Susceptibility of Cebus apella monkey (Primates: Cebidae) to experimental Leishmania (L.) infantum chagasi-infection

Na Amazônia Brasileira, o macaco Cebus apella (Primata: Cebidae) tem sido associado com o ciclo enzoótico da Leishmania (V.) shawi, um parasito dermotrópico causador da Leishmaniose Tegumentar Americana (LTA). Ele tem sido também empregado com sucesso como modelo experimental para estudo da leishmaniose tegumentar. Neste trabalho, foi investigada sua susceptibilidade à infecção experimental por Leishmania (L.) infantum chagasi, o agente etiológico da Leishmaniose Visceral Americana (LVA). Foram usados dez espécimes de C. apella oito adultos e dois jovens, quatro machos e seis fêmeas, todos nascidos e criados em cativeiro. Dois protocolos de infecção experimental foram feitos: i) seis macacos foram inoculados por via intradérmica (ID), na base da cauda com 2x106 formas promastigotas em fase estacionária de crescimento; ii) outros quatro macacos foram inoculados com 3x107 formas amastigotas de infecção visceral de hamsteres por duas vias diferentes: a) dois por via intravenosa (IV) e, b) outros dois pela via intraperitoneal (IP). A avaliação da infecção incluiu parâmetros: clínico: exame físico do abdômen, peso e temperatura corporal; b) parasitológico: aspirado de medula óssea por agulha para procura de amastigotas (esfregaço corado por Giemsa) e formas promastigotas (meio de cultura); c) imunológico: Reação de Imunofluorescência Indireta (RIFI) e, resposta de hipersensibilidade tardia (DTH). Nos seis macacos inoculados ID (formas promastigotas) todos os parâmetros de avaliação da infecção foram negativos durante o período de 12 meses. Entre os quatro macacos inoculados com formas amastigotas, dois inoculados IV mostraram parasitos na medula óssea do primeiro ao sexto mês p.i. e em seguida houve a resolução da infecção, no entanto os outros dois inoculados IP foram totalmente negativos. Esses quatro macacos apresentaram resposta específica de anticorpo IgG desde o terceiro mês p.i. (IP: 1/80 e IV: 1/320) até o décimo segundo mês (IP: 1/160 e IV: 1/5120). A conversão DTH ocorreu em apenas um macaco inoculado IV com uma forte reação na pele (30 mm). Considerando esses resultados, nós não recomendamos o uso do macaco C. apella como modelo animal para estudo da LVA.

Efeito in vitro e in vivo do 5-hidroxi-2-hidroximetil-gama-pirona durante a infecção por Leishmania (Leishmania) amazonensis

As leishmanioses são um grupo de doenças infecciosas distribuídas mundialmente. A quimioterapia é o tratamento mais eficaz para a doença; apesar do grande número de drogas antileishmania disponíveis, são usualmente tóxicas, caras e requerem um longo período de tratamento. Portanto, torna-se necessária a busca de novas substâncias que sejam capazes de atuar sobre o protozoário sem causar danos ao hospedeiro, que tenham uma via de administração não invasiva e que, ainda, sejam viáveis economicamente. O ácido kójico, ou 5-hidroxi-2-hidroximetil-γ-pirona (HMP), é conhecido por inibir a enzima tirosinase no processo de produção da melanina, sendo extensivamente utilizado em cosméticos e também como tratamento tópico para melasma, não havendo citotoxicidade em humanos; entretanto, o potencial do HMP como agente antileishmania não é conhecido. O presente estudo analisou o efeito deste bioproduto em infecções por L. amazonensis in vitro e in vivo. O HMP promoveu a diminuição do crescimento de promastigotas e amastigotas em 62% (IC₅₀ 34μg/mL) e 79% (IC₅₀ 27,84 μg/mL) in vitro, respectivamente. A análise ultraestrutural de ambas as formas evolutivas tratadas com 50 μg/mL do HMP apresentaram corpos vesiculares no interior da bolsa flagelar, induziu uma intensa vacuolização intracelular bem como alterações mitocondriais. O estudo in vitro também demonstrou que o HMP foi capaz de reverter o efeito inibitório causado pela L. amazonensis no que diz respeito à produção de radicais de oxigênio. A análise histopatológica de lesões proveniente de animais submetidos ao tratamento tópico com o HMP demonstrou que o tecido apresentou um intenso processo de cicatrização. Além disso, fibras colágenas foram encontradas de maneira organizada no local da infecção de animais tratados, com um pequeno infiltrado celular e diminuição do número de parasitos. Tendo em vista a ação seletiva do HMP in vitro, o processo de ativação da célula hospedeira pelo bioproduto e a diminuição do número de parasitos observados durante o tratamento com a pomada, e pelo fato do HMP ser amplamente utilizado como agente antimelasma em humanos, esse metabólito pode ser promissor como tratamento tópico contra a Leishmaniose cutânea e apresentando grande potencial como agente leishmanicida.

Caracterização lipídica de duas cepas de Leishmania (Viannia) braziliensis causadoras da leishmaniose tegumentar americana

A leishmaniose tegumentar americana (LTA) constitui uma doença infecciosa causada por protozoários do gênero Leishmania com elevada incidência na região Amazônica. Uma variedade de espécies de leishmania é responsável por esta patologia. Desta forma, dependendo da espécie e da resposta imunológica do hospedeiro vertebrado, a doença pode apresentar diferentes formas clínicas, como a leishmaniose cutânea localizada (LCL) e a leishmaniose mucocutânea (LMC). A principal espécie responsável pela LTA é a Leishmania (Viannia) braziliensis. Contudo, devido à existência de uma multiplicidade de cepas desta espécie e ao reduzido número de estudos relacionados, torna-se importante o conhecimento dos aspectos metabólicos básicos do protozoário, como o metabolismo lipídico, na tentativa de caracterizar vias ou componentes fundamentais para seu desenvolvimento e infectividade. Desta forma, este trabalho teve como objetivo analisar distribuição de corpos lipídicos (CLs) e o perfil lipídico de duas cepas de L. (V.) braziliensis, isolada de diferentes casos clínicos, em diferentes períodos da fase estacionária do crescimento celular. As formas promastigotas das cepas M17593 (LCL) e M17323 (LMC) de L. (V.) braziliensis foram utilizadas na fase estacionária inicial (EST-I) e estacionária tardia (EST-T) de crescimento. Inicialmente, foi realizada análise ultraestrutural das formas promastigotas por microscopia eletrônica de transmissão (MET) e foram observadas estruturas sugestivas de CLs distribuídos no citoplasma do parasito, confirmados pela técnica citoquímica ósmio-imidazol, organelas necessárias para o metabolismo energético do parasito. Para quantificar a distribuição de CLs entre os dias de cultivo e entre as cepas, foi realizada análise por citometria de fluxo com Bodipy® 493/503. Os resultados indicaram que a cepa responsável pela LMC apresentou maior quantidade de CLs durante a fase estacionária tardia. Na cepa LCL não foi observado diferença significativa entre as fases estudadas. Assim, pode ser sugerido que a exacerbada resposta inflamatória que ocorre em pacientes com LMC, esteja relacionada com o acúmulo de CLs no parasito, fonte de energia e eicosanoides, como prostaglandinas. Outra hipótese é a possível correlação de CLs com a baixa exposição do fosfolipídio fosfatidilserina para a superfície externa da membrana, importante para a infectividade do parasito. Para análise dos lipídios totais, os parasitos foram submetidos à extração lipídica, seguido da técnica de HPTLC, onde foram encontrados predominantemente fosfolipídios, esterol esterificado, esteróis, triglicerídeos e ácidos graxos compondo o parasito, com variações entre as cepas e entre as fases estudadas. A cepa LCL na fase estacionária tardia possui maior quantidade de lipídios totais, que pode ser justificado por já ser conhecida como a cepa mais infectiva e possivelmente apresentar maior quantidade de glicoconjugados associados com subdomínios lipídicos importantes para o reconhecimento de fagócitos. É importante ressaltar que a maior infectividade da cepa LCL quando comparada à cepa LMC, resulta em um menor processo inflamatório. Estes resultados indicam que há uma variação no perfil lipídico e na distribuição de CLs entre as diferentes cepas de L. (V.) braziliensis, que pode estar relacionado com a infectividade do parasito e com a manifestação clinica da doença.

Leishmania (L.) amazonensis inibe a maturação e a função ativadora das células de Langerhans da pele tratadas com TNF-α e anti-CD40 in vitro

Leishmania amazonensis é um dos principais agentes etiológicos em um amplo espectro de formas clínicas da Leishmaniose Tegumentar Americana. De modo geral, a resistência frente às leishmanioses decorre do desenvolvimento de uma resposta imune celular eficiente, porém muitos estudos têm demonstrado que citocinas específicas ou combinações de citocinas podem ser fatores de resistência ou suscetibilidade à infecção por L. amazonensis. Estudos recentes sugerem a participação das células de Langerhans (LCs) nas resposta anti-Leishmania, porém os mecanismos envolvidos durante esta interação são ainda pouco estudados. Objetivos: Estudar o papel do TNF-α e anti-CD40 nas interações in vitro entre as LCs e L. amazonensis, observando o perfil de citocinas produzidas e a expressão de moléculas de superfície, bem como verificar a capacidade destas células em ativar a produção de IFN-γ e IL-4 por células do linfonodo. Metodologia: As LCs foram isoladas da epiderme de camundongos BALB/c e incubadas com promastigotas de L. amazonensis, TNF-α e/ou anti- CD40. Após 24h, as LCs foram co-cultivadas com células obtidas de linfonodos por 72h. As citocinas IL-6, IL-12, IFN-γ e IL-4 foram dosadas por ensaio imunoenzimático (ELISA) e as moléculas de superfície foram analisadas por citometria de fluxo. Resultados: Os níveis de IL- 6 e IL-12p70 produzidos pela LCs foram significativamente reduzidos após interação com L. amazonensis, mesmo após o tratamento das LCs com TNF-α ou anti-CD40. Em relação às moléculas de superfície, não houve diferença na expressão de CD207 em nenhum dos grupos, porém a presença de L. amazonensis promoveu uma redução significativa na expressão de CD40 nas LCs tratadas com TNF-α ou anti-CD40, e aumentou a expressão de CD86 em todos os grupos. Na presença de L. amazonensis, as células do linfonodo apresentaram uma produção diminuída de IFN-γ e não houve alteração na produção de IL-4. Quando cocultivadas com LCs estimuladas previamente com L. amazonensis, a produção de IFN-γ também foi reduzida, mesmo na presença dos estímulos TNF-α e/ou anti-CD40. Não foram observadas alterações significativas na produção de IL-4 pelas células do linfonodo cocultivadas nas mesmas condições experimentais. Conclusão: L. (L.) amazonensis exerce um efeito imunomodulador sobre a resposta imune mediada por LCs, inibindo a produção de IL-6 e IL-12p70 e expressão de CD40, além de impedir a ativação da produção de IFN-γ por células do linfonodo co-cultivadas com LCs, mesmo após tratamento com TNF-α e anticorpo anti-CD40.

Ação do alcaloide (+)-filantidina sobre o protozoário Leishmania (Leishmania) amazonensis e a célula hospedeira

A leishmaniose é uma doença de caráter antropozoonótico causada por parasitas do gênero Leishmania. Estes parasitas proliferam principalmente dentro de macrófagos de mamíferos e são responsáveis por promover uma diversidade de manifestações clínicas como Leishmaniose Cutânea (LC) e Leishmaniose Mucocutânea (LMC). O único tratamento utilizado para a leishmaniose é a quimioterapia, onde geralmente são utilizadas drogas tóxicas e com longo período de tratamento. O estudo de produtos naturais obtidos de plantas como agente leishmanicida desempenha um papel importante na busca de novas drogas para o tratamento da leishmaniose. A (+)-filantidina é um alcaloide extraído do caule da planta Margaritaria nobilis, pertencente a família Phyllanthaceae. Desta forma, objetivo deste estudo é avaliar os efeitos da (+)-filantidina sobre formas promastigotas de Leishmania (Leishmania) amazonensis e a célula hospedeira. A atividade antiproliferativa de formas promastigotas foi avaliada quando os parasitas foram tratados com 50, 100 e 200 μg/ml do alcaloide por 96 horas, com redução de 73,75%, 82,50% e 88,75% no número de parasitas respectivamente, quando comparados ao grupo controle sem tratamento. No período de 96 horas, foi observado um valor IC₅₀ de 56,34 μg/ml. A anfotericina B foi utilizada como droga de referência na concentração de 0,1 μg/ml, sendo observada redução de 100% dos parasitas durante as 96 horas de tratamento. O tratamento com o alcaloide promoveu alterações importantes nas promastigotas, mostradas através de microscopia eletrônica de transmissão e varredura. Foram observadas alterações no corpo celular, flagelo, cinetoplasto, mitocôndria, indução na formação de rosetas, presença de vesículas eletrodensas sugestivas de corpúsculos lipídicos e aumento no número de estruturas semelhantes a acidocalcisssomos. Com relação à célula hospedeira, não foi observado efeito citotóxico nos macrófagos tratados com alcaloide e análise por microscopia eletrônica de varredura mostrou que o alcaloide promoveu aumento no número de projeções citoplasmáticas, aumento do volume celular e espraiamento. Assim, estes resultados demonstram que a (+)-filantidina foi eficaz na redução do crescimento de formas promastigotas do protozoário, sendo eficaz na ativação de macrófagos sem causar efeito citotóxico para o mesmo, o que pode representar uma fonte alternativa para o tratamento da leishmaniose.

Visão geográfica integrada das estratégias de controle das leishmanioses no município de Teodoro Sampaio, SP, com o apoio do geoprocessamento

Pós-graduação em Geografia - FCT

Investigação de Leishmania SP em carrapatos de cães de bairros de Imperatriz-MA, através da Reação em Cadeia da Polimerase (PCR)

A Leishmaniose é uma doença causada pelo protozoário Leishmania sp, podendo acometer homem e animais dependendo da espécie do parasita, São transmitidos pelos flebotomíneos fêmeas, insetos do gênero Lutzomyia, que ao exercer o hematofagismo inoculam as formas promastigota infectantes, mas recentemente, tem sido levantado hipóteses sobre a transmissão por carrapatos. Segundo a vigilância epidemiológica de Imperatriz-MA a cidade é endêmica tanto para Leishmaniose Tegumentar (LT) quanto para a Leishmaniose Visceral (LV). Este trabalho teve como objetivo principal investigar a presença de DNA de Leishmania sp em carrapatos coletados de cães atendidos em petshop e Centro de Controle de Zoonoses do município de Imperatriz utilizando a técnica de PCR. O DNA foi extraído a partir de 640 carrapatos fêmeas e testadas utilizando o primer que amplifica o gene de mini-exon de Leishmania sp. Os carrapatos foram coletados de 41 cães de diferentes bairros da cidade de Imperatriz. A maioria dos carrapatos foram identificados como Rhipicephalus sanguineus. Os seguintes sinais clínicos sugestivos de leishmaniose foram observados nos cães: onicogrifose em 53,65% (22/41); úlceras em 63,41% (26/41), a perda de cabelo e inapetência em 39,02% (16/41). Cento e setenta carrapatos (26,56%) coletados de 16 cães apresentaram DNA de Leishmania do subgênero Viannia, responsável pela forma cutânea da doença. Não foi detectado nenhum DNA de Leishmania infantum chagasi. Carrapatos infectados foram coletados de ambos os cães sintomáticos e assintomáticos. Embora ainda não tenha sido demonstrado que os carrapatos possam transmitir Leishmania aos cães sob condições naturais, o resultado deste estudo tem vários aspectos importantes, pois é um método não-invasivo de detecção, capaz de diferenciar os grupos de parasitas em circulação, em especial se os animais não têm lesões, pode ser um indicador biológico em locais onde não é feito uma investigação sorológica e nem entomológica, podendo dar suporte aos programas de vigilância de saúde local.

Apresentação clínica, etiologia e distribuição geográfica da Leishmaniose tegumentar no município de Santarém, estado do Pará, Brasil

A leishmaniose tegumentar americana (LTA) é uma doença infecciosa que atinge pele e mucosas e que vem apresentando um aumento significativo em sua incidência nas últimas décadas, tem uma prevalência global de aproximadamente 1,5 milhões de casos anuais em todo o mundo. O presente estudo tem uma abordagem analítica, descritiva, transversal, com objetivo de estabelecer perfil clínico epidemiológico e correlações etiológicas da leishmaniose tegumentar em uma série de casos na região oeste do Pará. Na pesquisa foram incluídos 102 indivíduos apresentando manifestações clínicas de LTA, selecionados no período de outubro de 2009 a novembro de 2011, atendidos no Centro de Controle de Zoonoses no município de Santarém, estado do Pará. As variáveis foram analisadas a partir da aplicação do teste qui-quadrado de aderência, e apresentadas através de figuras e tabelas. Os resultados demonstram que prevaleceram as infecções em indivíduos do sexo masculino 85,29%, na faixa etária de 30 a 40 anos 32,35%, trabalhadores e moradores da área rural que exercem ocupações na sua maioria de lavradores 21,57%, apresentaram lesões únicas 63,72%, do tipo ulceradas 77,45%, localizadas nos membros inferiores em 58,82% dos casos, com tempo de evolução da doença em média de 02 meses 74,50%. Conclusão: Seis espécies de Leishmania foram identificadas, sendo o subgênero Viannia mais prevalente e a espécie predominante a L (V). braziliensis.

Compostos de Pd(II) contendo ligantes piridinicos: potencialidades biologicas e aspectos estruturais

Pós-graduação em Química - IQ

Sandflies (Diptera, Psychodidae) from forest areas in Botucatu municipality, central western Sao Paulo State, Brazil

Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e Tecnológico (CNPq)

Síntese e avaliação biológica de bioisósteros de nitrofural ativos contra Leishmania amazonensis

Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior (CAPES)

Attraction of the sand fly Nyssomyia neivai (Diptera: Psychodidae) to chemical compounds in a wind tunnel

Background: Similar to other hematophagous insects, male and female sand flies must feed on plants to obtain sugar and, subsequently, energy to complete their life cycles. A large number of compounds emitted by plants may act as volatile signals to these insects. Primary alcohols have been detected in some plants, but in small amounts. In a previous report, the attractiveness of saturated primary alcohols with 7 to 9 carbons was evaluated for Lutzomyia longipalpis, the vector of American visceral leishmaniasis, with positive results.Methods: In the present study, a wide range of primary alcohols, 3 to 10 carbons, were tested to investigate their attractiveness to another sand fly species, Nyssomyia neivai, a putative vector of American cutaneous leishmaniasis. The mixture of compounds that induced the best sand fly response was also evaluated.Results: Of the eight compounds evaluated, hexanol and octanol elicited the best attractive responses for sand fly females.Conclusion: Phytochemicals may be an interesting source of search for new sand fly attractants.

Techniques to improve the maintenance of a laboratory colony of Nyssomyia neivai (Diptera: Psychodidae)

Fundação de Amparo à Pesquisa do Estado de São Paulo (FAPESP)

Analysis of the protective potential of antigens released by Leishmania (Viannia) shawi promastigotes

Leishmania (Viannia) shawi causes cutaneous lesions in humans. Parasite antigens conferring significant protection against American tegumentar leishmaniosis (ATL) might be important for the development of effective vaccine. Therefore, this work evaluates the protective effect of antigenic fractions released by L. shawi. Antigens released by promastigotes to culture medium were concentrated and isolated by SDS-PAGE. The three main fractions LsPass1 (>75 kDa), LsPass2 (75-50 kDa) and LsPass3 (<50 kDa) were electro-eluted according with their molecular mass. Immunized BALB/c mice were challenged with L. shawi promastigotes and the course of infection monitored during 5 weeks. LsPass1-challenged mice showed no protection, however, a strong degree of protection associated to smaller lesions and high expression of IFN-gamma and TNF-alpha by CD4(+) T, CD8(+) T and double negative CD4CD8 cells was achieved in LsPass3-challenged mice. Furthermore, LsPass2-challenged mice showed an intermediated degree of protection associated to high levels of IFN-gamma, IL-4 and IL-10 mRNA. In spite of increased expression of IFN-gamma and TNF-alpha, high amounts of IL-4 and IL-10 mRNA were also detected in LsPass3-challenged mice indicating a possible contribution of these cytokines for the persistence of a residual number of parasites that may be important in inducing long-lasting immunity. Therefore, LsPass3 seems to be an interesting alternative that should be considered in the development of an effective vaccine against ATL.

Increased Expression of Regulatory T Cells and Down-Regulatory Molecules in Lepromatous Leprosy

T regulatory cells (Tregs) play an important role in the mechanism of host's failure to control pathogen dissemination in severe forms of different chronic granulomatous diseases, but their role in leprosy has not yet been elucidated; 28 newly diagnosed patients (16 patients with lepromatous leprosy and 12 patients with tuberculoid leprosy) and 6 healthy Mycobacterium leprae-exposed individuals (contacts) were studied. Tregs were quantified by flow cytometry (CD4+ CD25+ Foxp3+) in peripheral blood mononuclear cells stimulated in vitro with a M. leprae antigenic preparation and phytohemagglutinin as well as in skin lesions by immunohistochemistry. The lymphoproliferative (LPR), interleukin-10 (IL-10), and interferon-gamma (IFN-gamma) responses of the in vitro-stimulated peripheral blood mononuclear cells and the in situ expression of IL-10, transforming growth factor-beta (TGF-beta), and cytotoxic T-lymphocyte antigen 4 (CTLA-4) were also determined. We show that M. leprae antigens induced significantly lower LPR but significantly higher Treg numbers in lepromatous than tuberculoid patients and contacts. Mitogen-induced LPR and Treg frequencies were not significantly different among the three groups. Tregs were also more frequent in situ in lepromatous patients, and this finding was paralleled by increased expression of the antiinflammatory molecules IL-10 and CTLA-4 but not TGF-beta. In lepromatous patients, Tregs were intermingled with vacuolized hystiocyte infiltrates all over the lesion, whereas in tuberculoid patients, Tregs were rare. Our results suggest that Tregs are present in increased numbers, and they may have a pathogenic role in leprosy patients harboring uncontrolled bacillary multiplication but not in those individuals capable of limiting M. leprae growth.