Mechanisms of cell senescence: p21 and DNA damage response in aging and longevity

Theory of aging postulates that aging is a remodeling process where the body of survivors progressively adapts to internal and external damaging agents they are exposed to during several decades. Thus , stress response and adaptation mechanisms play a fundamental role in the aging process where the capability of adaptating effects, certainly, also is related the lifespan of each individual. A key gene linking aging to stress response is indeed p21, an induction of cyclin-dependent kinase inhibitor which triggers cell growth arrest associated with senescence and damage response and notably is involved in the up-regulation of multiple genes that have been associated with senescence or implicated in age-related . This PhD thesis project that has been performed in collaboration with the Roninson Lab at Ordway Research Institute in Albany, NY had two main aims: -the testing the hypothesis that p21 polymorphisms are involved in longevity -Evaluating age-associated differences in gene expression and transcriptional response to p21 and DNA damage In the first project, trough PCR-sequencing and Sequenom strategies, we we found out that there are about 30 polymorphic variants in the p21 gene. In addition, we found an haplotpype located in -5kb region of the p21 promoter whose frequency is ~ 2 fold higher in centenarians than in the general population (Large-scale analysis of haplotype frequencies is currently in progress). Functional studies I carried out on the promoter highilighted that the ―centenarian‖ haplotype doesn’t affect the basal p21 promoter activity or its response to p53. However, there are many other possible physiological conditions in which the centenarian allele of the p21 promoter may potentially show a different response (IL6, IFN,progesterone, vitamin E, Vitamin D etc). In the second part, project #2, trough Microarrays we seeked to evaluate the differences in gene expression between centenarians, elderly, young in dermal fibroblast cultures and their response to p21 and DNA damage. Microarray analysis of gene expression in dermal fibroblast cultures of individuals of different ages yielded a tentative "centenarian signature". A subset of genes that were up- or downregulated in centenarians showed the same response to ectopic expression of p21, yielding a putative "p21-centenarian" signature. Trough RQ-PCR (as well Microarrays studies whose analysis is in progress) we tested the DNA damage response of the p21-centenarian signature genes showing a correlation stress/aging in additional sets of young and old samples treated with p21-inducing drug doxorubicin thus finding for a subset of of them , a response to stress age-related.

Sensori chimici basati su molecole e nanoparticelle

Con questo lavoro di tesi si è cercato da un lato di dare un contributo al settore dei sensori chimici, caratterizzando e sviluppando diversi sistemi che presentano promettenti proprietà per l’utilizzo nella realizzazione di sensori luminescenti, e dall’altro di studiare sistemi di nanoparticelle di oro per identificarne e caratterizzarne i processi che portano all’interazione con un’unità fluorescente di riferimento, il pirene. Quest’ultima parte della tesi, sviluppata nel capitolo 4, sebbene possa apparire “slegata” dall’ambito della sensoristica, in realtà non lo è in quanto il lavoro di ricerca svolto rappresenta una buona base di partenza per lo sviluppo di sistemi di nanoparticelle metalliche con un possibile impiego in campo biomedico e diagnostico. Tutte le specie studiate, seppur molto diverse tra loro, posseggono quindi buone caratteristiche di luminescenza ed interessanti capacità di riconoscimento, più o meno selettivo, di specie in soluzione o allo stato gassoso. L’approccio generale che è stato adottato comporta una iniziale caratterizzazione in soluzione ed una susseguente ottimizzazione del sistema mirata a passare al fissaggio su supporti solidi in vista di possibili applicazioni pratiche. A tal proposito, nel capitolo 3 è stato possibile ottenere un monostrato organico costituito da un recettore (un cavitando), dotato di una parte fluorescente le cui proprietà di luminescenza sono sensibili alla presenza di una funzione chimica che caratterizza una classe di analiti, gli alcoli. E’ interessante sottolineare come lo stesso sistema in soluzione si comporti in maniera sostanzialmente differente, mostrando una capacità di segnalare l’analita molto meno efficiente, anche in funzione di una diversa orientazione della parte fluorescente. All’interfaccia solido-gas invece, l’orientamento del fluoroforo gioca un ruolo chiave nel processo di riconoscimento, e ottimizzando ulteriormente il setup sperimentale e la composizione dello strato, sarà possibile arrivare a segnalare quantità di analita sempre più basse. Nel capitolo 5 invece, è stato preso in esame un sistema le cui potenzialità, per un utilizzo come sonda fluorescente nel campo delle superfici di silicio, sembra promettere molto bene. A tal proposito sono stati discussi anche i risultati del lavoro che ha fornito l’idea per la concezione di questo sistema che, a breve, verrà implementato a sua volta su superficie solida. In conclusione, le ricerche descritte in questa tesi hanno quindi contribuito allo sviluppo di nuovi chemosensori, cercando di migliorare sia le proprietà fotofisiche dell’unità attiva, sia quelle dell’unità recettrice, sia, infine, l’efficienza del processo di traduzione del segnale. I risultati ottenuti hanno inoltre permesso di realizzare alcuni prototipi di dispositivi sensoriali aventi caratteristiche molto promettenti e di ottenere informazioni utili per la progettazione di nuovi dispositivi (ora in fase di sviluppo nei laboratori di ricerca) sempre più efficienti, rispondendo in tal modo alle aspettative con cui questo lavoro di dottorato era stato intrapreso.

La sensitività delle curve a fatica oligociclica rispetto alle colate di derivazione per i provini: applicazione alla caratterizzazione di un materiale per cappe di turboalternatore

In questo studio vengono riportati i risultati di prove di fatica oligociclica eseguiti su provini dello stesso materiale ottenuti con uguali processi tecnologici ma provenienti da differenti colate di metallo. Il materiale in questione è un acciaio di elevata qualità frequentemente utilizzato per la realizzazione di cappe per turboalternatori. Obiettivo dello studio è stato ricavare i coefficienti necessari per tracciare le curve di fatica del materiale, non ancora presenti in letteratura, ed infine indagare la bontà del risultato ottenuto con un’analisi statistica delle curve e dei risultati ottenuti. Nella prima parte è descritto l’attuale stato dell’arte e la situazione in cui si colloca il presente studio. Nella seconda parte viene fornita una descrizione dettagliata del materiale studiato, delle condizioni nelle quali sono state eseguite le prove e delle attrezzature utilizzate a tale scopo. Si conclude esponendo i risultati ottenuti, comprensivi dei confronti e delle considerazioni derivate dalle analisi statistiche eseguite.

Caratterizzazione del legame di molecole di interesse farmaceutico alla sieroalbumina umana mediante biocromatografia e dicroismo circolare

Negli ultimi anni, un crescente numero di studiosi ha focalizzato la propria attenzione sullo sviluppo di strategie che permettessero di caratterizzare le proprietà ADMET dei farmaci in via di sviluppo, il più rapidamente possibile. Questa tendenza origina dalla consapevolezza che circa la metà dei farmaci in via di sviluppo non viene commercializzato perché ha carenze nelle caratteristiche ADME, e che almeno la metà delle molecole che riescono ad essere commercializzate, hanno comunque qualche problema tossicologico o ADME [1]. Infatti, poco importa quanto una molecola possa essere attiva o specifica: perché possa diventare farmaco è necessario che venga ben assorbita, distribuita nell’organismo, metabolizzata non troppo rapidamente, ne troppo lentamente e completamente eliminata. Inoltre la molecola e i suoi metaboliti non dovrebbero essere tossici per l’organismo. Quindi è chiaro come una rapida determinazione dei parametri ADMET in fasi precoci dello sviluppo del farmaco, consenta di risparmiare tempo e denaro, permettendo di selezionare da subito i composti più promettenti e di lasciar perdere quelli con caratteristiche negative. Questa tesi si colloca in questo contesto, e mostra l’applicazione di una tecnica semplice, la biocromatografia, per caratterizzare rapidamente il legame di librerie di composti alla sieroalbumina umana (HSA). Inoltre mostra l’utilizzo di un’altra tecnica indipendente, il dicroismo circolare, che permette di studiare gli stessi sistemi farmaco-proteina, in soluzione, dando informazioni supplementari riguardo alla stereochimica del processo di legame. La HSA è la proteina più abbondante presente nel sangue. Questa proteina funziona da carrier per un gran numero di molecole, sia endogene, come ad esempio bilirubina, tiroxina, ormoni steroidei, acidi grassi, che xenobiotici. Inoltre aumenta la solubilità di molecole lipofile poco solubili in ambiente acquoso, come ad esempio i tassani. Il legame alla HSA è generalmente stereoselettivo e ad avviene a livello di siti di legame ad alta affinità. Inoltre è ben noto che la competizione tra farmaci o tra un farmaco e metaboliti endogeni, possa variare in maniera significativa la loro frazione libera, modificandone l’attività e la tossicità. Per queste sue proprietà la HSA può influenzare sia le proprietà farmacocinetiche che farmacodinamiche dei farmaci. Non è inusuale che un intero progetto di sviluppo di un farmaco possa venire abbandonato a causa di un’affinità troppo elevata alla HSA, o a un tempo di emivita troppo corto, o a una scarsa distribuzione dovuta ad un debole legame alla HSA. Dal punto di vista farmacocinetico, quindi, la HSA è la proteina di trasporto del plasma più importante. Un gran numero di pubblicazioni dimostra l’affidabilità della tecnica biocromatografica nello studio dei fenomeni di bioriconoscimento tra proteine e piccole molecole [2-6]. Il mio lavoro si è focalizzato principalmente sull’uso della biocromatografia come metodo per valutare le caratteristiche di legame di alcune serie di composti di interesse farmaceutico alla HSA, e sul miglioramento di tale tecnica. Per ottenere una miglior comprensione dei meccanismi di legame delle molecole studiate, gli stessi sistemi farmaco-HSA sono stati studiati anche con il dicroismo circolare (CD). Inizialmente, la HSA è stata immobilizzata su una colonna di silice epossidica impaccata 50 x 4.6 mm di diametro interno, utilizzando una procedura precedentemente riportata in letteratura [7], con alcune piccole modifiche. In breve, l’immobilizzazione è stata effettuata ponendo a ricircolo, attraverso una colonna precedentemente impaccata, una soluzione di HSA in determinate condizioni di pH e forza ionica. La colonna è stata quindi caratterizzata per quanto riguarda la quantità di proteina correttamente immobilizzata, attraverso l’analisi frontale di L-triptofano [8]. Di seguito, sono stati iniettati in colonna alcune soluzioni raceme di molecole note legare la HSA in maniera enantioselettiva, per controllare che la procedura di immobilizzazione non avesse modificato le proprietà di legame della proteina. Dopo essere stata caratterizzata, la colonna è stata utilizzata per determinare la percentuale di legame di una piccola serie di inibitori della proteasi HIV (IPs), e per individuarne il sito(i) di legame. La percentuale di legame è stata calcolata attraverso il fattore di capacità (k) dei campioni. Questo parametro in fase acquosa è stato estrapolato linearmente dal grafico log k contro la percentuale (v/v) di 1-propanolo presente nella fase mobile. Solamente per due dei cinque composti analizzati è stato possibile misurare direttamente il valore di k in assenza di solvente organico. Tutti gli IPs analizzati hanno mostrato un’elevata percentuale di legame alla HSA: in particolare, il valore per ritonavir, lopinavir e saquinavir è risultato maggiore del 95%. Questi risultati sono in accordo con dati presenti in letteratura, ottenuti attraverso il biosensore ottico [9]. Inoltre, questi risultati sono coerenti con la significativa riduzione di attività inibitoria di questi composti osservata in presenza di HSA. Questa riduzione sembra essere maggiore per i composti che legano maggiormente la proteina [10]. Successivamente sono stati eseguiti degli studi di competizione tramite cromatografia zonale. Questo metodo prevede di utilizzare una soluzione a concentrazione nota di un competitore come fase mobile, mentre piccole quantità di analita vengono iniettate nella colonna funzionalizzata con HSA. I competitori sono stati selezionati in base al loro legame selettivo ad uno dei principali siti di legame sulla proteina. In particolare, sono stati utilizzati salicilato di sodio, ibuprofene e valproato di sodio come marker dei siti I, II e sito della bilirubina, rispettivamente. Questi studi hanno mostrato un legame indipendente dei PIs ai siti I e II, mentre è stata osservata una debole anticooperatività per il sito della bilirubina. Lo stesso sistema farmaco-proteina è stato infine investigato in soluzione attraverso l’uso del dicroismo circolare. In particolare, è stato monitorata la variazione del segnale CD indotto di un complesso equimolare [HSA]/[bilirubina], a seguito dell’aggiunta di aliquote di ritonavir, scelto come rappresentante della serie. I risultati confermano la lieve anticooperatività per il sito della bilirubina osservato precedentemente negli studi biocromatografici. Successivamente, lo stesso protocollo descritto precedentemente è stato applicato a una colonna di silice epossidica monolitica 50 x 4.6 mm, per valutare l’affidabilità del supporto monolitico per applicazioni biocromatografiche. Il supporto monolitico monolitico ha mostrato buone caratteristiche cromatografiche in termini di contropressione, efficienza e stabilità, oltre che affidabilità nella determinazione dei parametri di legame alla HSA. Questa colonna è stata utilizzata per la determinazione della percentuale di legame alla HSA di una serie di poliamminochinoni sviluppati nell’ambito di una ricerca sulla malattia di Alzheimer. Tutti i composti hanno mostrato una percentuale di legame superiore al 95%. Inoltre, è stata osservata una correlazione tra percentuale di legame è caratteristiche della catena laterale (lunghezza e numero di gruppi amminici). Successivamente sono stati effettuati studi di competizione dei composti in esame tramite il dicroismo circolare in cui è stato evidenziato un effetto anticooperativo dei poliamminochinoni ai siti I e II, mentre rispetto al sito della bilirubina il legame si è dimostrato indipendente. Le conoscenze acquisite con il supporto monolitico precedentemente descritto, sono state applicate a una colonna di silice epossidica più corta (10 x 4.6 mm). Il metodo di determinazione della percentuale di legame utilizzato negli studi precedenti si basa su dati ottenuti con più esperimenti, quindi è necessario molto tempo prima di ottenere il dato finale. L’uso di una colonna più corta permette di ridurre i tempi di ritenzione degli analiti, per cui la determinazione della percentuale di legame alla HSA diventa molto più rapida. Si passa quindi da una analisi a medio rendimento a una analisi di screening ad alto rendimento (highthroughput- screening, HTS). Inoltre, la riduzione dei tempi di analisi, permette di evitare l’uso di soventi organici nella fase mobile. Dopo aver caratterizzato la colonna da 10 mm con lo stesso metodo precedentemente descritto per le altre colonne, sono stati iniettati una serie di standard variando il flusso della fase mobile, per valutare la possibilità di utilizzare flussi elevati. La colonna è stata quindi impiegata per stimare la percentuale di legame di una serie di molecole con differenti caratteristiche chimiche. Successivamente è stata valutata la possibilità di utilizzare una colonna così corta, anche per studi di competizione, ed è stata indagato il legame di una serie di composti al sito I. Infine è stata effettuata una valutazione della stabilità della colonna in seguito ad un uso estensivo. L’uso di supporti cromatografici funzionalizzati con albumine di diversa origine (ratto, cane, guinea pig, hamster, topo, coniglio), può essere proposto come applicazione futura di queste colonne HTS. Infatti, la possibilità di ottenere informazioni del legame dei farmaci in via di sviluppo alle diverse albumine, permetterebbe un migliore paragone tra i dati ottenuti tramite esperimenti in vitro e i dati ottenuti con esperimenti sull’animale, facilitando la successiva estrapolazione all’uomo, con la velocità di un metodo HTS. Inoltre, verrebbe ridotto anche il numero di animali utilizzati nelle sperimentazioni. Alcuni lavori presenti in letteratura dimostrano l’affidabilita di colonne funzionalizzate con albumine di diversa origine [11-13]: l’utilizzo di colonne più corte potrebbe aumentarne le applicazioni.

Conoscenza e consapevolezza sugli effetti biologici degli ultrasuoni nella pratica clinica in Italia: risultati di una inchiesta con questionario tra ecografisti della socetà italiana di ultrasonologia in medicina e biologia (S.I.U.M.B.)

Background New potential hazards in the use of ultrasound (US) are implied in new diagnostic applications of US, such as contrast enhanced US. Aim To assess the level of awareness and knowledge on safety issues of clinical use of US among physicians who are members of the Italian National Society for Ultrasound (SIUMB) Materials and methods A questionnaire including 11 multiple choice quiz was sent by e-mail to members of SIUMB, who preliminarly agreed to participate in this initiative. The answers were received anonimously and statistically analyzed. Results The number of returned valid questionnaires was 97 (8 were considered not valid for less than 10 answers filled). Mean age of the responders was 44 years old, and the average time the physician has been performing ultrasound examinations was 13 years. The principal workplace (70%) was a public Hospital. Physicians seemed to know the general definitions of principal safety-parameters, but few of them knew the definition of specific indexes. There was a general knowledge about the safe use of ultrasound in obstetrics, but there was a poor knowledge of biological effects of US: only about 37% answered correctly to questions about damage of vasculature of lung by high Mechanical Index US investigation and about the increase of temperature under the probe, according to the thermal indexes. Conclusion In conclusion the present findings indicate that greater efforts of National Ultrasound Societies are warranted in disseminating knowledge about the bio-effects of diagnostic ultrasound modalities among their members to prevent possible hazards.

Habitat shifts: an experimental study on disappearing canopies of Cystoseira barbata (Stackhouse) C. Agard and the habitat replacing them

Cambiamenti di habitat in ambienti marini: uno studio sperimentale sulla perdita di foreste a Cystoseira barbata (Stackhouse) C. Agardh e sui popolamenti che le sostituiscono La presente tesi affronta il tema scientifico generale di come prevedere e mitigare la perdita di habitat marini naturali causata dalle attività umane. La tesi si è focalizzata sugli habitat subtidali a “canopy” formati da macroalghe brune a tallo eretto dell’ordine Fucales, che per morfologia, ruolo ed importanza ecologica possono essere paragonate alle “foreste” in ambienti terrestri temperati. Questi sistemi sono tra i più produttivi in ambienti marini, e sono coinvolti in importanti processi ecologici, offrendo cibo, protezione, riparo ed ancoraggio a diverse altre specie animali e vegetali, modificando i gradienti naturali di luce, sedimentazione e idrodinamismo, e partecipando al ciclo dei nutrienti. Sulle coste temperate di tutto il mondo, le foreste di macroalghe a canopy sono in forte regressione su scala locale, regionale e globale. Questo fenomeno, che sta accelerando a un ritmo sempre più allarmante, sta sollevando interesse e preoccupazione. Infatti, data la loro importanza, la perdita di questi habitat può avere importanti conseguenze ecologiche ed economiche, tra cui anche il possibile declino della pesca che è stato osservato in alcune aree in seguito alla conseguente riduzione della produttività complessiva dei sistemi marini costieri. Nel Mar Mediterraneo questi tipi di habitat sono originati prevalentemente da alghe appartenenti al genere Cystoseira, che sono segnalate in forte regressione in molte regioni. Gli habitat a Cystoseira che ancora persistono continuano ad essere minacciati da una sineregia di impatti antropici, ed i benefici complessivi delle misure di protezione fin ora attuate sono relativamente scarsi. Scopo della presente tesi era quello di documentare la perdita di habitat a Cystoseira (prevalentemente Cystoseira barbata (Stackhouse) C. Agardh) lungo le coste del Monte Conero (Mar Adriatico centrale, Italia), e chiarire alcuni dei possibili meccanismi alla base di tale perdita. Studi precedentemente condotti nell’area di studio avevano evidenziato importanti cambiamenti nella composizione floristica e della distribuzione di habitat a Cystoseira in quest’area, e avevano suggerito che la scarsa capacità di recupero di questi sistemi potesse essere regolata da interazioni tra Cystoseira e le nuove specie dominanti sui substrati lasciati liberi dalla perdita di Cystoseira. Attraverso ripetute mappature dell’habitat condotte a partire da Luglio 2008 fino a Giugno 2010, ho documentato la perdita progressiva delle poche, e sempre più frammentate, patch di habitat originate da questa specie in due siti chiamati La Vela e Due Sorelle. Attraverso successivi esperimenti, ho poi evidenziato le interazioni ecologiche tra le specie dominanti coinvolte in questi cambiamenti di habitat, al fine di identificare possibili meccanismi di feedback che possano facilitare la persistenza di ciascun habitat o, viceversa, l’insediamento di habitat alternativi. La mappatura dell’habitat ha mostrato un chiaro declino della copertura, della densità e della dimensione degli habitat a Cystoseira (rappresentati soprattutto dalla specie C. barbata e occasionalmente C. compressa che però non è stata inclusa nei successivi esperimenti, d’ora in avanti per semplicità verrà utilizzato unicamente il termine Cystoseira per indicare questo habitat) durante il periodo di studio. Nel sito Due Sorelle le canopy a Cystoseira sono virtualmente scomparse, mentre a La Vela sono rimaste poche, sporadiche ed isolate chiazze di Cystoseira. Questi habitat a canopy sono stati sostituiti da nuovi habitat più semplici, tra cui soprattutto letti di mitili, feltri algali e stand monospecifici di Gracilaira spp.. La mappatura dell’habitat ha inoltre sottolineato una diminuzione del potenziale di recupero del sistema con un chiaro declino del reclutamento di Cystoseira durante tutto il periodo di studio. Successivamente ho testato se: 1) una volta perse, il recupero di Cystoseira (reclutamento) possa essere influenzato dalle interazioni con le nuove specie dominanti, quali mitili e feltri algali; 2) il reclutamento di mitili direttamente sulle fronde di Cystoseira (sia talli allo stadio adulto che giovanili) possa influenzare la sopravvivenza e la crescita della macroalga; 3) la sopravvivenza e la crescita delle nuove specie dominanti, in particolare mitili, possa essere rallentata dalla presenza di canopy di Cystoseira. I risultati dimostrano che le nuove specie dominanti insediatesi (feltri algali e mitili), possono inibire il reclutamento di Cystoseira, accelerandone il conseguente declino. L’effetto diretto dei mitili sulle fronde non è risultato particolarmente significativo né per la sopravvivenza di Cystoseira che finora non è risultata preclusa in nessun stadio di sviluppo, né per la crescita, che nel caso di individui adulti è risultata leggermente, ma non significativamente, più elevata per le fronde pulite dai mitili, mentre è stato osservato il contrario per i giovanili. La presenza di canopy a Cystoseira, anche se di piccole dimensioni, ha limitato la sopravvivenza di mitili. Questi risultati complessivamente suggeriscono che una foresta di macroalghe in buone condizioni può avere un meccanismo di autoregolazione in grado di facilitare la propria persistenza. Quando però il sistema inizia a degradarsi e a frammentarsi progressivamente, i cambiamenti delle condizioni biotiche determinati dall’aumento di nuove specie dominanti contribuiscono alla mancanza di capacità di recupero del sistema. Pertanto le strategie per una gestione sostenibile di questi sistemi dovrebbero focalizzarsi sui primi segnali di cambiamenti in questo habitat e sui possibili fattori che ne mantengono la resilienza.

Analisi sperimentale e verifica di fattibilità di elementi strtturali rinforzati con fibre naturali

Campagna sperimentale e ricerca bibliografica su elementi rinforzati con fibre naturali, in particolare fibre di canapa. Definizione delle caratteristiche meccaniche e comportamento a trazione.