderie, spazi gioco, palestra) ma con un carattere diverso, legato più agli edifici che si attestano sulla corte, anche per l’assenza di un accesso carrabile diretto; si crea così una gerarchia degli spazi urbani: pubblico sulla via e semi-pubblico nella corte pedonale. La piazza che domina l’intervento (piazza dell’Addolorata) è chiusa da un edificio lineare che funge da “quinta”, il centro civico. Molto flessibile, presenta al suo interno spazi espositivi e un auditorium a diretta disposizione del quartiere. Sempre sulla piazza sono presenti una caffetteria, accessibile anche dal parco, che regge un sistema di scale permettendo di attraversare il dislivello con la “fascia” verde del colle, e la nuova ala dell’Hotel “Duca degli Abruzzi”, ridimensionata rispetto all’originale (in parte distrutto dal terremoto), che si va a collegare in maniera organica all’edificio principale. Il sistema degli edifici pubblici è completo con la ricostruzione del distrutto “Istituto della Dottrina Cristiana”, adiacente alla chiesa di San Quinziano, che va a creare con essa un cortile di cui usufruiscono gli alunni di questa scuola materna ed elementare. Analizzando l’intorno, gran parte dell’abitato è definito da edifici a corte che, all’interno del tessuto compatto storico riescono a sopperire la mancanza di spazi aperti con corti, più o meno private, anche per consentire ai singoli alloggi una giusta illuminazione e areazione. Nel progetto si passa da due edifici a corti semi-private, chiusi in se stessi, a un sistema più grande e complesso che crea un ampio “cortile” urbano, in cui gli edifici che vi si affacciano (case a schiera e edifici in linea) vanno a caratterizzare gli spazi aperti. Vi è in questa differenziazione l’intenzione di favorire l’interazione tra le persone che abitano il luogo, il proposito di realizzare elementi di aggregazione più privati di una piazza pubblica e più pubblici di una corte privata. Le variazioni tipologiche degli alloggi poi, (dalla casa a schiera e i duplex, al monolocale nell’edilizia sociale) comportano un’altrettanta auspicabile mescolanza di utenti, di classi sociali, età e perché no, etnie diverse che permettano una flessibilità nell’utilizzo degli spazi pubblici.

Transcriptional functions of DNA Topoisomerases at a genome-wide scale and a single gene levels

The DNA topology is an important modifier of DNA functions. Torsional stress is generated when right handed DNA is either over- or underwound, producing structural deformations which drive or are driven by processes such as replication, transcription, recombination and repair. DNA topoisomerases are molecular machines that regulate the topological state of the DNA in the cell. These enzymes accomplish this task by either passing one strand of the DNA through a break in the opposing strand or by passing a region of the duplex from the same or a different molecule through a double-stranded cut generated in the DNA. Because of their ability to cut one or two strands of DNA they are also target for some of the most successful anticancer drugs used in standard combination therapies of human cancers. An effective anticancer drug is Camptothecin (CPT) that specifically targets DNA topoisomerase 1 (TOP 1). The research project of the present thesis has been focused on the role of human TOP 1 during transcription and on the transcriptional consequences associated with TOP 1 inhibition by CPT in human cell lines. Previous findings demonstrate that TOP 1 inhibition by CPT perturbs RNA polymerase (RNAP II) density at promoters and along transcribed genes suggesting an involvement of TOP 1 in RNAP II promoter proximal pausing site. Within the transcription cycle, promoter pausing is a fundamental step the importance of which has been well established as a means of coupling elongation to RNA maturation. By measuring nascent RNA transcripts bound to chromatin, we demonstrated that TOP 1 inhibition by CPT can enhance RNAP II escape from promoter proximal pausing site of the human Hypoxia Inducible Factor 1 (HIF-1) and c-MYC genes in a dose dependent manner. This effect is dependent from Cdk7/Cdk9 activities since it can be reversed by the kinases inhibitor DRB. Since CPT affects RNAP II by promoting the hyperphosphorylation of its Rpb1 subunit the findings suggest that TOP 1inhibition by CPT may increase the activity of Cdks which in turn phosphorylate the Rpb1 subunit of RNAP II enhancing its escape from pausing. Interestingly, the transcriptional consequences of CPT induced topological stress are wider than expected. CPT increased co-transcriptional splicing of exon1 and 2 and markedly affected alternative splicing at exon 11. Surprisingly despite its well-established transcription inhibitory activity, CPT can trigger the production of a novel long RNA (5’aHIF-1) antisense to the human HIF-1 mRNA and a known antisense RNA at the 3’ end of the gene, while decreasing mRNA levels. The effects require TOP 1 and are independent from CPT induced DNA damage. Thus, when the supercoiling imbalance promoted by CPT occurs at promoter, it may trigger deregulation of the RNAP II pausing, increased chromatin accessibility and activation/derepression of antisense transcripts in a Cdks dependent manner. A changed balance of antisense transcripts and mRNAs may regulate the activity of HIF-1 and contribute to the control of tumor progression After focusing our TOP 1 investigations at a single gene level, we have extended the study to the whole genome by developing the “Topo-Seq” approach which generates a map of genome-wide distribution of sites of TOP 1 activity sites in human cells. The preliminary data revealed that TOP 1 preferentially localizes at intragenic regions and in particular at 5’ and 3’ ends of genes. Surprisingly upon TOP 1 downregulation, which impairs protein expression by 80%, TOP 1 molecules are mostly localized around 3’ ends of genes, thus suggesting that its activity is essential at these regions and can be compensate at 5’ ends. The developed procedure is a pioneer tool for the detection of TOP 1 cleavage sites across the genome and can open the way to further investigations of the enzyme roles in different nuclear processes.

Identification and characterization of the sRNA network in Neisseria meningitidis

Bacterial small regulatory RNAs (sRNAs) are posttranscriptional regulators involved in stress responses. These short non-coding transcripts are synthesised in response to a signal, and control gene expression of their regulons by modulating the translation or stability of the target mRNAs, often in concert with the RNA chaperone Hfq. Characterization of a Hfq knock out mutant in Neisseria meningitidis revealed that it has a pleiotropic phenotype, suggesting a major role for Hfq in adaptation to stresses and virulence and the presence of Hfq-dependent sRNA activity. Global gene expression analysis of regulated transcripts in the Hfq mutant revealed the presence of a regulated sRNA, incorrectly annotated as an open reading frame, which we renamed AniS. The synthesis of this novel sRNA is anaerobically induced through activation of its promoter by the FNR global regulator and through global gene expression analyses we identified at least two predicted mRNA targets of AniS. We also performed a detailed molecular analysis of the action of the sRNA NrrF,. We demonstrated that NrrF regulates succinate dehydrogenase by forming a duplex with a region of complementarity within the sdhDA region of the succinate dehydrogenase transcript, and Hfq enhances the binding of this sRNA to the identified target in the sdhCDAB mRNA; this is likely to result in rapid turnover of the transcript in vivo. In addition, in order to globally investigate other possible sRNAs of N. meningitdis we Deep-sequenced the transcriptome of this bacterium under both standard in vitro and iron-depleted conditions. This analysis revealed genes that were actively transcribed under the two conditions. We focused our attention on the transcribed non-coding regions of the genome and, along with 5’ and 3’ untranslated regions, 19 novel candidate sRNAs were identified. Further studies will be focused on the identification of the regulatory networks of these sRNAs, and their targets.

Kinetic and affinity analysis of hybridization reactions between PNA probes and DNA targets using surface plasmon field-enhanced fluorescence spectroscopy (SPFS)

Sequenz spezifische biomolekulare Analyseverfahren erweisen sich gerade im Hinblick auf das Humane Genom Projekt als äußerst nützlich in der Detektion von einzelnen Nukleotid Polymorphismen (SNPs) und zur Identifizierung von Genen. Auf Grund der hohen Anzahl von Basenpaaren, die zu analysieren sind, werden sensitive und effiziente Rastermethoden benötigt, welche dazu fähig sind, DNA-Proben in einer geeigneten Art und Weise zu bearbeiten. Die meisten Detektionsarten berücksichtigen die Interaktion einer verankerten Probe und des korrespondierenden Targets mit den Oberflächen. Die Analyse des kinetischen Verhaltens der Oligonukleotide auf der Sensoroberfläche ist infolgedessen von höchster Wichtigkeit für die Verbesserung bereits bekannter Detektions - Schemata. In letzter Zeit wurde die Oberflächen Plasmonen feld-verstärkte Fluoreszenz Spektroskopie (SPFS) entwickelt. Sie stellt eine kinetische Analyse - und Detektions - Methode dar, die mit doppelter Aufzeichnung, d.h. der Änderung der Reflektivität und des Fluoreszenzsignals, für das Interphasen Phänomen operiert. Durch die Verwendung von SPFS können Kinetikmessungen für die Hybridisierung zwischen Peptid Nukleinsäure (PNA), welche eine synthetisierte Nukleinsäure DNA imitiert und eine stabilere Doppelhelix formt, und DNA auf der Sensoroberfläche ausgeführt werden. Mittels einzel-, umfassend-, und titrations- Experimenten sowohl mit einer komplementär zusammenpassenden Sequenz als auch einer mismatch Sequenz können basierend auf dem Langmuir Modell die Geschwindigkeitskonstanten für die Bindungsreaktion des oligomer DNA Targets bzw. des PCR Targets zur PNA ermittelt werden. Darüber hinaus wurden die Einflüsse der Ionenstärke und der Temperatur für die PNA/DNA Hybridisierung in einer kinetischen Analyse aufgezeigt.

Design, synthesis and biological evaluation of substituted naphthalene diimides as anticancer agents

It has been proved that naphthalene diimide (NDI) derivatives display anticancer properties as intercalators and G-quadruplex-binding ligands, leading to DNA damage, senescence and down-regulation of oncogene expression. This thesis deals with the design and synthesis of disubstituted and tetrasubstituted NDI derivatives endowed with anticancer activity, interacting with DNA together with other targets implicated in cancer development. Disubstituted NDI compounds have been designed with the aim to provide potential multitarget directed ligands (MTDLs), in order to create molecules able to simultaneously interact with some of the different targets involved in this pathology. The most active compound, displayed antiproliferative activity in submicromolar range, especially against colon and prostate cancer cell lines, the ability to bind duplex and quadruplex DNA, to inhibit Taq polymerase and telomerase, to trigger caspase activation by a possible oxidative mechanism, to downregulate ERK 2 protein and to inhibit ERKs phosphorylation, without acting directly on microtubules and tubuline. Tetrasubstituted NDI compounds have been designed as G-quadruplex-binding ligands endowed with anticancer activity. In order to improve the cellular uptake of the lead compound, the N-methylpiperazine moiety have been replaced with different aromatic systems and methoxypropyl groups. The most interesting compound was 1d, which was able to interact with the G-quadruplexes both telomeric and in HSP90 promoter region, and it has been co-crystallized with the human telomeric G-quadruplex, to directly verify its ability to bind this kind of structure, and also to investigate its binding mode. All the morpholino substituted compounds show antiproliferative activity in submicromolar values mainly in pancreatic and lung cancer cell lines, and they show an improved biological profile in comparison with that of the lead compound. In conclusion, both these studies, may represent a promising starting point for the development of new interesting molecules useful for the treatment of cancer, underlining the versatility of the NDI scaffold.

Rilevamento geologico-strutturale lungo la Linea di Belluno nella zona di Monte Piad (Provincia di Belluno)

Il prodotto principale del lavoro è la Carta Geologica alla scala 1:5.000 che ha portato un avanzamento delle conoscenze nella zona in esame. Dal punto di vista stratigrafico il Gruppo dei Calcari Grigi è stato suddiviso nelle formazioni già distinte nei Fogli CARG Tione, Malè, Trento e Asiago: la Formazione di Monte Zugna, Fm. Di Loppio, Fm. Di Rotzo, Fm. Di Grigno. È stato possibile anche rilevare e cartografare l’Oolite di S. Vigilio, anche detta Encrinite di Monte Agaro, con uno spessore di circa 5 m sino alla zona di Sass de Falares, cioè più ad est di quanto noto in letteratura. E’ stato osservato che la Linea di Belluno non è un piano unico, ma comprende altre due faglie: la Linea di Monte Piad che consiste in una faglia inversa che taglia in cerniera l’Anticlinale del Monte Coppolo, e poco a sud la Linea di Sasso Falares che rappresenta la faglia che ha generato la piega per propagazione di faglia del Coppolo, e proseguendo poi verso l’alto ha tagliato tutta la piega emergendo in superficie. In tal modo si forma il duplex di Sasso Falares, arrangiato in una blanda coppia anticinale-sinclinale tipica della geometria di queste strutture, che risulta delimitato a nord dalla linea omonima e a sud dalla L. di Belluno s.s. che si incontrano a quota circa 700 m. Si è potuta anche ricostruire la cinematica del piano principale del thrust di Belluno studiando l’affioramento eccezionale messo a nudo di recente. Gli assi degli sforzi, agenti in compressione, ricostruiti tramite l’analisi meso-strutturale, testimoniano una compressione orientata NNW-SSE, correlabile con l’Evento Valsuganese del Serravalliano-Tortoniano, legato ad un asse compressivo N340 che rappresenta l’evento principale nella regione sudalpina. Anche l’Evento compressivo del Cattiano-Burdigalliano con asse N30 ed una compressione orientata circa E-W correlabile con l’Evento Scledense del Messiniano-Pliocene risultano dall’analisi strutturale.

Rilevamento geologico – strutturale lungo la Linea di Belluno nella zona di Sass de Falares (Provincia di Belluno)

Il lavoro si propone di definire l’assetto geologico strutturale dell’area compresa tra la Valle del Torrente Cismon ed il Sass de Falares, a nord di Lamon (BL). Le novità che si sono potute aggiungere alla cartografia esistente, dal punto di vista stratigrafico sono: 1) La suddivisione del gruppo dei Calcari Grigi in quattro formazioni presenti più a occidente, quali la formazione di Monte Zugna, la formazione di Loppio, la formazione di Rotzo e la formazione del Grigno che in queste zone non erano ancora state evidenziate. La presenza di diffusi noduli di selce grigio-giallastra presenti nella parte medio-alta della formazione di Monte Zugna che testimoniano la persistenza di un ambiente subtidale nel Lias al passaggio tra Alto di Trento e Bacino Bellunese. 2) La presenza dell’Encrinite di Monte Agaro (Oolite di S.Vigilio) con uno spessore esiguo di 5 m sul Monte Coppolo ed anche in cresta a Sass de Falares. In ambito tettonico: 1) Si è accertato che l’anticlinale del Monte Coppolo è tagliata dalla faglia inversa del M.Piad con direzione circa E – O e immergente a N con un’inclinazione di circa 70° spezzando la piega quasi in cerniera; la si può riconoscere sul versante S ed E del M. Coppolo dove disloca la Fm. di M. Zugna e la Dolomia Principale. 2) Si è ricostruito l’assetto tettonico del Sass de Falares, che risulta essere una scaglia tettonica (duplex) compresa tra la Linea di Sass de Falares e la Linea di Belluno. 3) L’Anticlinale del M. Coppolo si è generata per propagazione di una faglia che corrisponde alla Linea di Sass de Falares che in seguito ha tagliato l’anticlinale con meccanismi di fault bend folding. Infine per ultima si è formata la Linea di Belluno s.s. a basso angolo con un raccorciamento maggiore di 2 km. Il sovrascorrimento di Belluno pertanto non è una struttura unica ma si sfrangia in 3 strutture tettoniche separate: Linea di M.Piad, Linea di Sass de Falares e Linea di Belluno s.s. 4) In Val della Selva è stato invece fatta la scoperta più importante di questo lavoro, visto che si è potuto osservare direttamente il piano principale della Linea di Belluno affiorante sulla strada forestale che porta verso la località Pugnai e quindi studiarlo e tracciarlo con precisione sulla carta. Esso ha direzione N68 ed un inclinazione di 30° verso NNW; mette a contatto la Fm. di M. Zugna con la Maiolica. Nell’affioramento si è potuta definire l’anatomia della zona di taglio con associazioni di piani R, R’, P e tettoniti S-C. 5) La ricostruzione della sezione geologica ci ha permesso di riconoscere l’organizzazione degli strati coinvolti nella deformazione. Attraverso programmi appositi quali Georient e Software Carey sono stati ricostruiti gli assi di massima compressione tramite l’analisi meso-strutturale: essi testimoniano una compressione orientata NNW-SSE, in accordo con l’Evento Valsuganese del Serravalliano-Tortoniano, legato ad un asse compressivo N340 che rappresenta l’evento principale nella regione sudalpina, ma sono stati riconosciuti anche assi di compressione orientati NE-SW e circa E-W correlabili con l’Evento Insubrico del Miocene inf. e con l’Evento Scledense del Messiniano - Pliocene.

Dynamics of small interfering RNA - FRET based integrity measurements of siRNA in the cuvette & inside cells

RNAi ist ein bedeutendes Werkzeug zur Funktionsanalyse von Genen und hat großes Potential für den Einsatz in der Therapie. Obwohl effiziente Knockdowns in der Zellkultur erzielt werden, erweist sich eine in vivo Anwendung als schwierig. Die großen Hürden sind dabei der Transport der siRNA ins Zielgewebe und deren voranschreitende Degradierung.rnMarkierte siRNA kann sowohl zur eigenen Integritätsmessung als auch zur Lokalisierung verwendet werden. Zwei Farbstoffe an den jeweiligen 3’- bzw. -5’-Enden des Sense- bzw. Antisense-Stranges erzeugen ein robustes FRET-System (Hirsch et al. 2012). Das Verhältnis von FRET- zu Donor-Signal, das R/G-Ratio, dient zur sensitiven Klassifizierung des Integritätslevels einer siRNA Probe (Järve et al. 2007; Hirsch et al. 2011; Kim et al. 2010). Mit diesem System kann eine Degradierung von weniger als 5 % in der Küvette und in Zellen nachgewiesen werden.rnDie vorliegende Arbeit beschäftigt sich mit der Evaluierung von potentiellen FRET Farbstoffpaaren hinsichtlich deren Eignung für in vitro und in vivo Anwendung. Verschiedenste FRET-Paare, die das gesamte sichtbare Spektrum abdecken, wurden evaluiert und ermöglichen nun die Auswahl eines geeigneten Paares für die jeweilige Anwendung oder Kombination mit anderen Farbstoffen.rnMit Hilfe von Alexa555/Atto647N siRNA wurde ein erfolgreicher Einschluss von siRNA in Liposomen beobachtet. Eine anschließende Evaluierung der RNase-Protektion ergab für Liposomen, Nanohydrogele und kationische Peptide hervorragende protektive Eigenschaften. Basierend auf den Ergebnisse können diese und andere Transportsysteme nun für eine zelluläre Aufnahme optimiert werden.rnAtto488/Atto590 zeigte die besten Eigenschaften für Echtzeit-Integritätsmessungen in der Lebendzellmikroskopie. Verringerte Bleicheigenschaften und minimaler spektraler “Cross-Talk” ermöglichten es, transfizierte Zellen über einen Zeitraum von bis zu 8 Stunden zu beobachten. Mittels Atto488/Atto590 siRNA wurde die Einschleusung und Freisetzung in Zellen in Echtzeit untersucht. Dabei konnten Freisetzung und Verteilung in einzelnen Zellen beobachtet und analysiert werden. rnAuf eine anfängliche Phase mit hoher Freisetzungsrate folgte eine Phase mit geringerer Rate für den restlichen Beobachtungszeitraum. Die durchschnittliche Verweildauer im Zytosol betrug 24 und 58 Minuten, wobei zwischen lang- und kurzanhaltenden Ereignissen unterschieden werden konnte. Obwohl ein Import von siRNA in den Zellkern beobachtet wurde, konnte kein Schema bzw. genauer Zeitpunkt, in Bezug auf den Transfektionszeitraum für diese Ereignisse bestimmt werden. Die beobachteten Freisetzungsprozesse fanden sporadisch statt und Änderungen in der zellulären Verteilung geschahen innerhalb von wenigen Minuten. Einmal freigesetzte siRNA verschwand mit der Zeit wieder aus dem Zytosol und es blieben nur kleine Aggregate von siRNA mit immer noch geringer Integrität zurück.rn

Impact of obesity on venous hemodynamics of the lower limbs

Obesity is a risk factor for chronic venous insufficiency and venous thromboembolism. The aim of this study was to compare venous flow parameters of the lower limbs assessed by duplex ultrasound scanning in obese and nonobese individuals according to body mass index (BMI).

Eosinophilic vasculitis: an inhabitual and resistant manifestation of a vasculitis

A 55-year-old woman was referred because of diffuse pruritic erythematous lesions and an ischemic process of the third finger of her right hand. She was known to have anaemia secondary to hypermenorrhea. She presented six months before admission with a cutaneous infiltration on the left cubital cavity after a paravenous leakage of intravenous iron substitution. She then reported a progressive pruritic erythematous swelling of her left arm and lower extremities and trunk. Skin biopsy of a lesion on the right leg revealed a fibrillar, small-vessel vasculitis containing many eosinophils.Two months later she reported Raynaud symptoms in both hands, with a persistent violaceous coloration of the skin and cold sensation of her third digit of the right hand. A round 1.5 cm well-delimited swelling on the medial site of the left elbow was noted. The third digit of her right hand was cold and of violet colour. Eosinophilia (19 % of total leucocytes) was present. Doppler-duplex arterial examination of the upper extremities showed an occlusion of the cubital artery down to the palmar arcade on the right arm. Selective angiography of the right subclavian and brachial arteries showed diffuse alteration of the blood flow in the cubital artery and hand, with fine collateral circulation in the carpal region. Neither secondary causes of hypereosinophilia nor a myeloproliferative process was found. Considering the skin biopsy results and having excluded other causes of eosinophilia, we assumed the diagnosis of an eosinophilic vasculitis. Treatment with tacrolimus and high dose steroids was started, the latter tapered within 12 months and then stopped, but a dramatic flare-up of the vasculitis with Raynaud phenomenon occurred. A new immunosuppressive approach with steroids and methotrexate was then introduced. This case of aggressive eosinophilic vasculitis is difficult to classify into the usual forms of vasculitis and constitutes a therapeutic challenge given the resistance to current immunosuppressive regimens.

High-throughput procedure for tick surveys of tick-borne encephalitis virus and its application in a national surveillance study in Switzerland

Tick-borne encephalitis (TBE), a viral infection of the central nervous system, is endemic in many Eurasian countries. In Switzerland, TBE risk areas have been characterized by geographic mapping of clinical cases. Since mass vaccination should significantly decrease the number of TBE cases, alternative methods for exposure risk assessment are required. We established a new PCR-based test for the detection of TBE virus (TBEV) in ticks. The protocol involves an automated, high-throughput nucleic acid extraction method (QIAsymphony SP system) and a one-step duplex real-time reverse transcription-PCR (RT-PCR) assay for the detection of European subtype TBEV, including an internal process control. High usability, reproducibility, and equivalent performance for virus concentrations down to 5 x 10(3) viral genome equivalents/microl favor the automated protocol compared to the modified guanidinium thiocyanate-phenol-chloroform extraction procedure. The real-time RT-PCR allows fast, sensitive (limit of detection, 10 RNA copies/microl), and specific (no false-positive test results for other TBEV subtypes, other flaviviruses, or other tick-transmitted pathogens) detection of European subtype TBEV. The new detection method was applied in a national surveillance study, in which 62,343 Ixodes ricinus ticks were screened for the presence of TBE virus. A total of 38 foci of endemicity could be identified, with a mean virus prevalence of 0.46%. The foci do not fully agree with those defined by disease mapping. Therefore, the proposed molecular test procedure constitutes a prerequisite for an appropriate TBE surveillance. Our data are a unique complement of human TBE disease case mapping in Switzerland.