Optimisation of antiretroviral therapy : pharmacokinetic and pharmacogenetic approaches

Les progrès de la thérapie antirétrovirale ont transformé l'infection par le VIH d'une condition inévitablement fatale à une maladie chronique. En dépit de ce succès, l'échec thérapeutique et la toxicité médicamenteuse restent fréquents. Une réponse inadéquate au traitement est clairement multifactorielle et une individualisation de la posologie des médicaments qui se baserait sur les facteurs démographiques et génétiques des patients et sur les taux sanguins totaux, libres et/ou cellulaires des médicaments pourrait améliorer à la fois l'efficacité et la tolérance de la thérapie, cette dernière étant certainement un enjeu majeur pour un traitement qui se prend à vie.L'objectif global de cette thèse était de mieux comprendre les facteurs pharmacocinétiques (PK) et pharmacogénétiques (PG) influençant l'exposition aux médicaments antirétroviraux (ARVs) nous offrant ainsi une base rationnelle pour l'optimisation du traitement antiviral et pour l'ajustement posologique des médicaments chez les patients VIH-positifs. Une thérapie antirétrovirale adaptée au patient est susceptible d'augmenter la probabilité d'efficacité et de tolérance à ce traitement, permettant ainsi une meilleure compliance à long terme, et réduisant le risque d'émergence de résistance et d'échec thérapeutique.A cet effet, des méthodes de quantification des concentrations plasmatiques totales, libres et cellulaires des ARVs ainsi que de certains de leurs métabolites ont été développées et validées en utilisant la chromatographie liquide coupée à la spectrométrie de masse en tandem. Ces méthodes ont été appliquées pour la surveillance des taux d'ARVs dans diverses populations de patients HIV-positifs. Une étude clinique a été initiée dans le cadre de l'étude VIH Suisse de cohorte mère-enfant afin de déterminer si la grossesse influence la cinétique des ARVs. Les concentrations totales et libres du lopînavir, de l'atazanavir et de la névirapine ont été déterminées chez les femmes enceintes suivies pendant leur grossesse, et celles-ci ont été trouvées non influencées de manière cliniquement significative par la grossesse. Un ajustement posologique de ces ARVs n'est donc pas nécessaire chez les femmes enceintes. Lors d'une petite étude chez des patients HIV- positifs expérimentés, la corrélation entre l'exposition cellulaire et plasmatique des nouveaux ARVs, notamment le raltégravir, a été déterminée. Une bonne corrélation a été obtenue entre taux plasmatiques et cellulaires de raltégravir, suggérant que la surveillance des taux totaux est un substitut satisfaisant. Cependant, une importante variabilité inter¬patient a été observée dans les ratios d'accumulation cellulaire du raltégravir, ce qui devrait encourager des investigations supplémentaires chez les patients en échec sous ce traitement. L'efficacité du suivi thérapeutique des médicaments (TDM) pour l'adaptation des taux d'efavirenz chez des patients avec des concentrations au-dessus de la cible thérapeutique recommandée a été évaluée lors d'une étude prospective. L'adaptation des doses d'efavirenz basée sur le TDM s'est montrée efficace et sûre, soutenant l'utilisation du TDM chez les patients avec concentrations hors cible thérapeutique. L'impact des polymorphismes génétiques des cytochromes P450 (CYP) 2B6, 2A6 et 3A4/5 sur la pharmacocinétique de l'efavirenz et de ces métabolites a été étudié : un modèle de PK de population intégrant les covariats génétiques et démographiques a été construit. Les variations génétiques fonctionnelles dans les voies de métabolisation principales (CYP2B6) et accessoires {CYP2A6et 3A4/S) de l'efavirenz ont un impact sur sa disposition, et peuvent mener à des expositions extrêmes au médicament. Un? ajustement des doses guidé par le TDM est donc recommandé chez ces patients, en accord avec les polymorphismes génétiques.Ainsi, nous avons démonté qu'en utilisant une approche globale tenant compte à la fois des facteurs PK et PG influençant l'exposition aux ARVs chez les patients infectés, il est possible, si nécessaire, d'individualiser la thérapie antirétrovirale dans des situations diverses. L'optimisation du traitement antirétroviral contribue vraisemblablement à une meilleure efficacité thérapeutique à iong terme tout en réduisant la survenue d'effets indésirables.Résumé grand publicOptimisation de la thérapie antirétrovirale: approches pharmacocinétiques et pharmacogénétiquesLes progrès effectués dans le traitement de l'infection par le virus de llmmunodéficienoe humaine acquise (VIH) ont permis de transformer une affection mortelle en une maladie chronique traitable avec des médicaments de plus en plus efficaces. Malgré ce succès, un certain nombre de patients ne répondent pas de façon optimale à leur traitement etyou souffrent d'effets indésirables médicamenteux entraînant de fréquentes modifications dans leur thérapie. Il a été possible de mettre en évidence que l'efficacité d'un traitement antirétroviral est dans la plupart des cas corrélée aux concentrations de médicaments mesurées dans le sang des patients. Cependant, le virus se réplique dans la cellule, et seule la fraction des médicaments non liée aux protéines du plasma sanguin peut entrer dans la cellule et exercer l'activité antirétrovirale au niveau cellulaire. Il existe par ailleurs une importante variabilité des concentrations sanguines de médicament chez des patients prenant pourtant la même dose de médicament. Cette variabilité peut être due à des facteurs démographiques et/ou génétiques susceptibles d'influencer la réponse au traitement antirétroviral.Cette thèse a eu pour objectif de mieux comprendre les facteurs pharmacologiques et génétiques influençant l'efficacité et ta toxicité des médicaments antirétroviraux, dans le but d'individualiser la thérapie antivirale et d'améliorer le suivi des patients HIV-positifs.A cet effet, des méthodes de dosage très sensibles ont été développées pour permettre la quantification des médicaments antirétroviraux dans le sang et les cellules. Ces méthodes analytiques ont été appliquées dans le cadre de diverses études cliniques réalisées avec des patients. Une des études cliniques a recherché s'il y avait un impact des changements physiologiques liés à la grossesse sur les concentrations des médicaments antirétroviraux. Nous avons ainsi pu démontrer que la grossesse n'influençait pas de façon cliniquement significative le devenir des médicaments antirétroviraux chez les femmes enceintes HIV- positives. La posologie de médicaments ne devrait donc pas être modifiée dans cette population de patientes. Par ailleurs, d'autres études ont portés sur les variations génétiques des patients influençant l'activité enzymatique des protéines impliquées dans le métabolisme des médicaments antirétroviraux. Nous avons également étudié l'utilité d'une surveillance des concentrations de médicament (suivi thérapeutique) dans le sang des patients pour l'individualisation des traitements antiviraux. Il a été possible de mettre en évidence des relations significatives entre l'exposition aux médicaments antirétroviraux et l'existence chez les patients de certaines variations génétiques. Nos analyses ont également permis d'étudier les relations entre les concentrations dans le sang des patients et les taux mesurés dans les cellules où le virus HIV se réplique. De plus, la mesure des taux sanguins de médicaments antirétroviraux et leur interprétation a permis d'ajuster la posologie de médicaments chez les patients de façon efficace et sûre.Ainsi, la complémentarité des connaissances pharmacologiques, génétiques et virales s'inscrit dans l'optique d'une stratégie globale de prise en charge du patient et vise à l'individualisation de la thérapie antirétrovirale en fonction des caractéristiques propres de chaque individu. Cette approche contribue ainsi à l'optimisation du traitement antirétroviral dans la perspective d'un succès du traitement à long terme tout en réduisant la probabilité des effets indésirables rencontrés. - The improvement in antirétroviral therapy has transformed HIV infection from an inevitably fatal condition to a chronic, manageable disease. However, treatment failure and drug toxicity are frequent. Inadequate response to treatment is clearly multifactorial and, therefore, dosage individualisation based on demographic factors, genetic markers and measurement of total, free and/or cellular drug level may increase both drug efficacy and tolerability. Drug tolerability is certainly a major issue for a treatment that must be taken indefinitely.The global objective of this thesis aimed at increasing our current understanding of pharmacokinetic (PK) and pharmacogenetic (PG) factors influencing the exposition to antirétroviral drugs (ARVs) in HIV-positive patients. In turn, this should provide us with a rational basis for antiviral treatment optimisation and drug dosage adjustment in HIV- positive patients. Patient's tailored antirétroviral regimen is likely to enhance treatment effectiveness and tolerability, enabling a better compliance over time, and hence reducing the probability of emergence of viral resistance and treatment failure.To that endeavour, analytical methods for the measurement of total plasma, free and cellular concentrations of ARVs and some of their metabolites have been developed and validated using liquid chromatography coupled with tandem mass spectrometry. These assays have been applied for the monitoring of ARVs levels in various populations of HIV- positive patients. A clinical study has been initiated within the frame of the Mother and Child Swiss HIV Cohort Study to determine whether pregnancy influences the exposition to ARVs. Free and total plasma concentrations of lopinavir, atazanavir and nevirapine have been determined in pregnant women followed during the course of pregnancy, and were found not influenced to a clinically significant extent by pregnancy. Dosage adjustment for these drugs is therefore not required in pregnant women. In a study in treatment- experienced HIV-positive patients, the correlation between cellular and total plasma exposure to new antirétroviral drugs, notably the HIV integrase inhibitor raltegravir, has been determined. A good correlation was obtained between total and cellular levels of raltegravir, suggesting that monitoring of total levels are a satisfactory. However, significant inter-patient variability was observed in raltegravir cell accumulation which should prompt further investigations in patients failing under an integrase inhibitor-based regimen. The effectiveness of therapeutic drug monitoring (TDM) to guide efavirenz dose reduction in patients having concentrations above the recommended therapeutic range was evaluated in a prospective study. TDM-guided dosage adjustment of efavirenz was found feasible and safe, supporting the use of TDM in patients with efavirenz concentrations above therapeutic target. The impact of genetic polymorphisms of cytochromes P450 (CYP) 2B6, 2A6 and 3A4/5 on the PK of efavirenz and its metabolites was studied: a population PK model was built integrating both genetic and demographic covariates. Functional genetic variations in main (CYP2B6) and accessory (2A6, 3A4/5) metabolic pathways of efavirenz have an impact on efavirenz disposition, and may lead to extreme drug exposures. Dosage adjustment guided by TDM is thus required in those patients, according to the pharmacogenetic polymorphism.Thus, we have demonstrated, using a comprehensive approach taking into account both PK and PG factors influencing ARVs exposure in HIV-infected patients, the feasibility of individualising antirétroviral therapy in various situations. Antiviral treatment optimisation is likely to increase long-term treatment success while reducing the occurrence of adverse drug reactions.

Protease-activated receptor 2 signalling promotes dendritic cell antigen transport and T cell activation in vivo

Rapport de synthèse : Le récepteur activé par protéase de type 2 (PAR2) intervient dans l'inflammation dans divers modèles expérimentaux de maladies inflammatoires et auto-immunes, mais le mécanisme par lequel il exerce cette fonction reste mal compris. PAR2 est exprimé sur des cellules endothéliales et immunitaires et a été impliqué dans la différentiation des cellules dendritiques (DC). Avec leur rôle central dans la réponse immune, les DC pourraient jouer un rôle clef, l'activation de PAR2 à leur surface modulant la réponse immune. Des recherches précédentes ont montré que PAR2 a un effet dans le développement et la maturation des DC de moelle osseuse in vitro, ainsi que dans la promotion de la réponse immune en allergie. Dans cette étude, nous avons évalué l'impact in vivo de l'activation de PAR2 sur les DC et les cellules T dans des souris déficientes en PAR2 (KO) en utilisant un peptide agoniste spécifique du PAR2 (AP2). L'activation de PAR2 a augmenté la fréquence de DC matures dans les ganglions lymphatiques 24 heures après l'administration d'AP2 d'une manière significative. En outre, ces DC avaient une expression augmentée des molécules de co-stimulation CD86 et du complexe majeur d'histocompatibilité type 2 (MHC-II). 48 heures après l'injection d'AP2, nous avons également observé une élévation significative des lymphocytes T CD4+ et CD8+ activés, (CD44+CD62-) dans ces ganglions. Des changements dans le profil d'activation des DC et des cellules T n'ont pas été observés au niveau de a rate. L'influence de la signalisation de PAR2 sur le transport d'antigène aux ganglions lymphatiques inguinaux a été évaluée dans le contexte d'hypersensibilité retardée de type IV. Les souris KO sensibilisées par peinture de la peau avec fluorescéine isothyocyanate (FITC) afin d'induire une hypersensibilité retardée avaient un pourcentage diminué de DC FITC+ dans les ganglions lymphatiques 24 heures après l'application du FITC en comparaison avec les souris sauvages avec le même fond génétique (0.47% vs 0.95% des cellules ganglionnaires totales). En conclusion, ces résultats démontrent que la signalisation de PAR2 favorise et renforce la maturation et le transport d'antigène par des DC .vers les ganglions lymphatiques ainsi que l'activation ultérieure des lymphocytes T, et de ce fait fournissent une explication pour l'effet pro inflammatoire de PAR2 dans les modèles animaux d'inflammation. Une meilleure compréhension de ce mécanisme de modulation du système immun via PAR2 peut s'avérer particulièrement utile pour le développement des vaccins, ainsi que pour la découverte de nouvelles cibles thérapeutiques dans le contexte de l'allergie, l'auto-immunité, et les maladies inflammatoires.

The role of Malt1 proteolytic activity in T cell activation and lymphoma development

Abstract Long term contact with pathogens induces an adaptive immune response, which is mainly mediated by T and B cells. Antigen-induced activation of T and B cells is an important event, since it facilitates the transition of harmless, low proliferative lymphocytes into powerful and fast expanding cells, which can, if deregulated, be extremely harmful and dangerous for the human body. One of the most important events during lymphocyte activation is the induction of NF-xB activity, a transcription factor that controls not only cytokine secretion, but also lymphocyte proliferation and survival. Recent discoveries identified the CBM complex as the central regulator of NF-xB activity in lymphocytes. The CBM complex consists of the three proteins Carma1, Bcl10 and Malt1, in which Carma1 serves as recruitment platform of the complex and Bcl10 as an adaptor to recruit Malt1 to this platform. But exactly how Malt1 activates NF-x6 is still poorly understood. We discovered that Malt1 is a protease, which cleaves its interaction partner Bcl10 upon T and B cell stimulation. We mapped the Bcl10 cleavage site by single point mutations as well as by a proteomics approach, and used this knowledge to design a fluorogenic Malt1 reporter peptide. With this tool were we able to the first time demonstrate proteolytic activity of Malt1 in vitro, using recombinant Malt1, and in stimulated T cells. Based on similarities to a metacaspase, we designed a Malt1inhibitor, which allowed unto investigate the role of Malt1 activity in T cells. Malt1-inhibited T cells showed a clear defect in NF-xB activity, resulting in impaired IL-2 cytokine secretion levels. We also found a new unexpected role for Bcl10; the blockade of Bcl10 cleavage resulted in a strongly impaired capability of stimulated T cells to adhere to the extracellular matrix protein fibronectin. Because of the central position of the C8M complex, it is not surprising that different lymphomas show abnormal expressions of Carma1, Bcl10 and Malt1. We investigated the role of Malt1 proteolytic activity in the most aggressive subtype of diffuse large B cell lymphomas called ABC, which was described to depend on the expression of Carmal, and frequently carries oncogenic Carmal mutations. We found constitutive high Malt1 activity in all tested ABC cell lines visualized by detection of cleavage products of Malt1 substrates. With the use of the Malt1-inhibitor, we could demonstrate that Malt-inhibition in those cells had two effects. First, the tumor cell proliferation was decreased, most likely because of lower autocrine stimulation by cytokines. Second, we could sensitize the ABC cells towards cell death, which is most likely caused by reduced expression of prosurvival NF-xB target gens. Taken together, we identified Malt1 as a protease in T and B cells, demonstrated its importance for NF-xB signaling and its deregulation in a subtype of diffuse large B cell lymphoma. This could allow the development of a new generation of immunomodulatory and anti-cancer drugs. Résumé Un contact prolongé avec des pathogènes provoque une réponse immunitaire adaptative qui dépend principalement des cellules T et 8. L'activation des lymphocytes T et B, suite à la reconnaissance d'un antigène, est un événement important puisqu'il facilite la transition pour ces cellules d'un état de prolifération limitée et inoffensive à une prolifération soutenue et rapide. Lorsque ce mécanisme est déréglé ìl peut devenir extrêmement nuisible et dangereux pour le corps humain. Un des événement les plus importants lors de l'activation des lymphocytes est l'induction du facteur de transcription NFxB, qui organise la sécrétion de cytokines ainsi que la prolifération et la survie des lymphocytes. Le complexe CBM, composé des trois protéines Carmai, Bc110 et Malt1, a été récemment identifié comme un régulateur central de l'activité de NF-x8 dans les lymphocytes. Carma1 sert de plateforme de recrutement pour ce complexe alors que Bc110 permet d'amener Malt1 dans cette plateforme. Cependant, le rôle exact de Malt1 dans l'activation de NF-tcB reste encore mal compris. Nous avons découvert que Malt1 est une protéase qui clive son partenaire d'interaction BcI10 après stimulation des cellules T et B. Nous avons identifié le site de clivage de BcI10 par une série de mutations ponctuelles ainsi que par une approche protéomique, ce qui nous a permis de fabriquer un peptide reporteur fluorogénique pour mesurer l'activité de Malt1. Grâce à cet outil, nous avons démontré pour la première fois l'activité protéolytique de Malt1 in vitro à l'aide de protéines Malt1 recombinantes ainsi que dans des cellules T stimulées. La ressemblance de Malt1 avec une métacaspase nous a permis de synthétiser un inhibiteur de Malt1 et d'étudier ainsi le rôle de l'activité de Malt1 dans les cellules T. L'inhibition de Malt1 dans les cellules T a révélé un net défaut de l'activité de NF-x8, ayant pour effet une sécrétion réduite de la cytokine IL-2. Nous avons également découvert un rôle inattendu pour Bcl10: en effet, bloquer le clivage de Bcl10 diminue fortement la capacité d'adhésion des cellules T stimulées à la protéine fïbronectine, un composant de la matrice extracellulaire. En raison de la position centrale du complexe CBM, il n'est pas étonnant que le niveau d'expression de Carmai, Bcl10 et Malt1 soit anormal dans plusieurs types de lymphomes. Nous avons examiné le rôle de l'activité protéolytique de Malt1 dans le sous-type le plus agressif des lymphomes B diffus à grandes cellules, appelé sous-type ABC. Ce sous-type de lymphomes dépend de l'expression de Carmai et présente souvent des mutations oncogéniques de Carma1. Nous avons démontré que l'activité de Malt1 était constitutivement élevée dans toutes les lignées cellulaires de type ABC testées, en mettant en évidence la présence de produits de clivage de différents substrats de Malt1. Enfin, l'utilisation de l'inhibiteur de Malt1 nous a permis de démontrer que l'inhibition de Malt1 avait deux effets. Premièrement, une diminution de la prolifération des cellules tumorales, probablement dûe à leur stimulation autocrine par des cytokines fortement réduite. Deuxièmement, une sensibilisation des cellules de type ABC à ia mort cellulaire, vraisemblablement causée par l'expression diminuée de gènes de survie dépendants de NF-tcB. En résumé, nous avons identifié Malt1 comme une protéase dans les cellules T et B, nous avons mis en évidence son importance pour l'activation de NF-xB ainsi que les conséquences du dérèglement de l'activité de Malt1 dans un sous-type de lymphome B diffus à larges cellules. Notre étude ouvre ainsi la voie au développement d'une nouvelle génération de médicaments immunomodulateurs et anti-cancéreux.

Development of Ewing's sarcoma from primary bone marrow-derived mesenchymal stem cells

SUMMARY : Ewing's sarcoma is a member of Ewing's family tumors (ESPY) and the second most common solid bone and soft tissue malignancy of children and young adults. It is associated in 85% of cases with the t(11;22)(q24:q12) chromosomal translocation that generates fusion of the 5' segment of the EWSR1 gene with the 3' segment of the ETS family gene FLI-1. The EWSR1-FLI-1 fusion protein behaves as an aberrant transcriptional activator and is believed to contribute to ESFT development. However, EWSR1-FLI-1 induces growth arrest and apoptosis in normal fibroblasts, and primary cells that are pemissive for its putative oncogenic properties have not been discovered, hampering basic understanding of ESFT biology. Here, we show that EWSR1-FLI-1 alone can transform mouse primary bone marrow-derived mesenchymal progenitor cells and generate tumors that display hallmarks of Ewing's sarcoma, including a small round cell phenotype, expression of ESFT-associated markers, insulin like growth factor-I dependence, and induction or repression of numerous EWSR1-FLI-1 target genes. Consistent with this finding, we tested the possibility that human mesenchymal stem cells (hMSC) might also provide a permissive cellular environment for EWSR1-FLI-1, and could represent the first adequate primary human cellular background for the oncogenic properties of the fusion protein. Indeed, expression of EWSR1-FLI-1 in human mesenchymal stem cells (hMSC) was not only stably maintained without inhibiting proliferation, but induced a gene expression profile bearing striking similarity to that of ESFT, including genes that are among the highest ESFT discriminators. Expression of EWSR1-FLI-1 in hMSCs may recapitulate the initial steps of Ewing's sarcoma development, allowing identification of genes that play an important role early in its pathogenesis. Among relevant candidate transcripts induced by EWSR1-FL/-1 in hMSC we found the polycomb group gene EZH2 which we show to play a critical role in Ewing's sarcoma growth. These observations provide the first identification of candidate primary cells from which ESFTs originate and suggest that EWSR1-FLI-1 expression may constitute the initiating event in ESFT pathogenesis. Le sarcome d' Ewing est un membre de la famille des tumeurs Ewing (ESFT) et représente la deuxième tumeur maligne solide de l'os et des tissus mous chez les enfants et les jeunes adultes. Cette tumeur est associée dans 85% des cas avec la translocation chromosomique t(11;22)(g24:g12), qui génère la fusion entre le segment 5' du gène EWSR1 avec le segment 3' du gène FLI-1, appartenant à la famille des facteurs de transcription ETS. La protéine de fusion EWSR1-FLI-1 qui en dérive joue le rSle d'un facteur de transcription aberrant, et est supposée contribuer de manière décisive au processus de développement des ESFTs. Néanmoins, l'expression de EWSR1-FLI-1 dans des fibroblastes normaux induit un arrêt de croissance et leur apoptose, et les cellules primaires permissives pour les propriétés oncogéniques attribuées à la translocation n'ont pas encore été identifiées, empêchant la compréhension de la biologie de base du sarcome d'Ewing. Dans ce travail on montre que l'expression de EWSR1-FLI-1 uniquement est capable de transformer des cellules souches mésenchymateuses dérivées de la moelle osseuse de la souris, pour générer des tumeurs qui présentent les caractéristiques du sarcome d' Ewing humain, et notamment une morphologie de petites cellules bleues et rondes, l'expression de marqueurs associés aux ESFTs, une dépendance du facteur de croissance IGF-1, et l'induction ou la répression de nombreux gènes cibles connus de EWSR1-FLI-1. Sur la base de ces observations, on a testé la possibilité que les cellules souches mésenchymateuses humaines (hMSCs) puissent aussi fournir un environnement cellulaire permissif pour EWSR1-FLI-1 ; et représenter le premier background cellulaire humain adéquat pour la manifestation du pouvoir oncogénique de la protéine de fusion. En effet, l'expression de EWSR1-FLI-1 dans des cellules souches mésenchymateuses humaines s'est révélée non seulement maintenue, mais elle a induit un profil d'expression génétique étonnamment similaire à celui des ESFTs humains, incluant les gènes qui ont été rapportés comme étant les plus discriminatifs pour ces tumeurs. L'expression de EWSR1-FLI-1 dans les hMSCs pourrait récapituler les étapes initiales du développement du sarcome d' Ewing, et de ce fait consentir à identifier les gènes qui jouent un rôle crucial dans sa pathogenèse précoce. Parmi les transcrits relevant indults par EWSR1-FL/-9 dans les hMSCs nous avons découvert le gène du groupe des polycomb EZH2, que nous avons par la suite démontré jouer un rôle essentiel dans la croissance du sarcome de Ewing. Ces observations apportent pour la première fois l'identification d'une cellule primaire candidate pour représenter la cellule d'origine des ESFTs, et en même temps suggèrent que l'expression de EWSR1-FLI-1 peut constituer l'événement initial dans la pathogenèse du sarcome d' Ewing.

Clinical and pharmacogenetic study on smoking and smoking cessation

Currently, smoking cessation represents one of the main strategies to reduce the incidence of tobacco-related diseases in the population. Smoking can also influence pharmacotherapy through several pharmacokinetic or pharmacodynamic interactions. Some of the most concerned drugs are those metabolized by the cytochrome P450 (CYP) 1A2 enzyme (e.g. caffeine, theophylline, clozapine, olanzapine, duloxetine), whose activity is induced by the polycyclic aromatic hydrocarbons found in tobacco smoke. This can result in a clinically significant decrease in the pharmacological effect of the drugs and the need of higher doses in smokers. Conversely, upon smoking cessation, toxic plasma levels of the drugs can be reached. The main objective of this thesis was to study the interindividual variability in CYP1A2 induction in a large cohort of smokers, by measuring CYP1A2 activity before smoking cessation and one month later in continuously abstinent subjects. For this purpose, a clinical study was conducted, including 194 smokers from the general population who wished to participate in a smoking cessation program and therefore received medical counseling and substitution therapy (nicotine or varenicline). An analytical method for the simultaneous quantification of nicotine, its metabolites and varenicline in plasma was developed and validated using ultra performance liquid chromatography coupled with tandem mass spectrometry. This method was used to confirm abstinence at different time points during the follow-up. Moreover, it was used to determine plasma levels of the smoking cessation drugs, to be used in the study of their pharmacogenetics, which was the secondary objective of this thesis. High interindividual variability in CYP1A2 induction by smoking was observed, ranging from no change to approximately 7 times decreased CYP1A2 activity after smoking cessation. Several clinical and genetic factors were investigated in an attempt to explain this variability. Firstly, a significant influence of CYP1A2*1F and *1D alleles, of contraceptive use and of the number of cigarettes smoked per day on CYP1A2 induced activity was observed, and of CYP1A2*1F and the use of contraceptives on the basal activity. But no influence of these factors was found on CYP1A2 inducibility. Given that known genetic polymorphisms in CYP1A2 gene were shown to explain only poorly the observed variations in activity, additional genetic factors were studied. SNPs in the CYP oxidoreductase (POR) gene were found to influence CYP1A2 basal activity, but not the induction. Finally, a pathway-based approach allowed to identify SNPs in genes coding for nuclear receptors (CAR, RXRa, VDR, PXR) and induction-mediating receptors (AhR), which significantly influenced CYP1A2 inducibility and basal activity (SNPs in the gene coding for CAR and RXRa). As secondary objective of the study, the pharmacogenetics of nicotine and varenicline is being investigated. Therefore, the nicotine metabolite ratio is used in the attempt to better explain nicotine dependence and the failure/success of quitting smoking. A population pharmacokinetic model is being developed for varenicline, integrating clinical and genetic factors (genes coding for its metabolizing enzymes and transporters), with the purpose of trying to predict efficacy and side effects. These findings suggest that the influence of smoking on pharmacotherapy could be better managed by including clinical and possibly in the future genetic factors, in the assessment of the adaptations needed when a person starts or stops smoking.  - L'arrêt du tabac représente une des principales stratégies pour diminuer l'incidence des maladies causées par celui-ci. Le tabagisme peut influencer la thérapie médicamenteuse par des interactions pharmacocinétiques ou pharmacodynamiques. Parmi les médicaments concernés, il y a ceux métabolisés par le cytochrome P450 (CYP) 1A2 (caféine, théophylline, clozapine, olanzapine, duloxétine, etc), dont l'activité enzymatique est induite par les hydrocarbures aromatiques polycycliques présents dans la fumée de cigarette. Ceci peut se traduire par une diminution de l'effet pharmacologique du traitement et la nécessité d'augmenter les doses d'entretien chez les fumeurs. Au contraire, à l'arrêt de la cigarette, les taux plasmatiques des médicaments peuvent devenir toxiques. L'objectif principal de cette thèse était d'étudier la variabilité interindividuelle dans l'induction du CYP1A2 dans une large cohorte de fumeurs, par la mesure de l'activité du CYP1A2 avant l'arrêt de la cigarette, ainsi qu'un mois après chez les sujets abstinents. Pour ce faire, une étude clinique a été conduite, incluant 194 fumeurs de la population générale dans un programme d'arrêt du tabac offrant des consultations spécifiques et un traitement pharmacologique (nicotine ou varénicline). Une méthode analytique pour la quantification simultanée de la nicotine, ses métabolites et la varénicline dans le plasma par chromatographie liquide couplée à la spectrométrie de masse en tandem à été développée et validée. Cette méthode a été utilisée pour confirmer l'abstinence pendant l'étude et déterminer les taux plasmatiques des médicaments, dans le but d'étudier leur pharmacogénétique. Une grande variabilité interindividuelle dans l'induction du CYP1A2 par la fumée a été observée, parfois sans changement et pouvant aller jusqu'à une diminution d'environ 7 fois l'activité du CYP1A2 après l'arrêt de la cigarette. Plusieurs facteurs cliniques et génétiques ont été étudiés pour essayer d'expliquer cette variabilité. Tout d'abord, on a observé une influence significative: des allèles CYP1A2*1F et *1D, des contraceptifs et du nombre de cigarettes fumées par jour sur l'activité induite du CYP1A2, ainsi que l'influence de l'allèle *1F et des contraceptifs sur l'activité basale. Cependant, aucune influence de ces facteurs n'a été démontrée sur l'inductibilité du CYP1A2. Étant donné que les polymorphismes génétiques du CYP1A2 apportent peu de renseignements sur la variabilité de son activité, des facteurs génétiques supplémentaires ont été étudiés. Des polymorphismes dans le gène POR (CYP oxidoreductase) ont été associés à l'activité basale du CYP1A2, mais pas à l'induction. Finalement, une approche basée sur la voie de signalisation du CYP1A2 a permis d'identifier des polymorphismes dans des gènes codant pour des récepteurs nucléaires (CAR, RXRa, VDR, PXR) et d'autres liés à l'induction (AhR) qui influencent significativement l'inductibilité et l'activité basale (les SNPs du CAR et RXRa). L'objectif secondaire de cette étude était d'investiguer la pharmacogénétique de la nicotine et de la varénicline. Le ratio métabolique de la nicotine est utilisé pour mieux expliquer la dépendance à la nicotine et le succès/échec de l'arrêt de la cigarette. Un modèle pharmacocinétique de population est en cours de développement pour la varénicline, intégrant des facteurs cliniques et génétiques (gènes codant pour ses enzymes de métabolisme et transporteurs), pour tenter de prédire son efficacité et ses effets secondaires. Les résultats de cette thèse suggèrent que l'influence du tabagisme sur la pharmacothérapie serait mieux gérée par l'inclusion des facteurs cliniques et peut-être, dans le futur, génétiques, dans l'évaluation des adaptations nécessaires lorsqu'une personne fume ou arrête de fumer.  - l'arrêt du tabac représente une des principales stratégies pour diminuer l'incidence des maladies causées par celui-ci dans la population. Le tabagisme peut influencer les traitements médicamenteux, soit en modifiant leur élimination par l'organisme, soit en agissant sur leur mode d'action. Parmi les médicaments les plus concernés, on retrouve par exemple: la caféine, la théophylline, la clozapine, l'olanzapine, la duloxétine, dont l'élimination est accélérée par la fumée de cigarette (induction enzymatique). Ceci peut se traduire par une diminution de l'effet du traitement et la nécessité d'en augmenter les doses chez les fumeurs. Au contraire, à l'arrêt de la cigarette, on observe un ralentissement de la fonction enzymatique, qui a pour conséquence une augmentation du taux de médicament dans le sang, pouvant devenir toxique. L'objectif principal de cette thèse était d'étudier comment cette induction par le tabac varie dans une population de fumeurs, par la mesure de l'activité de l'enzyme avant l'arrêt de la cigarette, ainsi qu'un mois après chez les sujets abstinents. Pour ce faire, une étude clinique a été conduite, incluant 194 fumeurs de la population générale dans un programme d'arrêt du tabac offrant des consultations spécifiques et un traitement médicamenteux (nicotine ou varénicline). Une méthode analytique a été mise au point pour mesurer la quantité de nicotine, de ses produits de dégradation et de la varénicline dans le sang des participants à l'étude. De plus, cette méthode a été utilisée pour confirmer l'abstinence pendant l'étude. Une grande variabilité interindividuelle a été observée dans l'induction de l'enzyme par la fumée; il en résulte aucun changement d'activité chez certains sujets après l'arrêt de la cigarette, alors que pour d'autres elle peut être diminuée jusqu'à 7 fois. Plusieurs facteurs cliniques et génétiques ont été étudiés pour essayer d'expliquer cette variabilité. Premièrement, une influence sur l'activité de l'enzyme a été observée pour les contraceptifs hormonaux et le nombre de cigarettes fumées par jour, ainsi que pour certaines variations génétiques dans le gène codant pour l'enzyme d'intérêt, mais il η y a pas eu d'influence sur l'induction. Par la suite, des variations génétiques dans d'autres gènes influençant le fonctionnement de l'enzyme ont été associées soit avec son activité, soit avec son induction par le tabac. Finalement, l'étude propose également d'investiguer si le métabolisme de la nicotine a une influence sur la dépendance, les symptômes de sevrage et le succès/échec de l'arrêt de la cigarette. Des variations génétiques dans les gènes du métabolisme de la varénicline sont également étudiées en lien avec les quantités de varénicline mesurées dans le sang ainsi que les effets du médicament. Ceci permettra peut-être de prédire son efficacité et ses effets secondaires. Les résultats de cette thèse suggèrent que l'influence du tabagisme sur la thérapie médicamenteuse serait mieux gérée en tenant compte des facteurs cliniques et peut-être, dans le futur, de la génétique dans l'adaptation des traitements, que la personne soit fumeuse ou en phase d'arrêt.

Role of penicillin-binding proteins in Streptococcus gordonii

Résumé Streptococcus gordonii est une bactérie colonisatrice naturelle de la cavité buccale de l'homme. Bien que normalement commensale, elle peut causer des infections graves, telles que des bactériémies ou des endocardites infectieuses. La pénicilline étant un des traitements privilégiés dans de tels cas, l'augmentation rapide et globale des résistances à cet antibiotique devient inquiétante. L'étude de la physiologie et des bases génétiques de ces résistances chez S. gordonii s'avère donc importante. Les cibles moléculaires privilégiées de la pénicilline G et des β-lactames sont les penicilllin-binding proteins (PBPs). Ces enzymes associées à la membrane ont pour rôle de catalyser les réactions de transpeptidation et de transglycosylation, qui constituent les dernières étapes de la biosynthèse du peptidoglycan (PG). Elles sont définies comme classe A ou B selon leur capacité d'assurer soit les deux réactions, soit uniquement la transpeptidation. Les β-lactames inhibent le domaine transpeptidase de toutes les PBPs, entraînant l'inhibition de la synthèse du PG, l'inhibition de la croissance, et finalement la mort cellulaire. Chez les streptocoques, les PBPs sont aussi les premiers déterminants de la résistance à la pénicilline. De plus, elles sont impliquées dans la morphologie bactérienne, en raison de leur rôle crucial dans la formation du PG. Le but de ce travail était de caractériser les PBPs de S. gordonii et d'étudier leurs fonctions dans la vie végétative de la bactérie ainsi que durant le développement de la résistance à la pénicilline. Premièrement, des mutants auxquels il manque une ou deux PBP(s) ont été construits. Leur étude - au niveau physiologique, biochimique et morphologique - a montré le caractère essentiel ou dispensable de chaque protéine, ainsi que certaines de leurs fonctions potentielles. Deuxièmement, des mutants résistants à la pénicilline ont été générés. Leur caractérisation a montré l'importance des mutations dans les PBPs ainsi que dans d'autres gènes encore inconnus, de même que le rôle crucial des PBPs de classe A dans le développement de la résistance à la pénicilline. Des expériences supplémentaires sur des isolats résistants ont aussi prouvé que la résistance a un coût en terme de fitness, coût que S. gordonii parvient à compenser par des mécanismes d'adaptation. Finalement, les promoteurs des gènes des PBPs ont été déterminés et leur expression a été étudiée grâce au gène de luciférase. Il a ainsi été montré que la résistance à la pénicilline entraîne non seulement des altérations au niveau des protéines, mais aussi au niveau de la régulation des gènes. De plus, la pénicilline génère directement des modifications dans l'expression de PBPs spécifiques. Summary Streptococcus gordonii is a normal inhabitant of the human oral cavity and a pioneer colonizer of teeth. Although usually considered as a commensal, this organism can cause life-threatening infections such as bacteraemia or endocarditis. Since penicillin is one of the preferential treatments for such pathologies, the rapid and general increase of antibiotic resistance in the overall population becomes an issue. Thus, studying the physiologic and genetic bases of such a resistance in S. gordonii is of interest. The primary molecular targets of penicillin G and other β-lactams are the so called penicillin-binding proteins (PBPs). These are membrane-associated proteins that catalyze the last steps in peptidoglycan (PG) biosynthesis, namely transpeptidation and transglycosylation. Depending on their capacity to catalyze either reactions or only transpeptidation, they are considered as class A or class B PBPs, respectively. β-lactam antibiotics inhibit the transpeptidase domain of both of these classes of enzymes, resulting in inhibition of PG assembly, inhibition of bacterial growth, and ultimately leading to cell death. In streptococci, PBPs are also the primary determinants of penicillin-resistance. Moreover, because of their crucial role in PG formation, they are implicated in fundamental aspects of cell morphology. The goal of this work was thus to characterize S. gordonii PBPs and to explore their functions in terms of vegetative life and penicillin-resistance development. First, single and double PBP-inactivated mutants were generated and their effect on the bacterial physiology, cell wall biochemistry and ultrastructural morphology was assessed. This demonstrated the essentiality or dispensability of each protein for bacterial life. Second, penicillin-resistant mutants were generated by cyclic exposure to increasing concentrations of the drug. Characterization of these mutants pointed out the importance of both PBP and non-PBP mutations, as well as the crucial role of the class A PBPs in the development of penicillin-resistance. Further experiments on resistant isolates demonstrated the fitness cost of this resistance, but also the capacity of S. gordonii to adapt and regain the fitness of the wild-type. Finally, the promoters of PBP genes were determined and their expression was monitored using luciferase fusions. This showed that penicillin-resistance, in addition to modifications at the level of the protein, also triggered genetic alterations. Moreover, penicillin itself generated modifications in the expression of specific PBPs.

Le mélanome et les polymorphismes associés au dysfonctionnement du système immunitaire

La recherche biomédicale profite de plus en plus au développement des techniques de séquençage et d'analyse de l'ADN. Les coûts du séquençage ont drastiquement baissés au cours de ces dernières années et les genomes-wides associations studies (GWAS) ont révolutionné l'approche de la recherche génétique en mettant en évidence associations et single-nucleotide-polymorphisms (SNPs) qui pourraient être importantes pour la susceptibilité à développer des maladies dites communes. La majorité des cancers appartiennent à cette définition de maladie commune, ils sont généralement causés par une accumulation de lésions/mutations de l'ADN aboutissant à une perte de contrôle de la prolifération et du cycle cellulaire. Ces mutations peuvent être héréditaires, acquises ou une combinaison des deux. Dans la plupart des cancers communs (cancers qui n'ont pas une hérédité familiale importante) les mutations de l'ADN sont souvent amenées par des facteurs tels que inflammation chronique, tabac, virus, exposition aux radiations, aux agents chimiques. Ceci est le cas pour le mélanome également, un cancer de la peau qui est corrélé à l'exposition des rayons UV solaires ou artificiels. Une hypothèse largement acceptée aujourd'hui est que les tumeurs, à travers leur accumulation progressive de mutations somatiques et d'anomalies chromosomiques, finissent par échapper au contrôle exercé par le système immunitaire. Il est par conséquence imaginable que des polymorphismes naturels puissent renforcer ou affaiblir la capacité du système immunitaire à freiner voir arrêter la progression tumorale.

Insights into the regulation of two caspase-activating platforms, the inflammasome and the PIDDosome

Résumé: Les organismes multicellulaires ont adopté diverses stratégies pour répondre aux stress auxquels ils sont exposés. Cette étude a exploré deux de ces stratégies l'inflammation en réponse à une invasion par un pathogène, et l'apoptose ou la survie en réponse aux dommages à l'ADN. L'interleukine-lß (IL-lß) est une importante cytokine inflammatoire. Elle est synthétisée sous forme d'un précurseur inactif et nécessite un clivage par la caspase-1 pour être activée. La caspase-1 elle-même est activée dans un complexe appelé inflammasome. Certains NLRs (Nod-like receptors), IPAF et les NALPs, sont capables de former des inflammasomes fonctionnels. Cette étude s'est intéressée au rôle d'un autre NLR structurellement proche, la protéine NAIP, dans la régulation de la caspase-1 et la maturation de l'IL-1 ß. NAIP est incorporé à l'inflammasome contenant NALP3 et est capable d'inhiber l'activation de la caspase-1 et la maturation de l'IL-lß. Cette fonction inhibitrice dépend des ses domaines BIR et est inhibée par ses LRRs. Le mécanisme exact d'inhibition reste à définir et la régulation de l'activation de NAIP est discutée. La deuxième partie de cette étude concerne la protéine PIDD. Cette protéine est impliquée avec RAIDD dans l'activation de la caspase-2, et est aussi capable, avec l'aide de RIP et de NEMO, d'activer NF-κB en réponse aux dommages à l'ADN. Deux isoformes de PIDD ont déjà été décrites dans la littérature, PIDD (isoforme 1) et LRDD (isoforme 2) et une troisième isoforme est rapportée ici. L'étude de l'expression de ces isoformes a montré qu'elles sont exprimées différemment dans les tissus et dans les lignées cellulaires, et que l'isoforme 3 est induite en réponse à un stress génotoxique. La caractérisation fonctionnelle a établi que les trois isoformes sont capables d'activer NF-κB, donc la survie, mais que seule l'isoforme 1 peut interagir avec RAIDD pour activer la caspase-2 et sensibiliser les cellules à la mort induite par un stress génotoxique. Le domaine intermédiaire de PIDD, situé entre le deuxième ZU5 et le DD est essentiel pour l'interaction entre PIDD et RAIDD et l'activation de la caspase-2 qui en découle. En conclusion, l'épissage différentiel de l'ARNm de PIDD permet la production d'au moins trois protéines possédant des fonctions agonistes ou antagonistes et qui peuvent participer au choix cellulaire entre survie et apoptose en réponse aux dommages à l'ADN. Summary: Multicellular organisms have evolved several strategies to cope with the stresses they encounter. The present study has explored two of these strategies: inflammation in response to a pathogenic invasion, and apoptosis or repair/survival in response to DNA damage. Interleukin-lß (IL-lß) is a key mediator of inflammation. It is synthesized as an inactive precursor and requires cleavage by caspase-1 to be activated. caspase-1 itself is activated in molecular platforms called inflammasomes, which can be formed by members of the NOD-like receptors (NLR) family, like IPAF and NALPs. This study has investigated the role of another NLR, the structurally related protein NAIP, in the regulation of caspase-1 activation and IL-lß maturation. An inhibitory role of NAIP on caspase-1 activation and IL-lß maturation was demonstrated, as well as NAIP incorporation in the NALP3 inflammasome. This inhibitory property relies on NAIP BIR domains and is inhibited by NAIP LRRs. The exact mechanism of NAIP-mediated caspase-1 activation remains to be elucidated and the regulation of NAIP activation is discussed. The second part of this study focused on the caspase-2 activating protein PIDD. This protein is known to mediate caspase-2 activation via RAIDD and to signal NF-κB via RIP and NEMO in response to DNA damage. Two isoforms of PIDD, PIDD (isoform 1) and LRDD (isoform 2), have already been reported and a third isoform is described here. Investigation of the expressional regulation of these isoforms indicated that they are differentially expressed in tissues and cell lines, and that isoform 3 mRNA levels are upregulated in response to genotoxic stress. Functional studies demonstrated that all three isoforms can activate NF-κB in response to DNA damage, but only isoform 1 is able to interact with RAIDD and activate caspase-2, sensitizing cells to genotoxic stress-induced cell death. The intermediate domain located between the second ZUS and the DD is essential for the interaction of PIDD and RAIDD and the subsequent caspase-2 activation. Thus the differential splicing of PIDD mRNA leads to the formation of at least thrée proteins with antagonizing/agonizing functions that could participate in determining cell fate in response to DNA damage.

CHARACTERIZATION OF EPSTEIN-BARR VIRUS-ENCODED LATENT MEMBRANE PROTEIN 1

Le virus d'Epstein-Barr (EBV), un virus de la famille des gammaherpesvirus, infecte plus de 95% de la population adulte mondiale. EBV est associé à plusieurs types de cancers dont le lymphome de Hodgkin, le lymphome de Burkitt et le carcinome nasopharyngé. La protéine membranaire de latence 1 (LMP1), l'oncogène principal d'EBV, est une protéine membranaire intégrale composée d'une petite extrémité N-terminale cytoplasmique, six segments transmembranaires (TMs) lié par de petites boucles et un long domaine C-terminale cytoplasmique. Le gène de LMP1, BNLF-1, est très polymorphe et plusieurs variants de la protéine LMP1 ont été décrits. Parmi les variants de LMP1 la majeure différence décrite est leur capacité à activer le facteur de transcription NF-κB. Nous avons défini des polymorphismes permettant aux variants d'avoir une activation accrue de NF-κB comparé au prototype B95-8 LMP1. Tous les polymorphismes cruciaux identifiés dans notre étude se trouvent dans les TMs 4 et 5 de LMP1. Nous avons étudié l'implication de chaque paire de TMs dans l'association à la membrane, l'auto-agrégation, la liaison aux partenaires cellulaires de LMP1 TRAF3 et β-TrCP, ainsi que pour NF-κB. De plus, nous avons décrit un nouveau rôle pour LMP1 consistant à inhiber l'activation contrôlée par MAVS de ISRE et du promoteur d'IFNβ. En résumé, nous avons observé que les différentes paires de TMs, ainsi que les deux boucles intracellulaires, ne sont pas équivalents. Dans l'ensemble, notre étude a montré que les TMs jouent un rôle clé dans les interactions protéine-protéine et la signalisation et qu'ils peuvent être considérés comme des régulateurs essentiels des activités de LMP1.

INTERCELLULAR AND SYSTEM-LEVEL ASPECTS OF THE METABOLIC INTERACTIONS BETWEEN NEURONS AND GLIA

Quand on parle de l'acide lactique (aussi connu sous le nom de lactate) une des premières choses qui vient à l'esprit, c'est son implication en cas d'intense activité musculaire. Sa production pendant une activité physique prolongée est associée avec la sensation de fatigue. Il n'est donc pas étonnant que cette molécule ait été longtemps considérée comme un résidu du métabolisme, possiblement toxique et donc à éliminer. En fait, il a été découvert que le lactate joue un rôle prépondérant dans le métabolisme grâce à son fort potentiel énergétique. Le cerveau, en particulier les neurones qui le composent, est un organe très gourmand en énergie. Récemment, il a été démontré que les astrocytes, cellules du cerveau faisant partie de la famille des cellules gliales, utilisent le glucose pour produire du lactate comme source d'énergie et le distribue aux neurones de manière adaptée à leur activité. Cette découverte a renouvelé l'intérêt scientifique pour le lactate. Aujourd'hui, plusieurs études ont démontré l'implication du lactate dans d'autres fonctions de la physiologie cérébrale. Dans le cadre de notre étude, nous nous sommes intéressés au rapport entre neurones et astrocytes avec une attention particulière pour le rôle du lactate. Nous avons découvert que le lactate possède la capacité de modifier la communication entre les neurones. Nous avons aussi décrypté le mécanisme grâce auquel le lactate agit, qui est basé sur un récepteur présent à la surface des neurones. Cette étude montre une fonction jusque-là insoupçonnée du lactate qui a un fort impact sur la compréhension de la relation entre neurones et astrocytes. - Relatively to its volume, the brain uses a large amount of glucose as energy source. Furthermore, a tight link exists between the level of synaptic activity and the consumption of energy equivalents. Astrocytes have been shown to play a central role in the regulation of this so-called neurometabolic coupling. They are thought to deliver the metabolic substrate lactate to neurons in register to glutamatergic activity. The astrocytic uptake of glutamate, released in the synaptic cleft, is the trigger signal that activates an intracellular cascade of events that leads to the production and release of lactate from astrocytes. The main goal of this thesis work was to obtain detailed information on the metabolic and functional interplay between neurons and astrocytes, in particular on the influence of lactate besides its metabolic effects. To gain access to both spatial and temporal aspects of these dynamic interactions, we used optical microscopy associated with specific fluorescent indicators, as well as electrophysiology. In the first part of this thesis, we show that lactate decreases spontaneous neuronal, activity in a concentration-dependent manner and independently of its metabolism. We further identified a receptor-mediated pathway underlying this modulatory action of lactate. This finding constituted a novel mechanism for the modulation of neuronal transmission by lactate. In the second part, we have undergone a characterization of a new pharmacological tool, a high affinity glutamate transporter inhibitor. The finality of this study was to investigate the detailed pharmacological properties of the compound to optimize its use as a suppressor of glutamate signal from neuron to astrocytes. In conclusion, both studies have implications not only for the understanding of the metabolic cooperation between neurons and astrocytes, but also in the context of the glial modulation of neuronal activity. - Par rapport à son volume, le cerveau utilise une quantité massive de glucose comme source d'énergie. De plus, la consommation d'équivalents énergétiques est étroitement liée au niveau d'activité synaptique. Il a été montré que dans ce couplage neurométabolique, un rôle central est joué par les astrocytes. Ces cellules fournissent le lactate, un substrat métabolique, aux neurones de manière adaptée à leur activité glutamatergique. Plus précisément, le glutamate libéré dans la fente synaptique par les neurones, est récupéré par les astrocytes et déclenche ainsi une cascade d'événements intracellulaires qui conduit à la production et libération de lactate. Les travaux de cette thèse ont visé à étudier la relation métabolique et fonctionnelle entre neurones et astrocytes, avec une attention particulière pour des rôles que pourrait avoir le lactate au-delà de sa fonction métabolique. Pour étudier les aspects spatio-temporels de ces interactions dynamiques, nous avons utilisé à la fois la microscopie optique associée à des indicateurs fluorescents spécifiques, ainsi que l'électrophysiologie. Dans la première partie de cette thèse, nous montrons que le lactate diminue l'activité neuronale spontanée de façon concentration-dépendante et indépendamment de son métabolisme. Nous avons identifié l'implication d'un récepteur neuronal au lactate qui sous-tend ce mécanisme de régulation. La découverte de cette signalisation via le lactate constitue un mode d'interaction supplémentaire et nouveau entre neurones et astrocytes. Dans la deuxième partie, nous avons caractérisé un outil pharmacologique, un inhibiteur des transporteurs du glutamate à haute affinité. Le but de cette étude était d'obtenir un agent pharmacologique capable d'interrompre spécifiquement le signal médié par le glutamate entre neurones et astrocytes pouvant permettre de mieux comprendre leur relation. En conclusion, ces études ont une implication non seulement pour la compréhension de la coopération entre neurones et astrocytes mais aussi dans le contexte de la modulation de l'activité neuronale par les cellules gliales.

Neuroprotection in cerebral ischemia : an effect of c-Jun N-terminal kinase inhibition on the inflammatory response

RESUMESuite à un accident vasculaire cérébral (AVC) ischémique, les cellules gliales ducerveau deviennent activées, de nombreuses cellules inflammatoires pénètrent dans letissu lésé et sécrètent une grande variété de cytokines et chémokines. Aujourd'hui, ilexiste des interrogations sur les effets bénéfiques ou délétères de cette inflammation surla taille de la lésion et le pronostic neurologique.Ce projet vise à évaluer l'effet d'un peptide neuroprotecteur, D-JNKI1, inhibiteur de lavoie pro-apoptotique de signalisation intracellulaire c-Jun N-terminal kinase (JNK), surl'inflammation post-ischémique.Nous montrons d'abord que la microglie est largement activée dans toute la région lésée48 h après l'induction d'une ischémie chez la souris. Cependant, malgré l'inhibition dela mort neuronale par D-JNKI1 évaluée à 48 h, nous n'observons de modification ni del'activation de la microglie, ni de son nombre. Ensuite, nous montrons que le cerveaupeut être protégé même s'il y a une augmentation massive de la sécrétion de médiateursinflammatoires dans la circulation systémique très tôt après induction d'un AVCischémique. De plus, nous notons que la sécrétion de molécules inflammatoires dans lecerveau n'est pas différente entre les animaux traités par D-JNKI1 ou une solutionsaline, bien que nous ayons obtenu une neuroprotection significative chez les animauxtraités.En conclusion, nous montrons que l'inhibition de la voie de JNK par D-JNKI1n'influence pas directement l'inflammation post-ischémique. Ceci suggère quel'inhibition de l'inflammation n'est pas forcément nécessaire pour obtenir en hautdegré de neuroprotection du parenchyme lésé après ischémie cérébrale, et que lesmécanismes inflammatoires déclenchés lors d'une ischémie cérébrale ne sont pasforcément délétères pour la récupération du tissu endommagé.SUMMARYAfter cerebral ischemia, glial cells become activated and numerous inflammatory cellsinfiltrate the site of the lesion, secreting a large variety of cytokines and chemokines. Itis controversial whether this brain inflammation is detrimental or beneficial and how itinfluences lesion size and neurological outcome.This project was aimed at critically evaluating whether the neuroprotective peptide DJNKI,an inhibitor of the pro-apopotic c-Jun N-terminal kinase (JNK) pathway,modulates post-ischemic inflammation in animal models of stroke. Specifically, it wasasked whether JNK inhibition prevents microglial activation and the release ofinflammatory mediators.In the first part of this study, we showed that microglia was activated throughout thelesion 48 h after experimental stroke. However, the activation and accumulation ofmicroglia was not reduced by D-JNKI1, despite a significant reduction of the lesionsize. In the second part of this project, we demonstrated that neuroprotection measuredat 48 h occurs even though inflammatory mediators are released in the plasma veryearly after the onset of cerebral ischemia. Furthermore, we found that secretion ofinflammatory mediators in the brain was not different in groups treated with D-JNKI1or not, despite a significant reduction of the lesion size in the treated group.Altogether, we show that inhibition of the JNK pathway using D-JNKI1 does notinfluence directly post-stroke inflammation. Inhibition of inflammation is therefore notnecessarily required for neuroprotection after cerebral ischemia. Thus, post-strokeinflammation might not be detrimental for the tissue recovery.

Involvement of PPARβ/δ in mesenchymal-epidermal interactions during skin wound healing

SUMMARY : Skin wound repair is a complex and highly coordinated process, where a variety of cell types unite to regenerate the damaged tissue. Several works have elucidated cellular and molecular mechanisms, in which mesenchymal-epidermal interactions play an essential role for the regulation of skin homeostasis and repair. Peroxisome Proliferator-Activated Receptors (PPARs) are ligand-activated transcription factors that belong to the nuclear receptor superfamily. Three related isotypes (PPARα, PPARß/δ and PPARγ) have been found, which exhibit distinct tissue distribution and specific physiological functions. PPARß/δ was identified as a crucial player of skin homeostasis. In the mouse skin, PPARß/δ has been described to control proliferation-differentiation state, adhesion and migration, and survival of the keratinocytes during healing. PPARß/δ has been implicated as well in the development of the hair follicles, in which mesenchymal-secreted hepatocyte growth factor (HGF) is involved. These data suggest that the biological activity of PPARß/δ is modulated by mesenchymal-epidermal interactions and that, in turn, PPARß/δ also modulates some of these signals. The aim of the present work was to elucidate the nature of the signals exchanged between the epidermis and dermis compartments, and more particularly those which are under the control of PPARß/δ. In the first part of the study, we showed that PPARß/8 in dermal fibroblasts down-regulates the mitotic activity of keratinocytes by inhibiting the IL-1 signalling pathway via the production of secreted IL-1 receptor antagonist (sIL-1Ra), a natural antagonist of this signalling. The regulation of IL-1 signalling by PPARß/δ is required for anon-pathological skin wound repair. These findings provide evidence for a novel homeostatic control of keratinocyte proliferation and differentiation mediated by the regulation of IL-1 signalling via dermal PPARß/δ fibroblasts. Proteolysis of the extracellular matrix (ECM) is a key process involved in wound repair and modifications in its activity are often associated with an alteration óf the wound closure. This process implies specific proteinases, as matrix metalloproteinases (MMPs), which are finely modulated by IL-1 signalling. In line with the first results, the second part of the work showed that MMP8 and MMP13, which are two important collagenases involved in mouse skin wound repair, are regulated by PPARß/δ. Their expression is indirectly down-regulated by dermal PPARß/δ, via the production of sIL-1Ra, resulting in the inhibition of IL-1 signalling, known to regulate the expression of numerous MMPs. We suggest that, in absence of PPARß/δ, the positive regulation of these two collagenases could participate to the delay of skin wound healing, which has been observed in mice deleted for PPARßlS. The potential therapeutic role of PPARß/b could be as well extending to inflammatory and hyperproliferative skin diseases involving IL-1 signalling, such as psoriasis or skin cancers. Quite interestingly, MMP1 (analogue of mouse MMP13) plays an essential role in human photoaging, suggesting that PPARß/δ could as well be an attractive target for photoprotection. RESUME : La cicatrisation est un processus complexe et extrêmement organisé, impliquant un grand nombre de cellules qui s'unissent pour régénérer le tissu endommagé. De nombreux travaux nous ont éclairés sur les mécanismes cellulaires et moléculaires, dans lesquels les interactions épidermo-mésenchymateuses détiennent un rôle capital à la fois dans la régulation de l'homéostasie et dans la réparation de la peau. PPAR (Peroxisome proliferatar-activated receptor), qui appartient à la superfamille des récepteurs nucléaires, se définit comme un facteur de transcription activé par des ligands très spécifiques. Trois isotypes (PPARa, PPARß/δ et PPARy) ont été décrits et sont caractérisés par une distribution tissulaire et des fonctions physiologiques clairement définies. PPARß/δ a été identifié comme étant un important acteur dans l'homéostasie de la peau. Chez la souris, il a été décrit comme contrôlant l'état de prolifération et de différenciation, le processus d'adhésion et de migration, ainsi que la survie des kératinocytes au cours de la cicatrisation. PPARßIS a également été défini comme contrôlant le développement des follicules pileux, impliquant la sécrétion par le mésenchyme du facteur de croissance HGF. Ces données suggèrent que l'activité biologique de PPARß/δ est modulée par des interactions épidermo-mésenchymateuses, et qu'en retour, il possède la capacité de moduler certains de ces signaux. L`objectif de ce travail a été d'élucider la nature des signaux échangés entre les compartiments épidermique et dermique, et plus particulièrement ceux qui sont sous le contrôle de PPARß/δ. Dans la première partie de l'étude, nous avons montré que les fibroblastes exprimant PPARß/δ réduisent l'activité mitotique des kératinocytes en inhibant la voie de signalisation IL-1, via la production de sIL-1Ra (secreted IL-1 receptor antagonist), défini comme un antagoniste naturel de cette voie de signalisation. La régulation de cette dernière par PPARß/δ est donc nécessaire pour une cicatrisation de type non pathologique. Ces résultats offrent donc une nouvelle preuve du contrôle de l'homéostasie et de l'état de prolifération/différenciation des kératinocytes par les fibroblastes exprimant PPARß/δ, en régulant la voie de signalisation IL-1. Le mécanisme de dégradation de la matrice extracellulaire (MEC) est une étape essentielle lors du processus de cicatrisation. Ainsi des modifications de cette activité protéolytïque sont souvent associées à une altération de la fermeture de la plaie. Ce processus implique des protéinases, comme les MMPs, qui sont finement modulés par la voie de signalisation IL-1. En accord avec les premiers résultats, la seconde partie des nos travaux a montré que les collagénases MMP8 et MMP13, connues pour être d'importantes molécules impliquées lors de la réparation tissulaire chez la souris, sont modulées par l'activité de PPARß/δ. Leurs expressions sont indirectement régulées par PPARß/δ, via la production. de sIL-1 Ra, entraînant ainsi l'inhibition de la voie de signalisation IL-1, décrite pour réguler l'expression de nombreuses MMPs, Nous suggérons donc qu'en absence de PPARß/δ, la régulation de ces deux collagénases pourrait être impliquée dans le retard de cicatrisation, observé chez les souris déficientes pour PPARß/δ. L'activité biologique de PPARß/δ pourrait être ainsi étendue à des maladies hyperproliferatives et inflammatoires de la peau, impliquant la voie de signalisation IL-1, comme le psoriasis ou certains cancers de la peau, et ce à des fins thérapeutiques. Il est aussi intéressant de relever que chez l'homme, MMP1 (présenté comme l'analogue de MMP13 de la souris} joue un rôle primordial dans le photo-vieillissement, nous suggérons donc que PPARß/δ pourrait ainsi être une cible attrayante concernant la photoprotection.

Dibenzofuran degradation by Sphingomonas wittichii RW1 under environmental stresses

Sphingomonas wittichii is a gram-negative Alpha-proteobacterium, capable of degrading xenobiotic compounds such as dibenzofuran (DBF), dibenzo-p-dioxin, carbazole, 2-hydroxybiphenyl or nitro diphenyl ether herbicides. The metabolism of strain RW1 has been the subject of previous studies and a number of genes involved in DBF degradation have been characterized. It is known that RW1 posseses a unique initial DBF dioxygenase (encoded by the dxnAl gene) that catalyzes the first step in the degradation pathway. None of the organisms known to be able to degrade DBF have a similar dioxygenase, the closest match being the DBF dioxygenase from Rhodococcus sp. with an overall amino acid similarity of 45%. Genes participating in the conversion of the metabolite salicylate via the ortho-cleavage pathway to TCA cycle intermediates were identified as well. Apart from this scarce information, however, there is a lack of global knowledge on the genes that are involved in DBF degradation by strain RW1 and the influence of environmental stresses on DBF-dependent global gene expression. A global analysis is necessary, because it may help to better understand the behaviour of the strain under field conditions and suggest improvements for the current bioaugmentation practice. Chapter 2 describes the results of whole-genome analysis to characterize the genes involved in DBF degradation by RW1. Micro-array analysis allowed us to detect differences in gene transcription when strain RW1 was exposed to DBF. This was complemented by ultra-high throughput sequencing of mutants no longer capable of growing on salicylate and DBF. Some of the genes of the ortho-cleavage pathway were induced 2 to 4 times in the presence of DBF, as well as the initial DBF dioxygenase. However two gene clusters, named 4925 and 5102 were induced up to 19 times in response to DBF induction. The cluster 4925 is putatively participating in a meta-cleavage pathway while the cluster 5102 might be part of a gentisate pathway. The three pathways, ortho-cleavage, meta-cleavage and gentisate pathway seem to be active in parallel when strain RW1 is exposed to DBF, presenting evidence for a redundancy of genes for DBF degradation in the genome of RW1. Chapter 3 focuses on exploiting genetic tools to construct bioreporters representative for DBF degradation in RW1. A set of basic tools for genetic manipulation in Sphingomonas wittichii RW1 was tested and optimized. Both plasmids and mini-transposons were evaluated for their ability to be maintained in RW1 with or without antibiotic selection pressure, and for their ability to lead to fluorescent protein expression in strain RW1 from a constitutive promoter. Putative promoter regions of three of the previously found DBF-induced genes (Swit_4925, Swit_5102 and Swit_4897-dxnAl) were then used to construct eg/^-bioreporters in RW1. Chapter 4 describes the use of the constructed RW1-based bioreporter strains for examining the expression of the DBF degradation pathway genes under microcosm conditions. The bioreporter strains were first exposed to different carbon sources in liquid culture to calibrate the egfp induction. Contrary to our expectations from micro-array analysis only the construct with the promoter from gene cluster 4925 responded to DBF, whereas the other two constructs did not show specific induction with DBF. The response from the bioreporters was subsequently tested for sensitivity to water stress, given that this could have an important impact in soils. Exposure to liquid cultures with decreasing water potential, achieved by NaCl or PEG addition to the growth media, showed that eGFP expression in RW1 from the promoter regions 4925 and 5102 was not directly influenced by water stress, but only through an overall reduction in growth rate. In contrast, expression of eGFP from the dxnAl or an uspA promoter was also directly dependent on the extent of water stress. The RW1 with the 4925 construct was subsequently used in soil microcosms to evaluate DBF bioavailability to the cells in presence or absence of native microbiota or other contaminated material. We found that RW1 could grow on DBF added to soil, but bioreporter expression suggested that competition with native microbiota for DBF intermediates may limit its ability to proliferate to a maximum. Chapter 5 describes the results from the experiments carried out to more specifically detect genes of RW1 that might be implicated in water stress resistance. Hereto we created transposon mutagenesis libraries in RW1, either with a classical mini-Tn5 or with a variant that would express egfp when the transposon would insert in a gene induced under water stress. Classical mutant libraries were screened by replica plating under high and low water stress conditions (achieved by adding NaCl to the agar medium). In addition, we screened for smaller microcolonies formed by mutants in agarose beads that could be analized with flow cytometry. A number of mutants impaired to grow on NaCl-supplemented media were recovered and the transposon insertion sites sequenced. In a second procedure we screened by flow cytometry for mutants with a higher eGFP production after exposure to growth medium with higher NaCl concentrations. Mutants from both libraries rarely overlapped. Discovered gene functions of the transposon insertions pointed to compatible solute synthesis (glutamate and proline), cell membrane synthesis and modification of cell membrane composition. The results obtained in the present study give us a more complete picture of the mechanisms of DBF degradation by S. wittichii RW1, how it reacts to different DBF availability and how the DBF catabolic activity may be affected by the conditions found in contaminated environments. - Sphingomonas wittichii est une alpha-protéobactérie gram-négative, capable de dégrader des composés xénobiotiques tels que le dibenzofurane (DBF), la dibenzo-p-dioxine, le carbazole, le 2-hydroxybiphényle ou les herbicides dérivés du nitro-diphényléther. Le métabolisme de la souche RW1 a fait l'objet d'études antérieures et un certain nombre de gènes impliqués dans la dégradation du DBF ont été caractérisés. Il est connu que RW1 possède une unique dioxygénase DBF initiale (codée par le gène dxnAl) qui catalyse la première étape de la voie de dégradation. Aucun des organismes connus pour être capables de dégrader le DBF n'a de dioxygénase similaire. L'enzyme la plus proche étant la DBF dioxygénase de Rhodococcus sp. avec 45% d'acides aminés conservés. Les gènes qui participent à la transformation du salicylate en métabolites intermédiaires du cycle de Krebs par la voie ort/io-cleavage ont aussi été identifiés. Outre ces informations lacunaires, il y a un manque de connaissances sur l'ensemble des gènes impliqués dans la dégradation du DBF par la souche RW1 ainsi que l'effet des stress environnementaux sur l'expression génétique globale, en présence du DBF. Une analyse globale est nécessaire, car elle peut aider à mieux comprendre le comportement de la souche dans les conditions de terrain et de proposer des améliorations pour l'utilisation de la bio-augmentation comme technique de bio-remédiation. Le chapitre 2 décrit les résultats de l'analyse du génome pour caractériser les gènes impliqués dans la dégradation du DBF par RW1. Une analyse de micro-arrays nous a permis de détecter des différences dans la transcription des gènes lorsque la souche RW1 a été exposée au DBF. L'analyse a été complétée par le criblage à ultra-haut débit de mutants qui n'étaient plus capables de croître avec le salicylate ou le DBF comme seule source de carbone. Certains des gènes de la voie ortho-cleavage, dont la DBF dioxygénase initiale, ont xî été induits 2 à 4 fois, en présence du DBF. Cependant, deux groupes de gènes, nommés 4925 et 5102 ont été induits jusqu'à 19 fois en réponse au DBF. Le cluster 4925 participe probablement dans une voie de meta-cleavage tandis que le cluster 5102 pourrait faire partie d'une voie du gentisate. Les trois voies, ortho-cleavage, meta-cleavage et la voie du gentisate semblent être activées en parallèle lorsque la souche RW1 est exposée au DBF, ce qui représente une redondance de voies pour la dégradation du DBF dans le génome de RW1. Le chapitre 3 se concentre sur l'exploitation des outils génétiques pour la construction de biorapporteurs de la dégradation du DBF par RW1. Un ensemble d'outils de base pour la manipulation génétique dans Sphingomonas wittichii RW1 a été testé et optimisé. Deux plasmides et mini-transposons ont été évalués pour leur capacité à être maintenu dans RW1 avec ou sans pression de sélection par des antibiotiques, et pour leur capacité à exprimer la protéine fluorescente verte (eGFP) dans la souche RW1. Les trois promoteurs des gènes Swit_4925, Swit_5102 et Swit_4897 (dxnAl), induits en réponse au DBF, ont ensuite été utilisés pour construire des biorapporteurs dans RW1. Le chapitre 4 décrit l'utilisation des souches biorapportrices construites pour l'analyse de l'expression des gènes de la voie de dégradation du DBF dans des microcosmes avec différents types de sols. Les souches biorapportrices ont d'abord été exposées à différentes sources de carbone en cultures liquides afin de calibrer l'induction de la eGFP. La construction avec le promoteur du gène 4925 a permis une réponse au DBF. Mais contrairement à nos attentes, basées sur les résultats de l'analyse des micro-arrays, les deux autres constructions n'ont pas montré d'induction spécifique au DBF. La réponse des biorapporteurs a ensuite été testée pour la sensibilité au stress hydrique, étant donné que cela pourrait avoir un impact important dans les microcosmes. La diminution du potentiel hydrique en culture liquide est obtenue par addition de NaCl ou de PEG au milieu de croissance. Nous avons montré que l'expression de la eGFP contrôlée par les promoteurs 4925 et 5102 n'était pas directement influencée par le stress hydrique, mais seulement par une réduction globale des taux de croissance. En revanche, l'expression de la eGFP dépendante des promoteurs dxnAl et uspA était aussi directement dépendante de l'ampleur du stress hydrique. La souche avec la construction 4925 a été utilisée par la suite dans des microcosmes avec différents types de sols pour évaluer la biodisponibilité du DBF en présence ou absence des microbes indigènes et d'autres composés contaminants. Nous avons constaté que RW1 pouvait se développer si le DBF a été ajouté au sol, mais l'expression de la eGFP par le biorapporteur suggère que la compétition avec la microbiota indigène pour les métabolites intermédiaires du DBF peut limiter sa capacité à proliférer de manière optimale. Le chapitre 5 décrit les résultats des expériences réalisées afin de détecter spécifiquement les gènes de RW1 qui pourraient être impliquées dans la résistance au stress hydrique. Ici on a crée des bibliothèques de mutants de RW1 par transposon, soit avec un mini-Tn5 classique ou avec une variante qui exprime la eGFP lorsque le transposon s'insère dans un gène induit par le stress hydrique. Les bibliothèques de mutants ont été criblées par la méthode classique de repiquage sur boîtes, dans des conditions de stress hydrique élevé (obtenu par l'addition de NaCl dans les boîtes). En outre, nous avons criblé des micro¬colonies dans des billes d'agarose qui ont pu être analysées par cytométrie de flux. Un certain nombre de mutants déficients à croître sur des milieux supplémentés avec du NaCl ont été isolés et les sites d'insertion du transposon séquencés. Dans une deuxième procédure nous avons criblé par cytométrie de flux des mutants avec une production de eGFP supérieure, après exposition à un milieu de croissance avec une concentration élevée de NaCl. Les mutants obtenus dans les deux bibliothèques n'étaient pas similaires. Les fonctions des gènes où se trouvent les insertions de transposons sont impliqués dans la synthèse de solutés compatibles (glutamate et de la proline), dans la synthèse de la membrane cellulaire et dans la modification de la composition de la membrane cellulaire. Les résultats obtenus dans la présente étude nous donnent une image plus complète des mécanismes de dégradation du DBF par S. wittichii RW1, comment cette souche réagit à la disponibilité du DBF et comment l'activité catabolique peut être affectée par les conditions rencontrées dans des environnements contaminés.

Role of the hypocretin system in cocaine- and alcohol-related behaviors : evidence from hypocretin-deficient mice

RésuméL'addiction aux drogues est une maladie multifactorieile affectant toutes les strates de notre société. Cependant, la vulnérabilité à développer une addiction dépend de facteurs environnementaux, génétiques et psychosociaux. L'addiction aux drogues est décrite comme étant une maladie chronique avec un taux élevé de rechutes. Elle se caractérise par un besoin irrépressible de consommer une drogue et une augmentation progressive de la consommation en dépit des conséquences néfastes. Les mécanismes cérébraux responsables des dépendances aux drogues ne sont que partiellement élucidés, malgré une accumulation croissante d'évidences démontrant des adaptations au niveau moléculaire et cellulaire au sein des systèmes dopaminergique et glutamatergique. L'identification de nouveaux facteurs neurobiologiques responsables de la vulnérabilité aux substances d'abus est cruciale pour le développement de nouveaux traitements thérapeutiques capables d'atténuer et de soulager les symptômes liés à la dépendance aux drogues.Au cours des dernières années, de nombreuses études ont démontré qu'un nouveau circuit cérébral, le système hypocrétinergique, était impliqué dans plusieurs fonctions physiologiques, tel que l'éveil, le métabolisme énergétique, la motivation, le stress et les comportements liés aux phénomènes de récompense. Le système hypocrétinergique est composé d'environ 3000-4000 neurones issus de l'hypothalamus latéral projetant dans tout ie cerveau. Des souris transgéniques pour le gène des hypocrétines ont été générées et leur phénotype correspond à celui des animaux sauvages, excepté le fait qu'elles soient atteintes d'attaques de sommeil similaires à celles observées chez les patients narcoleptiques. H semblerait que les hypocrétines soient requises pour l'acquisition et l'expression de la dépendance aux drogues. Cependant, le mécanisme précis reste encore à être élucidé. Dans ce rapport, nous rendons compte des comportements liés aux phénomènes de récompense liés à l'alcool et à la cocaine chez les souris knock-out (KO), hétérozygotes (HET) et sauvages (WT).Nous avons, dans un premier temps, évalué l'impact d'injections répétées de cocaïne (15 mg/kg, ip) sur la sensibilisation locomotrice et sur le conditionnement place préférence. Nous avons pu observer que les souris WT, HET et KO exprimaient une sensibilisation locomotrice induite par une administration chronique de cocaïne, cependant les souris déficientes en hypocrétines démontraient une sensibilisation retardée et atténuée. Π est intéressant de mentionner que les mâles HET exprimaient une sensibilisation comportementale intermédiaire. Après normalisation des données, toutes les souris exprimaient une amplitude de sensibilisation similaire, excepté les souris mâles KO qui affichaient, le premier jour de traitement, une sensibilisation locomotrice réduite et retardée, reflétant un phénotype hypoactif plutôt qu'une altération de la réponse aux traitements chroniques de cocaïne. Contre toute attente, toutes les souris femelles exprimaient un pattern similaire de sensibilisation locomotrice à la cocaïne. Nous avons ensuite évalué l'effet d'un conditionnement comportemental à un environnement associé à des injections répétées de cocaine (15 mg / kg ip). Toutes les souris, quelque soit leur sexe ou leur génotype, ont manifesté une préférence marquée pour l'environnement apparié à la cocaïne. Après deux semaines d'abstinence à la cocaïne, les mâles et les femelles déficientes en hypocrétines n'exprimaient plus aucune préférence pour le compartiment précédemment associé à la cocaïne. Alors que les souris WT et HET maintenaient leur préférence pour le compartiment associé à la cocaïne. Pour finir, à l'aide d'un nouveau paradigme appelé IntelliCage®, nous avons pu évaluer la consommation de liquide chez les femelles WT, HET et KO. Lorsqu'il n'y avait que de l'eau disponible, nous avons observé que les femelles KO avaient tendance à moins explorer les quatre coins de la cage. Lorsque les souris étaient exposées à quatre types de solutions différentes (eau, ImM quinine ou 0.2% saccharine, alcool 8% et alcool 16%), les souris KO avaient tendance à moins consommer l'eau sucrée et les solutions alcoolisées. Cependant, après normalisation des données, aucune différence significative n'a pu être observée entre les différents génotypes, suggérant que la consommation réduite d'eau sucrée ou d'alcool peut être incombée à l'hypoactivité des souris KO.Ces résultats confirment que le comportement observé chez les souris KO serait dû à des compensations développementales, puisque la sensibilisation locomotrice et le conditionnement comportemental à la cocaïne étaient similaires aux souris HET et WT. En ce qui concerne la consommation de liquide, les souris KO avaient tendance à consommer moins d'eau sucrée et de solutions alcoolisées. Le phénotype hypoactif des souris déficientes en hypocrétine est probablement responsable de leur tendance à moins explorer leur environnement. Il reste encore à déterminer si l'expression de ce phénotype est la conséquence d'un état de vigilance amoindri ou d'une motivation diminuée à la recherche de récompense. Nos résultats suggèrent que les souris déficientes en hypocrétine affichent une motivation certaine à la recherche de récompense lorsqu'elles sont exposées à des environnements où peu d'efforts sont à fournir afin d'obtenir une récompense.AbstractDrug addiction is a multifactorial disorder affecting human beings regardless their education level, their economic status, their origin or even their gender, but the vulnerability to develop addiction depends on environmental, genetic and psychosocial dispositions. Drug addiction is defined as a chronic relapsing disorder characterized by compulsive drug seeking, with loss of control over drug intake and persistent maladaptive decision making in spite of adverse consequences. The brain mechanisms responsible for drug abuse remain partially unknown despite accumulating evidence delineating molecular and cellular adaptations within the glutamatergic and the dopaminergic systems. However, these adaptations do not fully explain the complex brain disease of drug addiction. The identification of other neurobiological factors responsible for the vulnerability to substance abuse is crucial for the development of promising therapeutic treatments able to alleviate signs of drug dependence.For the past few years, growing evidence demonstrated that a recently discovered brain circuit, the hypocretinergic system, is implicated in many physiological functions, including arousal, energy metabolism, motivation, stress and reward-related behaviors. The hypocretin system is composed of a few thousands neurons arising from the lateral hypothalamus and projecting to the entire brain. Hypocretin- deficient mice have been generated, and unexpectedly, their phenotype resembles that of wild type mice excepting sleep attacks strikingly similar to those of human narcolepsy patients. Evidence suggesting that hypocretins are required for the acquisition and the expression of drug addiction has also been reported; however the precise mechanism by which hypocretins modulate drug seeking behaviors remains a matter of debate. Here, we report alcohol and cocaine reward-related behaviors in hypocretin-deficient mice (KO), as well as heterozygous (HET) and wild type (WT) littermates.We first evaluated the impact of repeated cocaine injections (15 mg/kg, ip) on locomotor sensitization and conditioned place preference. We observed that WT, HET and KO mice exhibited behavioral sensitization following repeated cocaine administrations, but hypocretin deficient males displayed a delayed and attenuated response to chronic cocaine administrations. Interestingly, HET males exhibited an intermediate pattern of behavioral sensitization. However, after standardization of the post-injection data versus the period of habituation prior to cocaine injections, all mice displayed similar amplitudes of behavioral sensitization, except a reduced response in KO males on the first day, suggesting that the delayed and reduced cocaine-induced locomotor sensitization may reflect a hypoactive phenotype and probably not an altered response to repeated cocaine administrations. Unexpectedly, all female mice exhibited similar patterns of cocaine-induced behavioral sensitization. We then assessed the behavioral conditioning for an environment repeatedly paired with cocaine injections (15 mg/kg ip). All mice, whatever their gender or genotype, exhibited a robust preference for the environment previously paired with cocaine administrations. Noteworthy, following two weeks of cocaine abstinence, hypocretin-deficient males and females no longer exhibited any preference for the compartment previously paired with cocaine rewards whereas both WT and HET mice continued manifesting a robust preference. We finally assessed drinking behaviors in WT, HET and KO female mice using a novel paradigm, the IntelliCages®. We report here that KO females tended to less explore the four cage comers where water was easily available. When exposed to four different kinds of liquid solutions (water, ImM quinine or saccharine 0.2%, alcohol 8% and alcohol 16%), KO mice tended to less consume the sweet and the alcoholic beverages. However, after data standardization, no significant differences were noticed between genotypes suggesting that the hypoactive phenotype is most likely accountable for the trend regarding the reduced sweet or alcohol intake in KO.Taken together, the present findings confirm that the behavior seen in Hcrt KO mice likely reflects developmental compensations since only a slightly altered cocaine-induced behavioral sensitization and a normal behavioral conditioning with cocaine were observed in these mice compared to HET and WT littermates. With regards to drinking behaviors, KO mice barely displayed any behavioral changes but a trend for reducing sweet and alcoholic beverages. Overall, the most striking observation is the constant hypoactive phenotype seen in the hypocretin-deficient mice that most likely is accountable for their reduced tendency to explore the environment. Whether this hypoactive phenotype is due to a reduced alertness or reduced motivation for reward seeking remains debatable, but our findings suggest that the hypocretin-deficient mice barely display any altered motivation for reward seeking in environments where low efforts are required to access to a reward.

Characterization of the effects of IL-17F on CHO cell line generation

CHO is the most commonly used mammalian host for the generation of cell lines allowing for the production of high quality therapeutic proteins. The generation of such cell lines is a lengthy and resource-intensive process requiring extensive screening in order to isolate candidates with optimal characteristics, such as growth, stability and productivity. For this reason, the biotechnology industry invests much effort in attempts to optimize CHO expression systems in order to streamline and shorten the cell line selection process. Based on preliminary observations of a facilitated selection of CHO-GS cell lines expressing members of the IL-17 cytokine family, this study investigates the use of IL-17F as a novel enhancing factor for CHO cell line generation. Using two different CHO expression systems (exploiting GS and DHFR-based selection), we demonstrated that IL-17F expression caused a significant increase in the occurrence of colonies during the selection process. All colonies selected produced substantial amounts of IL-17F, suggesting that benefits were conferred, during selection, to those cells expressing the cytokine. Furthermore, transgene expression levels were significantly increased when the selection pressure was raised to a level that would not normally be permissive for colony selection (i.e. 100 |o.M MSX for the CHO-GS expression system or 1000 nM MTX for the CHO-DHFR system). Finally, IL-17F expression was also found to enhance the rate of appearance of clones during single cell subcloning in the absence of selection pressure. Overall, these benefits have the potential to allow a substantial reduction in the length of cell line generation while significantly increasing cell line productivity. Nevertheless, we found that the high IL-17F expression levels required to convey enhancing effects was a limitation when attempting to co-express IL-17F and a recombinant soluble protein of therapeutic interest from independent CMV promoters within the same expression vector. In order to understand and overcome this limitation, studies were designed to characterize the IL-17F enhancing effect at the molecular and cellular level. Regular supplementation of recombinant biologically-active IL-17F into the culture medium during cell line selection was not able to reproduce the enhancing effects of endogenous IL-17F expression. In addition, increased IL-17F expression correlated with increased CHO-GS selection transgene expression at the single cell level. This data suggested a possible effect of IL-17F on viral promoter activity or transgene mRNA stability. It also provided direct evidence that the cells expressing the highest amounts of IL-17F obtained the most benefit. Overall data obtained from these study implied that IL-17F may act through an intracellular mechanism, possibly exerted during secretion. We therefore initiated experiments designed to determine the specific compartment(s) within which IL-17F triggers its effect. This work has identified IL-17F as a potentially powerful tool to optimize the CHO cell line generation process. The characterization of this enhancing effect at the molecular level has given us several insights into overcoming the current limitations, thus paving the way for the development of a viable technology that can be exploited within the biotechnology industry. - La CHO est la cellule hôte de mammifere la plus couramment utilisée dans la création de lignée cellulaire produisant des protéines thérapeutiques de haute qualité. La génération de ces lignées cellulaires est un processus long et exigeant l'utilisation de techniques de sélection robustes afin d'isoler des candidats possédants les caractéristiques optimales de croissance, de productivité et de stabilité d'expression. Les industries biopharmaceutiques ont investi beaucoup d'efforts afin d'optimiser les systèmes d'expression CHO dans le but raccourcir la longueur du procédé de sélection de lignées cellulaires et aussi d'en augmenter l'efficacité. A partir d'observations préliminaires obtenues lors de la génération de lignées cellulaires CHO- GS exprimant une cytokine appartenant à la famille des IL-17, nous avons réalisé une étude portant sur l'utilisation de l'IL-17F humaine (IL-17F) comme nouveau facteur d'optimisation pour la génération de lignées cellulaires CHO. Nous avons démontré, en utilisant les deux systèmes de sélection et d'expression CHO couramment utilisés (le premier exploitant la GS et l'autre basée sur la DHFR), que l'expression de l'IL-17F permet une augmentation significative de la fréquence d'apparition de colonies durant le processus de sélection de lignées cellulaires. Les différentes colonies sélectionnées expriment des quantités substantielles d'IL-17F, suggérant un effet bénéfique lors de la sélection qui serait exclusivement conféré aux cellules exprimant la cytokine. En outre, le niveau d'expression du transgene se trouve significativement augmenté lorsque la pression de sélection est portée à un niveau habituellement trop élevé pour permettre la sélection de colonies (soit 100 |JM MSX pour le système d'expression CHO-GS ou 1000 nM MTX pour le système CHO- DHFR). Enfin, l'expression d'IL-17F permet également d'améliorer la vitesse d'apparition de clones pendant une étape de sous-clonage en l'absence de pression de sélection. L'ensemble de ces effets bénéfiques permettent une réduction substantielle de la durée de génération de lignées cellulaires tout en augmentant considérablement la productivité des lignées obtenues. Néanmoins, nous avons constaté que la nécessité d'exprimer des niveaux élevés d'IL-17F afin obtenir l'ensemble de ses effets bénéfiques devient une contrainte lors de l'utilisation d'un vecteur d'expression composé de deux promoteurs CMV indépendants pour la co-expression de la cytokine et d'une protéine soluble présentant un intérêt thérapeutique. Afin de mieux comprendre et de surmonter cette limitation, plusieurs études ont été effectuées dans le but de mieux caractériser l'effet de IL-17F au niveau subcellulaire. L'apport régulier en IL-17F recombinante et biologiquement active dans le milieu de culture lors de la sélection de lignées cellulaires ne permet pas de reproduire les effets bénéfiques observés par l'expression endogène d'IL-17F. En outre, nous avons constaté que, lors de l'utilisation du système CHO- GS, l'augmentation d'expression de 1TL-17F est corrélée à un accroissement de l'expression du marqueur de sélection au niveau cellulaire. Ces résultats suggèrent un possible effet d'IL- 17F sur l'activité des promoteurs viraux et ainsi fournissent une preuve directe que les cellules exprimant de haut niveau d'IL-17F sont celles qui en profitent le plus. L'ensemble de ces observations mettrait en avant que l'effet d'IL-17F se ferait selon un mécanisme intracellulaire. Nous avons donc étudié le(s) compartiment(s) spécifique(s) dans lequel IL-17F pourrait exercer son effet. Ce travail a permis de définir IL-17F comme un puissant outil pour l'optimisation des procédés de génération de lignées cellulaires CHO. La caractérisation de cette amélioration de l'effet au niveau moléculaire nous a donné plusieurs indications sur la manière de dépasser les limitations actuelles, ouvrant ainsi la voie au développement d'une technologie viable qui peut être exploitée pars l'industrie biotechnologique.