Single-tube nested PCR assay with in-house DNA extraction for Mycobacterium tuberculosis detection in blood and urine

Abstract: INTRODUCTION : Molecular analyses are auxiliary tools for detecting Koch's bacilli in clinical specimens from patients with suspected tuberculosis (TB). However, there are still no efficient diagnostic tests that combine high sensitivity and specificity and yield rapid results in the detection of TB. This study evaluated single-tube nested polymerase chain reaction (STNPCR) as a molecular diagnostic test with low risk of cross contamination for detecting Mycobacterium tuberculosis in clinical samples. METHODS: Mycobacterium tuberculosis deoxyribonucleic acid (DNA) was detected in blood and urine samples by STNPCR followed by agarose gel electrophoresis. In this system, reaction tubes were not opened between the two stages of PCR (simple and nested). RESULTS: STNPCR demonstrated good accuracy in clinical samples with no cross contamination between microtubes. Sensitivity in blood and urine, analyzed in parallel, was 35%-62% for pulmonary and 41%-72% for extrapulmonary TB. The specificity of STNPCR was 100% in most analyses, depending on the type of clinical sample (blood or urine) and clinical form of disease (pulmonary or extrapulmonary). CONCLUSIONS: STNPCR was effective in detecting TB, especially the extrapulmonary form for which sensitivity was higher, and had the advantage of less invasive sample collection from patients for whom a spontaneous sputum sample was unavailable. With low risk of cross contamination, the STNPCR can be used as an adjunct to conventional methods for diagnosing TB.

Molecular characterization of Mycobacterium tuberculosis isolates from Tehran, Iran by restriction fragment length polymorphism analysis and spoligotyping

Abstract: INTRODUCTION Characterization of Mycobacterium tuberculosis (MTB) isolates by DNA fingerprinting has contributed to tuberculosis (TB) control. The aim of this study was to determine the genetic diversity of MTB isolates from Tehran province in Iran. METHODS MTB isolates from 60 Iranian and 10 Afghan TB patients were fingerprinted by standard IS6110-restriction fragment length polymorphism (RFLP) analysis and spoligotyping. RESULTS The copy number of IS6110 ranged from 10-24 per isolate. The isolates were classified into 22 clusters showing ≥ 80% similarity by RFLP analysis. Fourteen multidrug-resistant (MDR) isolates were grouped into 4 IS6110-RFLP clusters, with 10 isolates [71% (95% CI: 45-89%)] in 1 cluster, suggesting a possible epidemiological linkage. Eighteen Iranian isolates showed ≥ 80% similarity with Afghan isolates. There were no strains with identical fingerprints. Spoligotyping of 70 isolates produced 23 distinct patterns. Sixty (85.7%) isolates were grouped into 13 clusters, while the remaining 10 isolates (14.2%) were not clustered. Ural (formerly Haarlem4) (n = 22, 31.4%) was the most common family followed by Central Asian strain (CAS) (n = 18, 25.7%) and T (n = 9, 12.8%) families. Only 1strain was characterized as having the Beijing genotype. Among 60 Iranian and 10 Afghan MTB isolates, 25% (95% CI: 16-37) and 70% (95% CI: 39-89) were categorized as Ural lineage, respectively. CONCLUSIONS A higher prevalence of Ural family MTB isolates among Afghan patients than among Iranian patients suggests the possible transmission of this lineage following the immigration of Afghans to Iran.

Molecular tools in the diagnostic and epidemiology of infections caused by members of Mycobacterium avium Complex

Mycobacterium avium Complex (MAC) comprises microorganisms that affect a wide range of animals including humans. The most relevant are Mycobacterium avium subspecies hominissuis (Mah) with a high impact on public health affecting mainly immunocompromised individuals and Mycobacterium avium subspecies paratuberculosis (Map) causing paratuberculosis in animals with a high economic impact worldwide. In this work, we characterized 28 human and 67 porcine Mah isolates and evaluated the relationship among them by Multiple-Locus Variable number tandem repeat Analysis (MLVA). We concluded that Mah population presented a high genetic diversity and no correlations were inferred based on geographical origin, host or biological sample. For the first time in Portugal Map strains, from asymptomatic bovine faecal samples were isolated highlighting the need of more reliable and rapid diagnostic methods for Map direct detection. Therefore, we developed an IS900 nested real time PCR with high sensitivity and specificity associated with optimized DNA extraction methodologies for faecal and milk samples. We detected 83% of 155 faecal samples from goats, cattle and sheep, and 26% of 98 milk samples from cattle, positive for Map IS900 nested real time PCR. A novel SNPs (single nucleotide polymorphisms) assay to Map characterization based on a Whole Genome Sequencing analysis was developed to elucidate the genetic relationship between strains. Based on sequential detection of 14 SNPs and on a decision tree we were able to differentiate 14 phylogenetic groups with a higher discriminatory power compared to other typing methods. A pigmented Map strain was isolated and characterized evidencing for the first time to our knowledge the existence of pigmented Type C strains. With this work, we intended to improve the ante mortem direct molecular detection of Map, to conscientiously aware for the existence of Map animal infections widespread in Portugal and to contribute to the improvement of Map and Mah epidemiological studies.

Dinâmica do sub-bosque e do estado arbóreo de floresta tropical primária fragmentada na Amazônia Oriental1

Objetivou-se neste trabalho avaliar a dinâmica florestal, sobretudo da regeneração natural, em um fragmento de floresta tropical primária, entre 1998 c 1999, em Peixe-Boi (PA). Foram demarcadas três parcelas permanentes (1 ha cada) onde todos os indivíduos com DAP ≥ 10 cm foram registrados; os indivíduos com 10cm ≥ DAP ≥ 5cm foram amostrados em 6.000 m2, aqueles entre 5cm ≥ DAP ≥ 2cm em 2.400 m2 e com DAP ≤ 2cm em 240 m2. Foram estimados 143.000 indivíduos, desde plântulas até árvores pertencentes a 337 espécies e 76 famílias. Mimosaceae foi a família de maior riqueza (44 espécies); 14 famílias ocorreram com uma única espécie sendo que metade delas apresentaram também um único indivíduo. Independentemente da classe diamétrica verificou-se o egresso de 56 espécies versus o ingresso de 68, gerando um ganho líquido de 12 espécies. A dinâmica da composição e da abundância da regeneração natural foi muito intensa. Observou-se a saída de uma família face ao ingresso de outras 14, aumentando cm quase 30% o número de espécies. A maior mortalidade foi verificada em Bauhinia cf. rutilans e Mabea aff. speciosa (300 e 21 indivíduos). Rinorea negleta e Leçythis idatimon recrutaram 171 e 89 espécimes. A razão recrutamento/ mortalidade foi, em quaisquer das classes diamétricas, sempre superior a unidade. O estoque de mudas para se obter uma árvore, uma arvoreta e uma vara foi, respectivamente de 297, 160 e 48 mudas. O número de espécies e a abundância aumentaram no período, assim como a área basal e a biomassa.

Pseudoescorpiões (Arachnida) da vegetação de sub-bosque da floresta primária tropical de terra firme (Coari, Amazonas, Brasil)

Foi encontrada uma riqueza de 15 espécies de pseudoscorpiões, de 12 gêneros e 5 famílias (Chthoniidae, Geogarypidae, Olpiidae, Atemnidae e Chernetidae), habitando diferentes plantas da vegetação do sub-bosque, em floresta primária de terra firme, no alto rio Urucu, Coari, Amazonas, no período de 1991 a 1996. As plantas foram examinadas pelo método de "bateção". Apolpium aff. vastum foi à espécie mais freqüente e abundante sobre as plantas. Dentre os tipos de plantas avaliados, as maiores diversidades de espécies de pseudoscorpiões foram registradas nas pequenas palmeiras, tanto com fronde junto ao chão, como elevada acima do chão. A análise da composição das espécies que ocorreram sobre os diferentes tipos de plantas avaliadas foi realizada pelo "modo-Q", tendo como base a matriz de coeficientes de similaridade de "Jaccard", o que demonstrou maior similaridade entre a fauna das palmeiras e outras plantas que acumulam detritos acima do chão, entre as bromélias e entre aráceas de chão e outras plantas que acumulam detritos junto ao chão.

Aspectos florísticos, fitossociológicos e ecológicos de um sub-bosque de terra firme na Amazônia Central, Amazonas, Brasil

Os ecossistemas amazônicos caracterizam-se pela alta diversidade de espécies. Foram realizadas as análises florísticas e fitossociológicas de 0,05 ha de um sub-bosque na Amazônia Central (60º12'40" W e 2º35'45" S), adotando-se o critério de distribuição em classes de altura: C1 (altura < 0,5 m), C2 (0,5 < altura < 1,5 m), C3 (1,5 < altura < 3,0 m) e C4 (altura > 3 m e CAP < 0,3 m). Foram levantados 2.434 indivíduos, pertencentes a 67 famílias, 163 gêneros e 355 espécies. Fabaceae (27), Mimosaceae (22), Lauraceae (21), Caesalpiniaceae e Rubiaceae (18) constituem as cinco famílias mais ricas em espécies. Quanto ao número de indivíduos, as famílias Marantaceae (209), Chrysobalanaceae (198), Mimosaceae (191), Burseraceae (175), Annonaceae (172) e Arecaceae (137) foram as mais representativas. No que tange às categorias de altura, os dados mostraram maior número de indivíduos, diversidade e grau de similaridade florística entre as classes 1 e 2. Licania caudata Prance, Duguetia flagellaris Huber, Monotagma tuberosum Hagberg, Protium apiculatum Swart e Pariana cf. campestris Aubl. foram as espécies de maior participação nos parâmetros verticais da regeneração natural e posição sociológica. O padrão agregado de distribuição espacial foi o predominante para as 30 espécies de maior participação na estrutura vertical da fitocenose.

Efeitos da exploração madeireira de baixo impacto sobre uma comunidade de aves de sub-bosque na Floresta Nacional do Tapajós, Pará, Brasil

Este estudo compara a resposta de uma comunidade aves à exploração madeireira de baixo impacto através da distribuição das espécies em floresta controle e manejada ao longo de cinco anos com amostragem pré e pós-exploração. O procedimento de ordenação mostrou que a similaridade da comunidade de aves após a exploração madeireira foi menor que a similaridade entre as amostras do período de pré-exploração. Além disso, a ordem das abundâncias das 43 espécies mais comuns foi alterada entre o período anterior à exploração e 3 a 4 anos após a exploração na floresta manejada. A exploração afetou as taxas de captura de 20 espécies, diretamente ou através de uma interação com o tempo. Os insetívoros terrícolas e os insetívoros que seguem bandos mistos foram as guildas mais afetadas pela exploração madeireira. Ambas as guildas mostraram declínio, correlacionado com o tempo, em suas abundâncias em floresta manejada. Insetívoros seguidores de formigas e insetívoros arborícolas não apresentaram diferenças entre a floresta manejada e controle, apesar de algumas espécies dessas guildas terem apresentado efeitos relacionados ao manejo florestal, diretamente ou através de uma interação entre o tempo e o manejo. Frugívoros também não apresentaram efeitos significativos relacionados ao manejo florestal. Nectarívoros aumentaram tanto na floresta explorada como na floresta controle. Efeitos temporais de aumento ou declínio observados em guildas e em 12 espécies ocorreram tanto na floresta controle como na floresta explorada. Este resultado sugere que mudanças temporais na área explorada podem estar relacionadas à sucessão enquanto que mudanças temporais na floresta controle podem estar relacionados à exploração com intensidade de 40m³/ha de parcelas adjacentes.

Myeloid Sirtuin 2 expression does not impact long-term Mycobacterium tuberculosis control

Sirtuins (Sirts) regulate several cellular mechanisms through deacetylation of several transcription factors and enzymes. Recently, Sirt2 was shown to prevent the development of inflammatory processes and its expression favors acute Listeria monocytogenes infection. The impact of this molecule in the context of chronic infections remains unknown. We found that specific Sirt2 deletion in the myeloid lineage transiently increased Mycobacterium tuberculosis load in the lungs and liver of conditional mice. Sirt2 did not affect long-term infection since no significant differences were observed in the bacterial burden at days 60 and 120 post-infection. The initial increase in M. tuberculosis growth was not due to differences in inflammatory cell infiltrates in the lung, myeloid or CD4+ T cells. The transcription levels of IFN-?, IL-17, TNF, IL-6 and NOS2 were also not affected in the lungs by Sirt2-myeloid specific deletion. Overall, our results demonstrate that Sirt2 expression has a transitory effect in M. tuberculosis infection. Thus, modulation of Sirt2 activity in vivo is not expected to affect chronic infection with M. tuberculosis.

Uso de florestas secundárias por aves de sub-bosque em uma paisagem fragmentada na Amazônia central

Na Amazônia, as taxas de desmatamento crescem desde 1991 e as previsões não são otimistas quanto à desaceleração desse processo. A devastação da floresta é acompanhada de uma expansão de florestas secundárias (FS) que se estabelecem nas áreas abandonadas. A tendência é um aumento de florestas secundárias, resultando num mosaico de floresta contínua e fragmentos separados por uma matriz de FS. Nesse cenário, autores acreditam que a Amazônia pode passar por um processo massivo de extinção de espécies. Por outro lado, a previsão de um processo massivo de extinção pode ser equivocada, pois muitas espécies florestais poderiam sobreviver nas florestas secundárias. Para avaliar o valor das florestas secundárias para espécies florestais amostramos por oito meses com redes de neblina uma capoeira (FS) em regeneração e uma floresta primária (FP) de uma paisagem fragmentada. Algumas espécies não foram capturadas na capoeira e aparentemente evitam esse tipo de hábitat. No entanto, a maioria das espécies do grupo focal não apresentou diferença na sobrevivência aparente entre os ambientes, o que nos indica que estão habitando a capoeira e a floresta primária da mesma forma. Na realidade amazônica, onde grande parte da matriz é composta por floresta secundária, a matriz tem valor para conservação e deve ser analisada como um elemento dinâmico que não apenas permite a movimentação de indivíduos, mas também serve de hábitat para muitas espécies de floresta primária. Mas ressaltamos que é fundamental a preservação de áreas de floresta primária que servirão de fonte às florestas secundárias adjacentes.

Patterns of Mycobacterium tuberculosis-complex excretion and characterization of super-shedders in naturally-infected wild boar and red deer

Wild boar (Sus scrofa) and red deer (Cervus elaphus) are the main maintenance hosts for bovine tuberculosis (bTB) in continental Europe. Understanding Mycobacterium tuberculosis complex (MTC) excretion routes is crucial to define strategies to control bTB in free-ranging populations, nevertheless available information is scarce. Aiming at filling this gap, four different MTC excretion routes (oronasal, bronchial-alveolar, fecal and urinary) were investigated by molecular methods in naturally infected hunter-harvested wild boar and red deer. In addition MTC concentrations were estimated by the Most Probable Number method. MTC DNA was amplified in all types of excretion routes. MTC DNA was amplified in at least one excretion route from 83.0% (CI95 70.8-90.8) of wild ungulates with bTB-like lesions. Oronasal or bronchial-alveolar shedding were detected with higher frequency than fecal shedding (p < 0.001). The majority of shedders yielded MTC concentrations <10(3) CFU/g or mL. However, from those ungulates from which oronasal, bronchial-alveolar and fecal samples were available, 28.2% of wild boar (CI95 16.6-43.8) and 35.7% of red deer (CI95 16.3-61.2) yielded MTC concentrations >10(3) CFU/g or mL (referred here as super-shedders). Red deer have a significantly higher risk of being super-shedders compared to wild boar (OR = 11.8, CI95 2.3-60.2). The existence of super-shedders among the naturally infected population of wild boar and red deer is thus reported here for the first time and MTC DNA concentrations greater than the minimum infective doses were estimated in excretion samples from both species.

Spontaneous healing of Mycobacterium ulcerans lesions in the guinea pig model

Buruli Ulcer (BU) is a necrotizing skin disease caused by Mycobacterium ulcerans infection. BU is characterized by a wide range of clinical forms, including non-ulcerative cutaneous lesions that can evolve into severe ulcers if left untreated. Nevertheless, spontaneous healing has been reported to occur, although knowledge on this process is scarce both in naturally infected humans and experimental models of infection. Animal models are useful since they mimic different spectrums of human BU disease and have the potential to elucidate the pathogenic/protective pathway(s) involved in disease/healing. In this time-lapsed study, we characterized the guinea pig, an animal model of resistance to M. ulcerans, focusing on the macroscopic, microbiological and histological evolution throughout the entire experimental infectious process. Subcutaneous infection of guinea pigs with a virulent strain of M. ulcerans led to early localized swelling, which evolved into small well defined ulcers. These macroscopic observations correlated with the presence of necrosis, acute inflammatory infiltrate and an abundant bacterial load. By the end of the infectious process when ulcerative lesions healed, M. ulcerans viability decreased and the subcutaneous tissue organization returned to its normal state after a process of continuous healing characterized by tissue granulation and reepethelialization. In conclusion, we show that the experimental M. ulcerans infection of the guinea pig mimics the process of spontaneous healing described in BU patients, displaying the potential to uncover correlates of protection against BU, which can ultimately contribute to the development of new prophylactic and therapeutic strategies.

Cibercultura e Sub-culturas: Estética Digital

Introdução: informação, conteúdos, saberes: Os conteúdos digitais; Projeto 1: A vida quotidiana dos infonautas; Netiquette; Produção e consumo cultural na sociedade da informação; Cibercultura e vida académica; Media studies e new media studies; Diversas áreas de pesquisa; Proliferação de questões; Reflexividade dos especialistas do saber prático; A falência das antigas certezas. Estética digital: Sean Cubbit: Digital Aesthetics; Computação estética; Natureza da arte digital; Interfaces; o iPhone e iPad; o Windows 8; Design da interação digital; Luvas de realidade virtual; Inputs diretos da eletricidade cerebral; o Sistema de interação com múltiplas interfaces.

Cibercultura e sub-culturas: Cyberpunk e literatura

Fição científica digital. Cyberpunk: Bruce Betjke; William Gibson; Movimento cyberpunk; Bruce Sterling; Projetos em Cyberpunk; Filosofia do pós-humanismo; Tecnologia quotidiana; Pós-humanismo; Cyborgs; Direitos pós-humanos; Sub-espécies; Novos tempos e espaços.

Lack of the transcription factor hypoxia-inducible factor (HIF)-1α in macrophages accelerates the necrosis of Mycobacterium avium-induced granulomas

Accepted Manuscript

Diversity of non-clinical Acinetobacter species in a sub-saharan Africa region: evidence of carbapenem-hydrolysing class D-β-lactamase producers

[Excerpt] Although Acinetobacter baumannii has been the main agent for healthcare infections, recent reports suggest that some Acinetobacter environmental species should be considered as a potential cause of disease. In Angola, there are no previous data on its environmental reservoirs and resistance features. We aimed to unveil the occurrence and diversity of Acinetobacter species and the presence of resistance mechanisms in different non-clinical settings in Angola.