Die Beeinflussung einer Th2-Zell-vermittelten Immunantwort durch Interleukin-1-alpha am Beispiel des murinen allergischen Asthmas

Dass durch IL-1α die Th1-vermittelte Immunreaktion der kutanen Leishmaniasis beeinflusst werden kann, konnte unsere Arbeitsgruppe bereits zeigen. Daran anknüpfend war das Ziel meiner Dissertation zu prüfen, ob sich diese Erkenntnisse im Modell des murinen allergischen Asthmas reproduzieren lassen, auch im Sinne eines zukünftigen therapeutischen Nutzens für die Behandlung dieser epidemiologisch hochrelevanten Erkrankung. Daneben sollte die Verwendung der gesamten murinen Lunge als Quelle für Untersuchungsmaterial erschlossen werden. Zu diesem Zweck wurden bei BALB/c Mäusen ein (OVA)/Alum-induziertes allergisches Asthma in Gegenwart oder Abwesenheit von IL-1α generiert. Anschließend wurde eine broncheoalveoläre Lavage (BAL) durchgeführt, bzw. die komplette linke Lunge gewonnen und prozessiert. Der Einfluss von IL-1α auf den Phänotyp der Th2-vermittelten Immunantwort ließ sich auf zytomorphologischer, durchflusszytometrischer und Zytokin-Ebene nachweisen. So zeigte ein Teil unserer Ergebnisse, dass nach der frühen Gabe eine Tendenz zur Verlagerung des Gewichtes der Abwehrreaktion von Th2 in Richtung Th1 besteht. Ebenso fanden sich Hinweise für eine relative Augmentation der Th2-Antwort durch den Einsatz von IL-1α zu einem späteren Zeitpunkt. Eine absolute Verstärkung der Th2-Reaktion auf OVA durch IL-1α konnten wir nicht messen. Hier scheint mit OVA allein schon eine maximale Ausprägung erreicht zu sein. Neben den Th1/Th2-Effekten wurden auch einige gegenläufige Beobachtungen gemacht, welche nicht a priori durch das Th1/Th2-Paradigma zu erklären sind, sondern den Einfluß von IL-1α auf andere Systeme belegen, wie z. B. die Wirkung auf CCL28 und regulatorische T-Zellen. Für die Gewinnung von inflammatorischen Zellen aus der kompletten Lunge und deren weitere Untersuchung konnten wir eine Methode entwickeln und standardisieren, welche relativ einfach in der Durchführung ist und zuverlässig eine im Verhältnis zur BAL hohe Zellzahl liefert, was wiederum ein breites Spektrum an weiteren Untersuchungen erlaubt. Durch den Vorgang der mechanischen und enzymatischen Prozessierung scheinen die funktionellen Eigenschaften der Zellen nicht wesentlich beeinträchtigt zu sein. Der Einsatz von IL-1α resultierte letztendlich in einem Mischbild an hervorgerufenen Veränderungen und es bedarf noch weiterer Studien, um die unterschiedlichen induzierten Mechanismen sauber voneinander zu trennen und den therapeutischen Nutzen von IL-1α im allergischen Asthma zu evaluieren.

The role of B cells during acute and latent infections with murine cytomegalovirus and Leishmania major

This thesis focuses on the role of B cells in mCMV and Leishmania major infection. B cells are an essential component of the adaptive immune system and play a key role in the humoral immune response. In mCMV infection we analyzed the influence of B cells on the virus-specific CD8 T cell response, in detail the role of B cells as IL-10 secreting cells, as source of immunoglobulin (Ig) and as antigen presenting cells. In Leishmania major infection we investigated the role of Ig in Th1 and Th2 directed disease.rnWe found in mCMV infection that the B cell secreted IL-10 suppresses effectively the acute virus-specific CD8 T cell response, while the IL-10 secreted by dendritic cell has no obvious effect. Ig has no effect in the acute virus-specific CD8 T cell response, but in memory response Ig is essential. If Ig is missing the CD8 T cell population remains high in memory response 135 days post infection. The complete absence of B cells dramatically reduces the acute virus-specific CD8 T cell response, while B cell reconstitution just partially rescues this dramatic reduction. A comparison of this reduction in a B cell free organism to an organism with depleted dendritic cells gave a similar result. To exclude a malfunction of the CD8 T cells in the B cell deficient mice, the decreased virus-specific CD8 T cell population was confirmed in a B cell depletion model. Further, bone marrow chimeras with a B cell compartment deficient for CD40-/- showed a decrease of the virus-specific response and an involvement of CD40 on B cells. Taken together these results suggest a role for B cells in antigen presentation during mCMV infection.rnFurther we took advantage of the altered mCMV specific CD8 T cell memory response in mice without Ig to investigate the memory inflation of CD8 T cells specific for distinct mCMV specifc peptides. Using a SIINFEKL-presenting virus system, we were able to shorten the time until the memory inflation occurs and show that direct presentation stimulates the memory inflation. rnIn Leishmania major infection, Ig of Th2 balanced BALB/c mice has a central role in preventing a systemic infection, although the ear lesions are smaller in IgMi mice without specific Ig. Here the parasite loads of ears and spleen are elevated, and an IMS-reconstitution does not affect the parasite load. In contrast in Th1 balanced C57BL/6 mice, reconstitution of IgMi mice with serum of either untreated or immunized mice decreased the parasite load of spleen and ear, further IMS treatment reduces the size of the spleen and the cytokine-levels of IL-10, IL-4, IL-2 and IFN-γ to a level comparable to wt mice. rn

Untersuchung von T-Zell-vermittelten Immunantworten in der murinen und humanen kutanen Leishmaniasis

Für die Ausheilung von L. major-Infektionen ist eine effektive Th1-/Tc1-Antwort unerlässlich. Dennoch sind bis heute nicht alle Mechanismen der schützenden Immunabwehr beim Menschen und in der Maus endgültig geklärt. Deshalb bestand das Ziel der vorliegenden Arbeit darin, Th1-/Tc1-Antworten und damit die Schnittstelle zwischen angeborenem und adaptivem Immunsystem eingehender zu untersuchen. Für diesen Ansatz wurde zunächst der Einfluss des genetischen Hintergrundes auf den Verlauf der Infektion anhand von BALB/c- und C57BL/6-Zellen analysiert. Als entscheidender Faktor für Heilung und Suszeptibilität wurde mit Hilfe von Knochenmarkschimären die Herkunft der T und/oder B Zellen identifiziert. Erst die Aktivierung durch Th1-/Tc1-Zellen versetzt L. major-infizierte Makrophagen in die Lage, die intrazellulären Parasiten abzutöten. In diesem Aktivierungsprozess spielt die TNF-induzierte Signalweiterleitung über den TNF-Rezeptor 1 (TNF-R1) eine wichtige Rolle. TNF-R1 ist mit dem Signalmolekül FAN assoziiert. In dieser Arbeit konnte anhand von Mäusen, denen FAN fehlt, die Involvierung dieses Moleküls in der Induktion eines Th1-Zytokinsprofils und in der Kontrolle der Parasitenzahl sowie der lokalen Begrenzung der Infektion gezeigt werden. Weiterhin wurde unter Verwendung immundefizienter Mäuse die Realisierbarkeit eines PBMC-Transfermodells geprüft. Ein solches wird zur Validierung an Mäusen gewonnener Erkenntnisse und als präklinisches Testsystem der humanen kutanen Leishmaniasis dringend benötigt. In allen getesteten Stämmen ließ sich durch den Transfer humaner PBMC die L. major-Infektion beeinflussen. Humane CD4+ und CD8+ T-Zellen waren an den Infektionsstellen präsent und es konnten antigenspezifische Immunreaktionen nnachgewiesen werden. Das PBMC-Transfermodell konnte durch die Transplantation humaner Haut auf immundefiziente Mäuse zusätzlich entscheidend verbessert werden. In diesen Transplantaten ließen sich L. major-Infektionen etablieren und durch zusätzlichen Transfer von PBMC die Zahl humaner CD45+ Zellen an der Infektionsstelle deutlich steigern. In ihrer Gesamtheit trägt die vorliegende Arbeit wesentlich zum Verständnis der Determinanten von Heilung und Suszeptibilität der kutanen Leishmaniasis bei und zeigt neue Ansatzpunkte für eine Beeinflussung des Krankheitsverlaufes auf. Die Etablierung eines präklinischen Testmodells der humanen Leishmaniasis ist entscheidend, um das Wissen über die murine Leishmaniasis auf die humane Erkrankung zu übertragen. So kann dem dauerhaften Problem der Entwicklung von Vakzinen an Mäusen, die keine Wirksamkeit gegen die humane Erkrankung zeigen, begegnet werden. Ein vollständig etabliertes Modell wird es ermöglichen, der humanen Erkrankung zugrundeliegende Mechanismen zu untersuchen und Patienten-spezifisch aber auch allgemeingültig Vakzinierungs-Ansätze und Therapien unter experimentellen Bedingungen zu testen.

Ursachen der Anthrazyklin-induzierten Kardiotoxizität : Einfluss der individuellen genetischen Ausstattung, des oxidativen Stresses und der Metabolisierung

Doxorubizin (Dox) gehört zur Gruppe der Anthrazykline, welche seit mehreren Jahrzehnten erfolgreich gegen ein breites Spektrum an Tumoren eingesetzt wird. Neben der guten Wirksamkeit besitzt Dox jedoch auch ein sehr hohes Nebenwirkungspotential. Die wohl folgenschwerste Nebenwirkung stellt die irreversible Schädigung des Herzens dar. Zahlreiche Faktoren, wie zum Beispiel die kumulative Dox-Dosis konnten bereits mit einer erhöhten Inzidenz an kardialen Schäden in Verbindung gebracht werden. Bislang ungeklärt war jedoch die Frage, warum Patienten unterschiedlich sensibel auf die Verabreichung von Dox reagierten. rnAn dem Patientenkollektiv der Ricover60-Studie wurde der Einfluss der individuellen genetischen Ausstattung auf die Entstehung der Anthrazyklin-induzierten Herzschädigung untersucht. Alle Patienten mit Dox-induzierten Herzschäden wurden identifiziert und auf das Vorhandensein von genetischen Polymorphismen der NAD(P)H-Oxidase (CYBA, RAC2 und NCF4) und der Anthrazyklin-Transporter (MRP1 und MRP2) untersucht. Sowohl für CYBA als auch für RAC2 konnte eine Anreicherung bestimmter Genotypen (CYBA: CT/TT; RAC2: TA/AA) in der Gruppe der herzgeschädigten Patienten nachgewiesen werden. In der Multivariaten Analyse von RAC2 erreichte diese Anreicherung ein signifikantes Niveau (p=0.028). Damit konnte für diesen Polymorphismus die klinische Relevanz bestätigt werden.rnDie Ursachen der Dox-induzierten Toxizität wurden außerdem an verschiedenen Mäusestämmen und Zelllinien untersucht. Balb/c- und C57BL/6-Mäuse, die bekanntermassen unterschiedlich sensibel auf Dox reagierten, wurden mit Dox behandelt. Anschliessend wurden die Organe Herz, Leber und Blut via HPLC untersucht. Es konnte gezeigt werden, dass sich 1. die Hauptanreicherungsorte für Dox und Doxol (Balb/c: Herz und Blut versus C57BL/6: Leber), 2. die nachgewiesenen Gesamtmengen an Dox+Doxol+Doxon in den drei Organen (MengeC57BL/6 > MengeBalb/c) sowie 3. die An- und Abflutungsgeschwindigkeiten von Dox zwischen den beiden Mäusestämmen unterscheiden. Schlussendlich konnte im Vergleich zu den Balb/c-Mäusen, bei den C57BL/6-Mäusen eine stärkere kardiale Anreicherung von Dox nach der mehrmaligen Dox-Injektion nachgewiesen werden. Somit scheinen der deutlich höhere Dox-Gehalt und die längere Verweilzeit in den Herzen für die stärkere kardiale Schädigung der C57BL/6-Mäuse verantwortlich zu sein. Hingegen verlief die Art der Dox-Metabolisierung in beiden Mäusestämmen ähnlich. rnBei der Betrachtung des oxidativen Stresses konnte gezeigt werden, dass in den Herzen der C57BL/6-Mäusen ein gröβerer oxidativer Stress vorlag, als bei den Balb/c-Mäusen. Ähnlich wie bei der Ricover60-Studie ließ sich auch bei den Mäusen eine Beteiligung der NAD(P)H-Oxidase am Dox-induzierten oxidativen Stress nachweisen. rnMit der HTETOP-Zelllinie konnte gezeigt werden, dass Dox unter physiologischen Bedingungen oxidativen Stress auslösen kann. Die Art und die Konzentration der gebildeten ROS waren abhängig von der Dox-Konzentration, der Einwirkzeit und der Kompensationsfähigkeit der Zellen. Durch die Gabe von Dex ließ sich das Ausmaß des oxidativen Stresses lediglich in den Mäuseherzen reduzieren. In den HTETOP-Zellen zeigte Dex selbst stressauslösende Eigenschaften. Durch die Behandlung mit Dex / DOXY konnte gezeigt werden, dass die Hemmung der Topo IIα selbst oxidativen Stress in den HTETOP-Zellen auslöst. Jedoch scheint weder die Topo IIalpha-Hemmung, noch der Dox-induzierte oxidative Stress bei physiologischen Dox-Konzentrationen (< 1 µM) eine entscheidende Rolle für die Toxizität zu spielen. rnIn der Mikroarray-Analyse der HTETOP-Zellen konnten verschiedene Gene identifiziert werden, die in den oxidativen Stress involviert sind und die durch die Gabe von Dox differentiell reguliert werden. Durch die Komedikation mit Dex / DOXY ließen sich diese Veränderungen teilweise modulieren. rn

Untersuchungen zum Einfluss des HMG-CoA-Reduktase-Inhibitors Lovastatin auf die Toxizität ionisierender Strahlung sowie des Anthrazyklinderivats Doxorubicin im Mausmodell

Hintergund: HMG-CoA-Reduktase-Inhibitoren (Statine) sind klinisch etablierte Cholesterinsenker. Über die Inhibition der intrinsischen Cholesterinbiosynthese hinaus zeigen sie sogenannte pleiotrope biologische Effekte. Ein Großteil dieser Wirkungen wird auf die Inhibition kleiner Ras homologer GTPasen (Rho GTPasen) zurückgeführt. In vitro schützt das Statinderivat Lovastatin (Lova) primäre humane Endothelzellen vor der Zytotoxizität von ionisierender Strahlung (IR) und dem Krebsmedikament Doxorubicin (Doxo). Zielsetzung: Die Relevanz dieser Befunde für ein in vivo Mausmodell sollte in der vorliegenden Arbeit überprüft werden. Dafür wurden BALB/c-Mäuse mit IR oder Doxo behandelt und der Einfluss einer Kobehandlung mit Lova auf verschiedene Toxizitätsendpunkte untersucht (24 h nach einer einzelnen hohen Dosis IR (i), 14 Tage nach zwei geringen Dosen IR (ii), 48 h nach einer einzelnen hohen Dosis Doxo (iii), sowie 8 Tage nach drei niedrigen Dosen Doxo (iv)). Eine mögliche gleichzeitige Protektion von Tumorzellen durch die Statingabe wurde in einem Xenotransplantationsexperiment überprüft (v), in dem das gleiche Behandlungsschema wie bei iv angewendet wurde. Ergebnisse: Es konnte gezeigt werden, dass eine Statinbehandlung Normalgewebe vor Doxo- und IR-induzierter Toxizität schützt, ohne gleichzeitig protektiv auf transformierte Zellen zu wirken. Dieser Effekt ist wahrscheinlich von einer Inhibition der kleinen GTPasen Rac1 und RhoA abhängig und einer daraus folgenden Modifizierung der DNA-Schadensantwort. i: Die Statinvorbehandlung der Mäuse hatte keinen Einfluss auf die Bildung von initialen IR-induzierten DNA-Doppelstrangbrüchen (DSB) in der Leber. Die Lova-Behandlung wirkte sich jedoch auf IR-induzierte Stressantworten aus, was sich in einer Minderung der Expression von Inflammations- und Fibrosesurrogatmarkern in Leber und Darm widerspiegelte. ii: In der Lunge der Tiere wurde ein Anstieg von molekularen Inflammations- und Fibrosesurrogatmarkern detektiert, der bei Statinkobehandlung ausblieb. Zudem verhinderte die Kobehandlung mit Lova eine IR-induzierte Abnahme der Thrombozytenzahl, ohne sich auf die durch IR verringerte Leukozytenzahl im Blut auszuwirken. iii: Die Verabreichung einer hohen Dosis Doxo induzierte DSB-Formation in der Leber. Die Statinvorbehandlung reduzierte deren Menge um ca. 50 %. Dieser genoprotektive Effekt war unabhängig von der Entstehung reaktiver Sauerstoffspezies sowie einer Änderung des Doxo-Imports oder Exports. Die Expression von proinflammatorischen und profibrotischen Genen fiel besonders in der Leber und im Herzen durch die Lova-Kobehandlung geringer aus, als in der nur mit Doxo behandelten Gruppe. Zudem verringerte Lova die durch Doxo induzierte Hochregulation von für den AP1-Komplex kodierenden Genen sowie von Zellzykluskontrollfaktoren. Die Lova-Vorbehandlung führte darüber hinaus im Herzen zu einem reduzierten mRNA-Spiegel der Topoisomerasen II α und β. iv: Es konnten schwere Herz- und Leberschäden detektiert werden (gemessen an Gldh-, Gpt- sowie cTn-I-Serumkonzentrationen), die bei einer Kobehandlung mit dem Statin nicht auftraten. Die Lova-Kobehandlung verhinderte außerdem eine durch die Doxo-Behandlung verringerte Leukozytenzahl. Molekulare Marker für frühe fibrotische Ereignisse, sowie für Inflammation und Hypertrophie waren in der Leber und im Herzen nach der Doxo-Behandlung erhöht. Das Statin war auch hier in der Lage, diese toxischen Wirkungen des Anthrazyklins zu mindern. Auch die Doxo-induzierte Expression von Surrogatmarkern für Zellantworten auf oxidativen Stress wurde in der Leber abgeschwächt. In der Leber und im Herzen wiesen die mit Doxo behandelten Tiere höhere mRNA Spiegel von an Zellzykluskontrolle beteiligten Faktoren sowie von DNA-Reparatur und Fremdstoffmetabolismus assoziierten Genen auf. Am stärksten wurde die Expression von Topoisomerase II alpha - ein molekularer Marker für Zellproliferation und bedeutsame Zielstruktur von Doxo - in der Leber hochreguliert. Die Statin-Kobehandlung verhinderte all diese Doxo-induzierten Expressionsänderungen. Im Gegensatz zur Leber wurde die Top2a-mRNA Menge im Herzen durch die Doxo-Applikation reduziert. Auch hier bewirkte die Kobehandlung mit dem Statin, dass die Expression nahe dem Kontrollniveau blieb. v: Die Kobehandlung mit Lova führte zu keinem Schutz der Tumorzellen vor Doxo, sondern erhöhte sogar dessen antineoplastisches Potential.rnFazit: Die Erkenntnisse aus vorhergegangenen in vitro Versuchen konnten zum großen Teil auf die in vivo Situation im Mausmodell übertragen werden. Sie stehen im Einklang mit Ergebnissen anderer Gruppen, welche die Inhibition kleiner GTPasen mit einer geringeren, durch zytotoxische Substanzen induzierten, Inflammation und Fibrose korrelieren konnten. Eine Kobehandlung mit Lova während einer Krebstherapie erscheint somit als vielversprechende Möglichkeit Doxo- oder IR-induzierte Nebenwirkungen auf Normalgewebe zu mildern.

Pharmakologische Hemmung strahleninduzierter Tumorzell-Endothelzell-Interaktionen in vitro und Metastasierungsprozesse in vivo

Exposition von Endothelzellen mit ionisierender Strahlung (IR) oder Behandlung mit inflammatorischen Zytokinen (z. B. TNFa) induziert über eine Rho-GTPasen abhängige NF-kB-Aktivierung die Expression verschiedener Zelladhäsionsmoleküle, u. a. auch von E-Selektin. E-Selektin vermittelt die Adhäsion von Tumorzellen (TC) an Endothelzellen und ist daher vermutlich an der Extravasation von zirkulierenden Tumorzellen beteiligt. HMG-CoA-Reduktase-Inhibitoren (Statine), welche eine breite klinische Anwendung als Lipidsenker erfahren, sind in der Lage, Rho-GTPasen und die durch sie vermittelten Signalwege zu hemmen. Daher sollten Statine wie Lovastatin auch Zell-Zell-Adhäsionsvorgänge beeinflussen. Die vorliegende Arbeit widmet sich den Mechanismen, mit denen IR und TNF in Endothel- und/oder Tumorzellen pro-adhäsive Faktoren induzieren können und ob diese Effekte durch Lovastatin beeinflussbar sind. Zu diesem Zweck wurde mittels eines ELISA-basierenden Zelladhäsions-Assays die Auswirkung von IR und TNF auf Zell-Zell-Kontakte zwischen humanen Tumorzellen (u. a. Kolonkarzinomzellen (HT29)) und humanen, venösen Nabelschnurendothelzellen (HUVEC) analysiert. Zudem wurden die Effekte einer Lovastatinvorbehandlung von TC und/oder HUVEC auf TC-HUVEC-Adhäsion untersucht. Des Weiteren wurden die Wirkungen des sLex-Mimetikums Glycyrrhizin und des Rac1-spezifischen „small-molecule“ Inhibitors NSC23766 auf TC-HUVEC-Adhäsion überprüft. Zusätzlich wurde die strahleninduzierbare mRNA-Expression von diversen Zelladhäsionsmolekülen, Metastasierungsfaktoren und DNA-Reparatur-Genen mittels qRT-PCR (Real-Time Analysen) quantitativ erfasst. Um die erhaltenen in vitro Ergebnisse auch in vivo zu bestätigen, untersuchten wir den Effekt einer Ganzkörperbestrahlung (TBI) von BALB/c-Mäusen auf die Expression von pro-adhäsiven Faktoren. Zur Analyse der Tumorzell-Extravasation wurden Tumorzellen in die laterale Schwanzvene immundefizienter Mäuse injiziert und anschließend eine Ganzkörperbestrahlung durchgeführt (4 Gy). Nach einer Wartezeit von 4 Wochen wurde ein erhöhtes Auftreten von Lungenmetastasen beobachtet, welches durch Vorbehandlung der Tiere mit Statinen, NSC23766 oder Glycyrrhizin blockiert werden konnte. Zusammenfassend konnte somit ein Einfluss von IR auf die Expression verschiedener Zelladhäsionsmoleküle in vitro und auf die Extravasation zirkulierender Tumorzellen in vivo festgestellt werden. Diese pro-metastatischen Strahleneffekte konnten durch pharmakologische Hemmung Rho-regulierter Signalwege abgeschwächt werden.

The role of dendritic cells (DC) in Friend retrovirus-induced immunosuppression and immunotherapeutic applications of functionalized nanoparticles

Friend murine leukemia Virus (FV) infection of immunocompetent mice is a well- established model to acquire further knowledge about viral immune suppression mechanisms, with the aim to develop therapeutics against retrovirus-induced diseases. Interestingly, BALB/c mice are infected by low doses of FV and die from FV-induced erythroleukemia, while C57/BL6 mice are infected by FV only at high viral dose, and remain persistently infected for their whole life. Due to the central role of dendritic cells (DC) in the induction of anti-viral responses, we asked for their functional role in the genotype-dependent sensitivity towards FV infection. In my PhD study I showed that bone marrow (BM)-derived DC differentiated from FV-infected BM cells obtained from FV-inoculated BALB/c (FV susceptible) and C57BL/6 (FV resistant) mice showed an increased endocytotic activity and lowered expression of MHCII and of costimulatory receptors as compared with non-infected control BMDC. FV-infected BMDC from either mouse strain were partially resistant towards stimulation-induced upregulation of MHCII and costimulators, and accordingly were poor T cell stimulators in vitro and in vivo. In addition, FV-infected BMDC displayed an altered expression profile of proinflammator cytokines and favoured Th2 polarization. Ongoing work is focussed on elucidating the functional role of proteins identified as differentially expressed in FV-infected DC in a genotype-dependent manner, which therefore may contribute to the differential course of FV infection in vivo in BALB/c versus C57BL/6 mice. So far, more than 300 proteins have been identified which are differently regulated in FV-infected vs. uninfected DC from both mouse strains. One of these proteins, S100A9, was strongly upregulated specifically in BMDC derived from FV-infected C57BL/6 BM cells. S100A9-/- mice were more sensitive towards inoculation with FV than corresponding wild type (WT) mice (both C57BL/6 background), which suggests a decisive role of this factor for anti-viral defense. In addition, FV-infected S100A9-/- BMDC showed lower motility than WT DC. The future work is aimed to further elucidate the functional importance of S100A9 for DC functions. To exploit the potential of DC for immunotherapeutic applications, in another project of this PhD study the usability of different types of functionalized nanoparticles

Mechanismen der Antigenpräsentation bei der Induktion der CD8-T-Zellantwort gegen das murine Cytomegalovirus

Die Kontrolle der Cytomegalovirus(CMV)-Infektion durch CD8 T-Zellen ist abhängig von der effizienten MHC-Klasse-I-Präsentation viraler Peptide auf der Zelloberfläche. Um die Erkennung infizierter Zellen zu unterdrücken, interferieren während der Early (E)-Phase der murinen CMV (mCMV)-Infektion virale Immunevasine mit dem intrazellulären Transport von Peptid-MHC-I (pMHC-I) Komplexen. Den Immunevasinen gelingt es allerdings nicht, ein Priming mCMV-spezifischer CD8 T-Zellen zu verhindern. Daher wurde angenommen, dass die Initiation der antiviralen CD8 T-Zellantwort primär auf der Cross-Präsentation viraler Peptide auf nicht-infizierten, professionellen Antigen-präsentierenden Zellen (profAPC) beruht und damit unabhängig von viralen Immunevasionsmechanismen ist.rnIm Rahmen der vorliegenden Arbeit wurde mittels BAC-Mutagenese eine mCMV-Rekombinante generiert, um die direkte Präsentation viraler Peptide durch die zusätzliche Expression des zentralen Immunevasins m152 bereits in der Immediate Early (IE)-Phase verstärkt zu unterdrücken. Wie erwartet reduzierte die verstärkte m152-Expression sowohl in der IE- als auch in der E-Phase die pMHC-I-Präsentation in vitro. Dies führte überraschenderweise nach Infektion immunkompetenter BALB/c-Mäuse (Haplotyp H-2d) zu einer verminderten CD8 T-Zellantwort und damit zur Verschlechterung der Kontrolle der Infektion im drainierenden Lymphknoten. Diese Beobachtungen weisen erstmals auf einen wichtigen Beitrag der direkten Antigenpräsentation bei der Initiation der mCMV-spezifischen CD8 T-Zellantwort im immunkompetenten Wirt hin. Zusätzlich konnte auch nach mCMV-Infektion von Cross-Präsentations-defizienten Mäusen (Haplotyp H-2b) eine antivirale CD8 T-Zellantwort initiiert werden. Diese Beobachtung bestätigt, dass durch direkte Antigenpräsentation auf infizierten profAPC trotz viraler Immunevasionsmechanismen eine CD8 T-Zellantwort induziert werden kann. Allerdings wurde weder die antivirale CD8 T-Zellantwort noch die Kontrolle der Infektion im Haplotyp H-2b durch die verstärkte m152-Expression moduliert.rnIn einem weiteren Teil der Arbeit konnte im klinisch relevanten Modellsystem der mCMV-Infektion von Knochenmarktransplantations (KMT)-Rezipienten (Haplotyp H-2d) gezeigt werden, dass die verstärkte m152-Expression die Rekrutierung IE1-spezifischer CD8 T-Zellen in die infizierte Lunge unterdrückt. Dies konnte sowohl früh nach Infektion, als auch während der viralen Latenz nachgewiesen werden. Zusätzlich war die Rekrutierung IE1-spezifischer CD8 T-Zellen in die Lunge deutlich vermindert in Ld--Rezipienten von Ld+-hämatopoetischen Zellen, die das IE1-präsentierende MHC-I-Molekül Ld nicht auf den nicht-hämatopoetischen Gewebszellen exprimieren. Diese Beobachtungen zeigen, dass die Rekrutierung antiviraler CD8 T-Zellen in ein peripheres Organ von der direkten Antigenpräsentation auf nicht-hämatopoetischen, infizierten Gewebszellen bestimmt wird.rnIn der vorliegenden Arbeit konnte somit erstmals gezeigt werden, dass trotz viraler Immunevasionsmechanismen nach mCMV-Infektion des immunkompetenten Wirtes und des KMT-Rezipienten die antivirale CD8 T-Zellantwort von der direkten Antigenpräsentation bestimmt wird.

VEGF incorporated into calcium phosphate ceramics promotes vascularisation and bone formation in vivo

Bone formation and osseointegration of biomaterials are dependent on angiogenesis and vascularization. Angiogenic growth factors such as vascular endothelial growth factor (VEGF) were shown to promote biomaterial vascularization and enhance bone formation. However, high local concentrations of VEGF induce the formation of malformed, nonfunctional vessels. We hypothesized that a continuous delivery of low concentrations of VEGF from calcium phosphate ceramics may increase the efficacy of VEGF administration.VEGF was co-precipitated onto biphasic calcium phosphate (BCP) ceramics to achieve a sustained release of the growth factor. The co-precipitation efficacy and the release kinetics of the protein were investigated in vitro. For in vivo investigations BCP ceramics were implanted into critical size cranial defects in Balb/c mice. Angiogenesis and microvascularization were investigated over 28 days by means of intravital microscopy. The formation of new bone was determined histomorphometrically. Co-precipitation reduced the burst release of VEGF. Furthermore, a sustained, cell-mediated release of low concentrations of VEGF from BCP ceramics was mediated by resorbing osteoclasts. In vivo, sustained delivery of VEGF achieved by protein co-precipitation promoted biomaterial vascularization, osseointegration, and bone formation. Short-term release of VEGF following superficial adsorption resulted in a temporally restricted promotion of angiogenesis and did not enhance bone formation. The release kinetics of VEGF appears to be an important factor in the promotion of biomaterial vascularization and bone formation. Sustained release of VEGF increased the efficacy of VEGF delivery demonstrating that a prolonged bioavailability of low concentrations of VEGF is beneficial for bone regeneration.

Impact of CD39 and purinergic signalling on the growth and metastasis of colorectal cancer

Despite improvements in prevention and management of colorectal cancer (CRC), uncontrolled tumor growth with metastatic spread to distant organs remains an important clinical concern. Genetic deletion of CD39, the dominant vascular and immune cell ectonucleotidase, has been shown to delay tumor growth and blunt angiogenesis in mouse models of melanoma, lung and colonic malignancy. Here, we tested the influence of CD39 on CRC tumor progression and metastasis by investigating orthotopic transplanted and metastatic cancer models in wild-type BALB/c, human CD39 transgenic and CD39 deficient mice. We also investigated CD39 and P2 receptor expression patterns in human CRC biopsies. Murine CD39 was expressed by endothelium, stromal and mononuclear cells infiltrating the experimental MC-26 tumors. In the primary CRC model, volumes of tumors in the subserosa of the colon and/or rectum did not differ amongst the treatment groups at day 10, albeit these tumors rarely metastasized to the liver. In the dissemination model, MC-26 cell line-derived hepatic metastases grew significantly faster in CD39 over-expressing transgenics, when compared to CD39 deficient mice. Murine P2Y2 was significantly elevated at both mRNA and protein levels, within the larger liver metastases obtained from CD39 transgenic mice where changes in P2X7 levels were also noted. In clinical samples, lower levels of CD39 mRNA in malignant CRC tissues appeared associated with longer duration of survival and could be linked to less invasive tumors. The modulatory effects of CD39 on tumor dissemination and differential levels of CD39, P2Y2 and P2X7 expression in tumors suggest involvement of purinergic signalling in these processes. Our studies also suggest potential roles for purinergic-based therapies in clinical CRC.

Experimental treatment of Neospora caninum-infected mice with the arylimidamide DB750 and the thiazolide nitazoxanide

The cationic arylimidamide DB750 and the thiazolide nitazoxanide had been shown earlier to be effective against Neospora caninum tachyzoites in vitro with an IC(50) of 160nM and 4.23muM, respectively. In this study, we have investigated the effects of DB750 and nitazoxanide treatments of experimentally infected Balb/c mice, by applying the drugs either through the oral or the intraperitoneal route. In experiment 1, administration of DB750 (2mg/kg/day) and nitazoxanide (150mg/kg/day) started already 3 days prior to experimental infection of mice with 2x10(6) tachyzoites. Following infection, the drugs were further administrated daily for a period of 2 weeks, either orally or intraperitoneally. Intraperitoneal injection of DB750 was well tolerated by the mice, but treatment with nitazoxanide resulted in death of all mice within 3 days. Upon intraperitoneal application of DB750, the cerebral parasite load was significantly reduced compared to all other groups, while oral application of DB750 and nitazoxanide were not as effective, and resulted in significant weight loss. In experiment 2, mice were infected with 2x10(6) tachyzoites and at 2 weeks post-infection, DB750 (2mg/kg/day) was applied by intraperitoneal injections for 14 days. In the DB750-treated group, only 2 out of 12 mice succumbed to infection, compared to 7 out of 12 mice in the placebo-group. DB750 treatment also resulted in significantly reduced cerebral parasite burden, and reduced numbers of viable tachyzoites. Our data suggest that DB750 exerted its activity also after crossing the blood-brain barrier, and that this class of compounds could be promising for the control of N. caninum-associated disease.

Vaccination with the recombinant chimeric antigen recNcMIC3-1-R induces a non-protective Th2-type immune response in the pregnant mouse model for N. caninum infection

The major route of transmission of Neospora caninum in cattle is transplacentally from an infected cow to its progeny. Therefore, a vaccine should be able to prevent both the horizontal transmission from contaminated food or water and the vertical transmission. We have previously shown that a chimeric vaccine composed of predicted immunogenic epitopes of NcMIC3, NcMIC1 and NcROP2 (recNcMIC3-1-R) significantly reduced the cerebral infection in BALB/c mice. In this study, mice were first vaccinated, then mated and pregnant mice were challenged with 2×10(6)N. caninum tachyzoites at day 7-9 of pregnancy. Partial protection was only observed in the mice vaccinated with a tachyzoite crude protein extract but no protection against vertical transmission or cerebral infection in the dams was observed in the group vaccinated with recNcMIC3-1-R. Serological and cytokine analysis showed an overall lower cytokine level in sera associated with a dominant IL-4 expression and high IgG1 titers. Thus, the Th2-type immune response observed in the pregnant mice was not protective against experimental neosporosis, in contrary to the mixed Th1-/Th2-type immune response observed in the non-pregnant mouse model. These results demonstrate that the immunomodulation that occurs during pregnancy was not favorable for the protection against N. caninum infection conferred by vaccination with recNcMIC3-1-R.

The Effects Of Farnesyltransferase Inhibitor Abt-100 On Murine Helper T-Cell Differentiation And Cytokine Secretion

Farnesyltransferase Inhibitors (FTIs) are a class of drugs known to prevent the farnesylation and subsequent membrane attachment of a number of intracellular proteins. In various studies, the administration of FTIs has been found to play a role in the activation and development of T-cells in the immune system. FTIs have also been found to act as immunomodulators in delaying MHC-II mismatched skin allografts in mice. This study focuses on the effect of the FTI, ABT-100, on the differentiation and cytokine secretion of Th1 and Th2 helper T-cells in BALB/C mice to better understand which immune responses are targeted by FTIs. Splenocytes were isolated from BALB/C mice, skewed towards either a Th1 or a Th2 phenotype with the addition of cytokines, and treated with various concentrations of ABT-100. Splenocytes were also isolated and immediately cultured in the presence of ABT-100 to observe differentiation trends of helper T-cells. Cytokine production was measured using intracytoplasmic flow cytometry analysis. I found that ABT-100 treatment does not block Th1 or Th2 cell differentiation. Instead, ABT-100 treatment appears to affect cytokine production from effector T-cells. I found that ABT-100 causes a decrease in IFN-¿ production in mature Th1 cells yet does not affect IL-4 production in mature Th2 cells. This decrease in cytokine production as a result of ABT-100 treatments provides a potential mechanism for how ABT-100 works to delay MHC-II mismatched allograft rejection.

Expression and diversity of Echinococcus multilocularis AgB genes in secondarily infected mice: evaluating the influence of T-cell immune selection on antigenic variation

The T-cell-mediated immune response exhibits a crucial function in the control of the intrahepatic proliferation of Echinococcus multilocularis larvae in mice and humans, both being natural intermediate hosts of the parasite. Antigen B (AgB), a metabolized Echinococcus spp. lipoprotein, contributes to the modulation of the T-cell immune response, and distinct sites of the corresponding AgB1, AgB3 and AgB4 genes were shown to be under positive selection pressure. Since several AgB gene variants are present in a single Echinococcus metacestode, we used secondary E. multilocularis infections in BALB/c and in athymic nude mice (devoid of T-cell responses) to analyze the effect of the cellular immune response on the expression and diversity of EmAgB1-EmAgB4 genes. We demonstrated hereby that EmAgB transcripts were less abundant in nude mice during the early phase of infection (at one month post-infection), and that EmAgB2 is simultaneously down-regulated when compared to the other three genes. A negative relationship exists between the level of transcription and diversity of EmAgB genes. Moreover, no excess of non-synonymous substitutions was found among the distinct EmAgB alleles from a single host. Together, these results pointed to the effect of purifying selection, which seemed to eliminate the detrimental AgB variants generated during the development of the metacestode within the peritoneal cavity of its intermediate host.

14-3-3- and II/3-10-gene expression as molecular markers to address viability and growth activity of Echinococcus multilocularis metacestodes

The present study aimed to search for and characterize parasite molecules, whose expression levels correlate with the viability and growth activity of Echinococcus multilocularis metacestodes. We focused on the expression profiles of 2 parasite-derived genes, 14-3-3 and II/3-10, as putative molecular markers for viability and growth activity of the larval parasite. In experiments in vivo, gene expression levels of 14-3-3 and II/3-10 were relatively quantified by real-time reverse transcription-PCR using a housekeeping gene, beta-actin, as a reference reaction. All three reactions were compared with growth activity of the parasite developing in permissive nu/nu and in non-permissive wild type BALB/c mice. At 2 months p.i., the transcription level of 14-3-3 was significantly higher in parasites actively proliferating in nu/nu mice compared to parasites moderately growing in wild type mice. Immunoblotting experiments confirmed at the protein level that 14-3-3 was over-expressed in parasites derived from nu/nu mice at 2 months p.i. In vitro treatment of E. multilocularis with an anti-echinococcal drug nitazoxanide resulted in a significant decrease of both 14-3-3 and II/3-10 transcription levels found after 8 days of treatment, which correlated with the kinetics of a housekeeping gene, beta-actin. The conclusion is that 14-3-3, combined with II/3-10, exhibits good potential as a molecular marker to assess viability and growth activity of the parasite.