ELISA de bloqueio monoclonal para o diagnóstico sorológico de infecções pelo herpesvírus bovino tipo 1 (BHV-1)

Um ensaio imunoenzimático do tipo ELISA de bloqueio com anticorpo monoclonal (ELISA-M) foi desenvolvido e padronizado para a detecção de anticorpos contra o vírus da Rinotraqueíte Infecciosa Bovina (Herpesvírus Bovino tipo 1; BHV-1). Foram utilizadas nesta avaliação 266 amostras de soros bovinos, sendo 148 negativos e 118 positivos em testes de soroneutralização (SN). Em comparação com este último, o ELISA-M demonstrou uma sensibilidade de 92,37%, especificidade de 92,56%, valor preditivo positivo de 90,83%, valor preditivo negativo de 93,83% e precisão de 92,48%. O índice de concordância (k) entre os testes foi de 0,85. O ELISA-M apresentou como vantagens a rapidez e a praticidade de execução. Com base nestes resultados, o ELISA-M foi considerado uma alternativa apropriada para o diagnóstico sorológico de infecções pelo BHV-1. Entretanto, o teste não foi capaz de diferenciar anticorpos induzidos por BHV-1 ou BHV-5.

Resistência de bactérias isoladas de cães e gatos no Hospital Veterinário da Universidade Estadual de Londrina (2008-2009)

Foi determinado o perfil de resistência de bactérias isoladas de diversas afecções em cães e gatos atendidos no Setor de Clinica Cirúrgica de Animais de Companhia do Hospital Veterinário da Universidade Estadual de Londrina. Houve maior frequência de Staphylococcus spp. (27,6%), seguido por Pseudomonas spp. (22,7%) e Escherichia coli (16,6%). Na prova de sensibilidade antimicrobiana pelo método de difusão em ágar houve alta porcentagem de resistência das bactérias isoladas aos principais antibióticos usados no tratamento das infecções do trato urinário, principalmente das bactérias Gram negativas que apresentaram resistência superior a 66% aos antibióticos testados, com exceção da norfloxacina. Nas bactérias isoladas de feridas, apenas a gentamicina e a amicacina demonstraram índices de resistência inferior a 50,0%. Nas bactérias isoladas das afecções otológicas observou-se menor resistência à norfloxacina e maior à neomicina, sendo os menores índices de resistência observados nas bactérias Gram positivas. As bactérias Gram positivas apresentaram maior resistência à ciprofloxacina nos casos ortopédicos, e nas bactérias isoladas das peritonites houve 100% de resistência a diversos antibióticos. Este trabalho ressalta a importância da identificação bacteriana e a realização de antibiogramas para a escolha do agente antimicrobiano apropriado no tratamento das principais afecções atendidas na área de animais de companhia em medicina veterinária.

Surto de abscesso mandibular por Pseudomonas aeruginosa em ovinos

Descreve-se um surto de abscesso mandibular em ovelhas da raça Bergamácia no município de Botucatu, estado de São Paulo. Do rebanho de 120 animais, 35 apresentaram aumento de volume mandibular com a presença de nódulos únicos, de consistência pétrea, de diferentes tamanhos, fistulados ou não e sem indicativos de inflamação dos tecidos moles adjacentes. Os animais eram criados em pasto de Panicum maximum cv. Tanzânia com água e sal mineral ad libitum e everminados, via oral, com pistolas dosificadoras. O material para diagnóstico microbiológico e antibiograma foi coletado de cinco animais acometidos, por punção e aspiração dos nódulos. Dos 35 animais acometidos, 19 foram submetidos ao exame radiográfico, um ao exame tomográfico e outro à biópsia óssea da região submandibular. O único ovino que morreu, encontrava-se em estado de caquexia provavelmente devido à localização do aumento de volume que afetou a implantação dos dentes molares daquela região impedindo a apreensão e mastigação adequadas levando a perda da condição corporal e morte. Ao exame necroscópico, observaram-se áreas de necrose caseosa na mandíbula direita de onde isolou-se Pseudomonas aeruginosa. O tratamento utilizado foi baseado na aplicação de iodeto de sódio a 10% por via intramuscular e antibioticoterapia segundo antibiograma com enrofloxacina por via intramuscular, porém com pouca eficácia. Diante do quadro clínico, dos dados de anamnese, da localização das lesões no tecido ósseo mandibular, do resultado do cultivo microbiológico, das alterações radiográficas e tomográficas foi feito o diagnóstico de abscesso mandibular causado por Pseudomonas aeruginosa.

Estudo da ocorrência de infecção hospitalar em cães e gatos em um centro cirúrgico veterinário universitário

Infecção hospitalar ou nosocomial é aquela adquirida durante a hospitalização do paciente, e que pode ser relacionada os procedimentos hospitalares invasivos realizados durante o internamento. O presente trabalho teve como objetivos estudar a ocorrência de infecção hospitalar em animais atendidos em um Centro Cirúrgico Veterinário Universitário de Pequenos Animais submetidos a procedimentos cirúrgicos e/ou invasivos; discutir as possíveis causas de infecção, detectar as bactérias presentes quando possível e verificar a sensibilidade antimicrobiana destes agentes. O trabalho foi desenvolvido através do acompanhamento diário de 131 animais internados neste setor e busca ativa de casos de infecção hospitalar. Em 104 animais (91 cães e 13 felinos), foram realizados 113 procedimentos cirúrgicos e em 27 animais condutas não cirúrgicas tais como acompanhamento de parto e pós-parto, desobstrução uretral e colocação de talas. Todos os animais foram submetidos à colocação de cateter para fluidoterapia e/ou aplicação de medicamentos e/ou anestésicos em algum momento durante o internamento. O índice de infecção do sítio cirúrgico foi de 7,96% sendo 4,54% nas cirurgias limpas, 4,25% nas cirurgias limpa-contaminadas, 10,53% nas cirurgias contaminadas e 16% nas cirurgias infectadas. A taxa de infecção hospitalar não cirúrgica no paciente cirúrgico foi de 2,88% e 3,7% no paciente não cirúrgico. Foram cultivados sete isolados bacterianos, sendo Pseudomonas sp. (3), Streptococcus sp. (2), Acinetobacter sp. (1) e bacilo Gram negativo (1), constatando-se multirresistência bacteriana alta em todos os isolados. A duração da cirurgia e os tempos de internamento pré e pós-operatório não influenciaram na ocorrência de infecção hospitalar, mas os fatores que provavelmente colaboraram para a ocorrência de infecções no presente trabalho foram a própria gravidade da doença que motivou o tratamento, o tipo de procedimento realizado e a gravidade das lesões concomitantes.

Precisão da tira reagente e do exame microscópico da urina no diagnóstico de infecções do trato urinário em porcas

O diagnóstico de infecção do trato urinário (ITU) em porcas geralmente é feito com o auxílio de tiras reagentes, por ser um método rápido, prático e passível de ser realizado na própria granja. O exame microscópico da urina raramente é utilizado em granjas por ser uma técnica mais demorada e trabalhosa. No entanto, não existem estudos sobre a precisão destas duas técnicas no diagnóstico de ITU nesta espécie. O objetivo deste estudo foi avaliar a precisão da tira reagente e do exame microscópico da urina no diagnóstico de ITU em porcas, comparando-os com o exame bacteriológico da urina. Para selecionar as porcas que iriam compor o estudo foi realizado um exame químico prévio com tira reagente, do qual foram selecionadas 139 porcas, 66 positivas para nitrito na tira reagente e 73 negativas. No dia seguinte foi realizada uma nova coleta de urina destas 139 porcas para realização da urinálise completa, que incluiu os exames físico, químico, microscópico e microbiológico destas amostras de urina. Os resultados demonstraram que a prova de nitrito da tira reagente apresentou 100% de especificidade e 93% de sensibilidade. A especificidade do exame microscópico para bacteriúria foi de 82% e a sensibilidade de 100%. O diagnóstico de ITU com o uso de tiras reagentes e/ou com exame microscópico da urina é confiável, quando comparado com o exame bacteriológico da urina, o que torna possível o diagnóstico rápido de ITU em porcas na granja.

Endothelium-dependent vasodilation in response to Pseudomonas aeruginosa lipopolysaccharide: an in vitro study on canine arteries

Early systemic arterial hypotension is a common clinical feature of Pseudomonas septicemia. To determine if Pseudomonas aeruginosa endotoxin induces the release of endothelium-derived nitric oxide (EDNO), an endogenous nitrovasodilator, segments of canine femoral, renal, hepatic, superior mesenteric, and left circumflex coronary arteries were suspended in organ chambers (physiological salt solution, 95% O2/5% CO2, pH 7.4, 37oC) to measure isometric force. In arterial segments contracted with 2 µM prostaglandin F2a, Pseudomonas endotoxin (lipopolysaccharide (LPS) serotype 10(Habs) from Pseudomonas aeruginosa (0.05 to 0.50 mg/ml)) induced concentration-dependent relaxation of segments with endothelium (P<0.05) but no significant change in tension of arteries without endothelium. Endothelium-dependent relaxation in response to Pseudomonas LPS occurred in the presence of 1 µM indomethacin, but could be blocked in the coronary artery with 10 µM NG-monomethyl-L-arginine (L-NMMA), a competitive inhibitor of nitric oxide synthesis from L-arginine. The inhibitory effect of L-NMMA on LPS-mediated vasorelaxation of the coronary artery could be reversed by exogenous 100 µM L-arginine but not by 100 µM D-arginine. These experiments indicate that Pseudomonas endotoxin induces synthesis of nitric oxide from L-arginine by the vascular endothelium. LPS-mediated production of EDNO by the endothelium, possibly through the action of constitutive nitric oxide synthase (NOSc), may decrease systemic vascular resistance and may be the mechanism of early hypotension characteristic of Pseudomonas septicemia.

Typing of Pseudomonas aeruginosa from hospitalized patients: a comparison of susceptibility and biochemical profiles with genotype

Typing techniques are essential for understanding hospital epidemiology, permitting the elucidation of the source of infection and routes of bacterial transmission. Although DNA-based techniques are the "gold standard" for the epidemiological study of Pseudomonas aeruginosa, antibiotic profiles and biochemical results are used because they are easy to perform and to interpret and relatively inexpensive. Antibiotypes (susceptibility profiles) and biotypes (biochemical profiles) were compared to genotypes established by DNA restriction enzyme analysis in 81 clinical isolates of P. aeruginosa from three hospitals in Porto Alegre, Brazil. The epidemiological relationship among patients was also evaluated. Susceptibility and restriction profiles were discrepant in more than 50% of the cases, and many antibiotypes were observed among isolates from the same genotype. Furthermore, susceptibility profiles did not allow the distinction of isolates from unrelated genotypes. Since a large number of isolates (63%) yielded the same biochemical results, only 10 biotypes were detected, showing that this typing method has a low discriminatory power. On the other hand, DNA restriction enzyme typing allowed us to establish 71 distinct types. Epidemiological data about the relation among P. aeruginosa isolates were not conclusive. The results of the present study indicate that the only method that can establish a clonal relation is DNA restriction enzyme typing, whereas the other methods may cause misleading interpretations and are inadequate to guide proper infection control measures.

Characterization of bacteriophages infecting clinical isolates of Pseudomonas aeruginosa stored in a culture collection

Some clinical isolates of Pseudomonas aeruginosa stored in our culture collection did not grow or grew poorly and showed lysis on the culture plates when removed from the collection and inoculated on MacConkey agar. One hypothesis was that bacteriophages had infected and killed those clinical isolates. To check the best storage conditions to maintain viable P. aeruginosa for a longer time, clinical isolates were stored at various temperatures and were grown monthly. We investigated the presence of phage in 10 clinical isolates of P. aeruginosa stored in our culture collection. Four strains of P. aeruginosa were infected by phages that were characterized by electron microscopy and isolated to assess their ability to infect. The best condition to maintain the viability of the strains during storage was in water at room temperature. Three Siphoviridae and two Myoviridae phages were visualized and characterized by morphology. We confirmed the presence of bacteriophages infecting clinical isolates, and their ability to infect and lyse alternative hosts. Strain PAO1, however, did not show lysis to any phage. Mucoid and multidrug resistant strains of P. aeruginosa showed lysis to 50% of the phages tested.

Variação da microbiota natural e de pseudomonas aeruginosa em água mineral não carbonatada embalada em diferentes materiais durante o armazenamento a 30°c ± 1°c

Garrafas de PVC, polipropileno e vidro adequadamente limpas e sanificadas foram enxaguadas e enchidas com água mineral de uma fonte localizada no município de Lindóia-SP, e a seguir armazenadas a 30°C ± 1°C. Foram enumerados os microrganismos heterotróficos totais nos meios Ágar Padrão para Contagem e Ágar R2A imediatamente após engarrafamento. A variação da contaminação foi seguida através de exames periódicos. A variação da população de Pseudomonas aeruginosa foi estudada inoculando garrafas contendo água mineral com uma suspensão de P. aeruginosa ATCC 10145 de maneira a se obter uma contaminação de aproximadamente 10² UFC/ml. A população da bactéria foi avaliada periodicamente durante o tempo de armazenamento usando o meio Ágar Pseudomonas P. Houve aumento da população dos microrganismos heterotróficos totais nos primeiros 30 dias de armazenamento para depois diminuir de maneira irregular e ficar aproximadamente constante até completar 6 meses de observação. As contagens de P. aeruginosa aumentaram sensivelmente nas 2 primeiras semanas de estocagem diminuindo ligeiramente a seguir até atingir níveis próximos ao inicial. Não foram constatadas diferenças entre os 3 tipos de materiais de embalagem comparados.

Resistência antimicrobiana de Pseudomonas aeruginosa isolados de pescado e de cortes e de miúdos de frango

Pseudomonas aeruginosa isolados de peixes de água doce e de frangos foram submetidos ao teste de suscetibilidade aos antimicrobianos utilizando quatorze drogas, com o objetivo de determinar e confrontar os padrões de suscetibilidade deste microrganismo. As cepas oriundas de peixes pertenciam à coleção do Laboratório de Bacterioses/IV/UFRRJ. Para o isolamento das cepas, foram selecionados miúdos (fígado) e cortes (coxa e sobrecoxa) de frangos adquiridos em estabelecimentos comerciais no município do Rio de Janeiro. A metodologia de isolamento incluiu o enriquecimento em água peptonada, seguido de semeadura em Agar EMB e Agar GSP. Para as cepas oriundas de peixes, procedeu-se à reativação em água peptonada, seguida de reisolamento em Agar EMB. Colônias sugestivas foram transferidas para Agar TSI e LIA para avaliação das características metabólicas. A capacidade de produção de pigmento verde-azulado foi avaliada em Agar Mueller-Hinton e a da enzima citocromo-oxidase, em Agar Nutriente. O teste de suscetibilidade a antimicrobianos realizado nas 63 cepas revelou maiores percentuais de resistência para NAL e NIT (96,8%), TCY (93,6%), AMC (92,1%), CHL (90,5%) e SXT (85,7%), destacando-se a multirresistência dos isolados. A totalidade das cepas oriundas de frangos apresentou sensibilidade a CAZ e IPM e nos isolados de peixes a ATM, CAZ, IPM e AMK.

The adherence of Pseudomonas fluorescens to marble, granite, synthetic polymers, and stainless steel

The adherence of Pseudomonas fluorescens cells to nine food-processing contact surfaces was evaluated using the plate-count method. The surfaces include marble, granite, stainless steel, polyvinyl chloride, polyurethane, and silicone-coated cloth, which have been used only in a few studies concerning bacterial adherence. The number of cells adhered to the surfaces increased with contact time reaching 5.0-6.1 log CDM.cm-2 after 10 hours, which can be considered a well established adherence process. The number of adhered cells doubled in 29.5 minutes and 23.5 minutes on stainless steel and thin polyvinyl chloride-coated cloth, respectively. For the other surfaces, this value was 9.8 minutes on average. Marble, granite, thick polyvinyl-coated cloth, double-faced rugous polyurethane, and silicone-coated cloth were not different (p < 0.05) in their ability to adhere cells (CFU/cm²) after 2 and 10 hours. The surfaces that had higher percentage of similarity in the adhesion level and higher log CFU/cm² of adhered cells were double-faced rugous polyurethane, silicone-coated cloth, and granite. The surfaces showed very different microtopography characteristics when viewed using scanning electron microscopy. This experiment showed the importance of using appropriate materials for food contact during processing, which will affect the cleaning and sanitation procedures.

Influência da velocidade de circulação do leite na adesão de Pseudomonas aeruginosa sobre aço inoxidável

A influência da velocidade de circulação do leite na adesão bacteriana de Pseudomonas aeruginosa foi avaliada em teste de uso simulado por meio de um modelo de circuito de processamento de leite. O circuito é composto por uma tubulação de aço inoxidável AISI 304, com 1,9 cm de diâmetro e 5,8 m de comprimento, além de um tanque de 25 L, utilizado como reservatório do produto e das soluções sanitizantes. O reservatório foi acoplado a uma bomba centrífuga de ½ HP, para impulsionar o alimento ou soluções de higienização pelo sistema equipado com cupons de prova em aço inoxidável nas formas cilíndrica, cotovelo 90º e T. As velocidades de circulação foram de 0,5, 1,0 e 1,5 m.s-1, correspondentes a fluxo turbulento com número de Reynolds de 14.000, 28.000 e 42.000, respectivamente. Quando se utilizou velocidade de 0,5 m.s-1, permaneceram aderidas à superfície 10,7% das células. Já nas velocidades e 1,0 e 1,5 m.s-1 as porcentagens de adesão foram de 5,36 e 4,9%, respectivamente, o que demonstra uma menor remoção de células aderidas à medida que o fluxo diminui, permitindo assim que mais células permaneçam aderidas na linha de produção, o que pode favorecer a formação de biofilmes.

Effectiveness of cleaning and sanitizing procedures in controlling the adherence of Pseudomonas fluorescens, Salmonella Enteritidis, and Staphylococcus aureus to domestic kitchen surfaces

The effectiveness of cleaning and sanitizing procedures in controlling Staphylococcus aureus, Salmonella Enteritidis, and Pseudomonasfluorescens adhered to granite and stainless steel was evaluated. There was no significant difference (p > 0.05) in the adherence of pure cultures of these microorganisms to stainless steel. The numbers of P. fluorescens and S. Enteritidis adhered to granite were greater (p < 0.05) than the numbers of S. aureus. Additionally, the adherence of P. fluorescens was similar to the adherence of S. Enteritidis on granite surface. In a mixed culture with P. fluorescens, S aureus adhered less (p < 0.05) to stainless steel surfaces (1.31 log CFU.cm-2) than when in a pure culture (6.10 log CFU.cm-2). These results suggest that P. fluorescens inhibited the adherence of S. aureus. However, this inhibition was not observed in the adherence process for granite. There was a significant difference (p < 0.05) between the number of adhered cells before and after pre-washing for S. aureus on stainless steel and granite surfaces, and after washing with detergent for all microorganisms and surfaces. The efficiency of the cleaning plus sanitizing procedures was not significantly different (p > 0.05) between the surfaces. However, a significant difference was observed (p < 0.05) between the sanitizer solutions. Sodium hypochlorite and peracetic acid were more bactericidal (p < 0.05) than a quaternary ammonium compound. With regard to microorganisms, S. aureus was the least resistant to the sanitizers. These results show the importance of good cleaning and sanitization procedures to prevent bacterial adherence and biofilm formation.

Avaliação da lipase extracelular de Pseudomonas cepacia para purificação em sistema bifásico aquoso

O presente trabalho teve como objetivo a produção de lipase a partir de Pseudomona cepacia por fermentação líquida em biorreator do tipo Bioflo III. As fermentações foram conduzidas a 150 rpm durante 96 horas a 30 °C. Analisou-se a atividade enzimática em diferentes condições de temperatura (20 a 50 °C) e pH (3,0 a 11,0), e obtiveram-se 37 °C e 8,0, as condições ótimas, respectivamente. Para avaliar a estabilidade térmica, a enzima foi incubada em temperaturas de 40, 50 e 60 °C durante 120 minutos. Em uma segunda etapa, foram realizados experimentos preliminares para verificar as condições adequadas de partição da enzima, bem como sua estabilidade e condições ótimas de hidrólise frente às modificações de temperatura e pH. Foram preparadas soluções de PEG 1500, 4000 e 6000 a 50% p/p e soluções tampão fosfato de pHs 6, 7 e 8. Foi feita a caracterização de um sistema bifásico aquoso (SBA) a partir da preparação de soluções estoques de PEG com massas molares de 1500, 4000 e 6000 (50% w/w) e tampão fosfato pH 6,7 e 8,0 (20% w/w de KH2PO4/K2HPO4). Esta caracterização do SBA posteriormente poderá ser utilizada para partição de lipases, bem como de biomoléculas que estejam dentro dessa faixa de pH.

Chemical sanitizers to control biofilms formed by two Pseudomonas species on stainless steel surface

The biofilm formation of Pseudomonas aeruginosa and Pseudomonas fluorescens on AISI 304 stainless steel in the presence of reconstituted skim milk under different temperatures was conducted, and the potential of three chemical sanitizers in removing the mono-species biofilms formed was compared. Pseudomonas aeruginosa cultivated in skim milk at 28 °C presented better growth rate (10.4 log CFU.mL-1) when compared with 3.7 and 4.2 log CFU.mL-1 for P. aeruginosa and P. fluorescens cultivated at 7 °C, respectively. Pseudomonas aeruginosa formed biofilm when cultivated at 28 °C. However, only the adhesion of P. aeruginosa and P. fluorescens was observed when incubated at 7 °C. The sodium dichloroisocyanurate was the most efficient sanitizer in the reduction of the adhered P. aeruginosa cells at 7 and 28 °C and those on the biofilm, respectively. The hydrogen peroxide was more effective in the reduction of adhered cells of P. fluorescens at 7 °C.