Étude de la biogenèse de l'autotransporteur AIDA-I d'Escherichia coli

Les autotransporteurs monomériques, appartenant au système de sécrétion de type V, correspondent à une famille importante de facteurs de virulence bactériens. Plusieurs fonctions, souvent essentielles pour le développement d’une infection ou pour le maintien et la survie des bactéries dans l’organisme hôte, ont été décrites pour cette famille de protéines. Malgré l’importance de ces protéines, notre connaissance de leur biogenèse et de leur mécanisme d’action demeure relativement limitée. L’autotransporteur AIDA-I, retrouvé chez diverses souches d’Escherichia coli, est un autotransporter multifonctionnel typique impliqué dans l’adhésion et l’invasion cellulaire ainsi que dans la formation de biofilm et d’agrégats bactériens. Les domaines extracellulaires d’autotransporteurs monomériques sont responsables de la fonctionnalité et possèdent pratiquement tous une structure caractéristique d’hélice β. Nous avons mené une étude de mutagenèse aléatoire avec AIDA-I afin de comprendre la base de la multifonctionnalité de cette protéine. Par cette approche, nous avons démontré que les domaines passagers de certains autotransporteurs possèdent une organisation modulaire, ce qui signifie qu’ils sont construits sous la forme de modules fonctionnels. Les domaines passagers d’autotransporteurs peuvent être clivés et relâchés dans le milieu extracellulaire. Toutefois, malgré la diversité des mécanismes de clivage existants, plusieurs protéines, telles qu’AIDA-I, sont clivées par un mécanisme qui demeure inconnu. En effectuant une renaturation in vitro d’AIDA-I, couplée avec une approche de mutagenèse dirigée, nous avons démontré que cette protéine se clive par un mécanisme autocatalytique qui implique deux acides aminés possédant un groupement carboxyle. Ces résultats ont permis la description d’un nouveau mécanisme de clivage pour la famille des autotransporteurs monomériques. Une des particularités d’AIDA-I est sa glycosylation par une heptosyltransférase spécifique nommée Aah. La glycosylation est un concept plutôt récent chez les bactéries et pour l’instant, très peu de protéines ont été décrites comme glycosylées chez E. coli. Nous avons démontré que Aah est le prototype pour une nouvelle famille de glycosyltransférases bactériennes retrouvées chez diverses espèces de protéobactéries. La glycosylation d’AIDA-I est une modification cytoplasmique et post-traductionnelle. De plus, Aah ne reconnaît pas une séquence primaire, mais plutôt un motif structural. Ces observations sont uniques chez les bactéries et permettent d’élargir nos connaissances sur la glycosylation chez les procaryotes. La glycosylation par Aah est essentielle pour la conformation d’AIDA-I et par conséquent pour sa capacité de permettre l’adhésion. Puisque plusieurs homologues d’Aah sont retrouvés à proximité d’autotransporteurs monomériques putatifs, cette famille de glycosyltranférases pourrait être importante, sinon essentielle, pour la biogenèse et/ou la fonction de nombreux autotransporteurs. En conclusion, les résultats présentés dans cette thèse apportent de nouvelles informations et permettent une meilleure compréhension de la biogenèse d’une des plus importantes familles de protéines sécrétées chez les bactéries Gram négatif.

Interaction entre le virus SRRP et Actinobacillus pleuropneumoniae dans un modèle d'infection en culture cellulaire

Le virus du syndrome reproducteur et respiratoire porcin (VSRRP) est un pathogène d’importance dans l’industrie porcine et est responsable d’importantes pertes économiques. Il n’existe pas d’antiviral efficace contre celui-ci. Il a récemment été mis en évidence que le surnageant de culture d’Actinobacillus pleuropneumoniae, l’agent étiologique de la pleuropneumonie porcine, possédait une activité antivirale in vitro contre le VSRRP dans la lignée cellulaire SJPL. Les objectifs de mon projet sont (i) d’étudier les mécanismes cellulaires menant à l’activité antivirale causée par le surnageant de culture d’A. pleuropneumoniae, et (ii) de caractériser les molécules actives présentes dans le surnageant de culture d’A. pleuropneumoniae. Dans un premier temps, des analyses de protéome ont été effectuées et ont permis d’observer que le surnageant de culture modulait la régulation du cycle cellulaire. Dans le but d’analyser le cycle cellulaire des cellules SJPL, la cytométrie en flux a été utilisée et a permis de démontrer que le surnageant de culture induisait un arrêt du cycle cellulaire en phase G2/M. Deux inhibiteurs de la phase G2/M ont alors été utilisé. Il s'est avéré que ces inhibiteurs avaient la capacité d’inhiber le VSRRP dans les cellules SJPL. Enfin, la spectrométrie de masse a été utilisée dans le but de caractériser les molécules actives présentes dans le surnageant de culture d’A. pleuropneumoniae et d’identifier deux molécules. Ce projet a permis de démontrer pour la première fois qu’A. pleuropneumoniae est capable de perturber le cycle cellulaire et que ce dernier était un élément important dans l’effet antiviral contre le VSRRP.

Caractérisation des transcrits antisens chez les rétrovirus HTLV et étude comparative des fonctions des protéines traduites à partir de ces transcrits antisens

Le premier membre de la famille des rétrovirus humains HTLV (Virus T-lymphotropique Humain), HTLV-1, a été découvert en 1980 et l’on estime aujourd’hui à plus de 10 millions le nombre d’individus infectés à travers le monde. Après une période de latence d’environ 40 ans, 5% des individus infectés développent des leucémies, des lymphomes adultes de lymphocytes T (ATLL) ou encore une myélopathie associée à HTLV-1/ paraparésie spastique tropicale (HAM/TSP). L’apparition de la maladie serait en grande partie orchestrée par deux protéines virales, soit Tax et HTLV-1 bZIP factor (HBZ). L’expression du génome viral se fait à partir d’un transcrit sens de pleine longueur suite à un épissage alternatif, à l’exception du gène HBZ. HBZ est produite à partir d’un transcrit antisens initié dans la séquence terminale longue répétée (LTR)’3. Elle a été décrite comme étant capable de réguler négativement la transcription virale dépendante de Tax en se dimérisant avec des facteurs de transcription cellulaires tels que CREB-2 et certains membres de la famille Jun. HBZ a aussi un pouvoir prolifératif et bien que nous ne sachions toujours pas le mécanisme moléculaire menant à l’oncogenèse par HBZ, nous savons qu’elle module une multitude de voies de transduction de signaux, dont AP-1. Nous avons récemment mis en évidence un transcrit antisens nommé Antisense Protein of HTLV-2 (APH-2) chez HTLV-2 qui n’est associé qu’à une myélopathie apparentée au HAM/TSP. Ce n’est qu’en 2005 que HTLV-3 et HTLV-4 se sont rajoutés au groupe HTLV. Cependant, aucune corrélation avec le développement d’une quelconque maladie n’a été montrée jusqu’à ce jour. Le premier volet de ce projet de doctorat avait pour objectif de détecter et caractériser les transcrits antisens produits par HTLV-3 et HTLV-4 et d’étudier les protéines traduites à partir de ces transcrits pour ainsi évaluer leurs similitudes et/ou différences avec HBZ et APH-2. Nos études de localisation cellulaire réalisées par microscopie confocale ont montré que APH-3 et APH-4 sont des protéines nucléaires, se retrouvant sous la forme de granules et, dans le cas d’APH-3, partiellement cytoplasmique. Ces granules co-localisent en partie avec HBZ. Les analyses à l’aide d’un gène rapporteur luciférase contenant le LTR 5’ de HTLV-1 ont montré que APH-3 et APH-4 peuvent aussi inhiber la transactivation du LTR 5’ par Tax. Aussi, des études faisant appel au gène rapporteur précédé d’un promoteur de collagénase (site AP-1), ont montré que ces deux protéines, contrairement à HBZ, activent la transcription dépendante de tous les membres des facteurs de transcription de la famille Jun. De plus, les mutants ont montré que le motif fermeture éclair (LZ) atypique de ces protéines est impliqué dans cette régulation. En effet, APH-3 et APH-4 modulent la voie Jun-dépendante en se dimérisant via leur LZ atypique avec la famille Jun et semblent activer la voie par un mécanisme ne faisant pas par d’un domaine activateur autonome. Dans un deuxième volet, nous avions comme objectif d’approfondir nos connaissances sur la localisation nucléolaire de HBZ. Lors de nos analyses, nous avons identifié deux nouveaux partenaires d’interaction, B23 et la nucléoline, qui semblent être associés à sa localisation nucléolaire. En effet, ces interactions sont plus fortes suivant une délétion des domaines AD et bZIP de HBZ qui dans ce cas est localisée strictement au nucléole. De plus, bien que APH-3 et APH-4 puissent se localiser aux nucléoles, HBZ est la seule protéine traduite à partir d’un transcrit antisens pouvant interagir avec B23. Finalement, ces travaux ont clairement mis en évidence que HTLV-3 et HTLV-4 permettent la production de transcrits antisens comme chez d’autres rétrovirus. Les protéines traduites à partir de ces transcrits antisens jouent d’importants rôles dans la réplication rétrovirale mais semblent avoir des fonctions différentes de celles de HBZ au niveau de la régulation de la transcription de la voie Jun. HBZ semble aussi jouer un rôle unique dans le nucléole en ciblant les protéines nucléolaires de la cellule. Ces études démontrent que les protéines produites à partir de transcrits antisens chez les rétrovirus HTLV partagent plusieurs ressemblances, mais démontrent aussi des différences. Ainsi, les APH pourraient, en tant qu’outil comparatif, aider à mieux cibler les mécanismes moléculaires importants utilisés par HBZ pour induire la pathogénèse associée à une infection par HTLV.

Penaeus monodon larvae can be protected from Vibrio harveyi infection by pre-emptive treatment of a rearing system with antagonistic or non-antagonistic bacterial probiotics

This study shows that the disease resistance and survival rate of Penaeus monodon in a larval rearing systems can be enhanced by supplementing with antagonistic or non-antagonistic probiotics. The antagonistic mode of action of Pseudomonas MCCB 102 and MCCB 103 against vibrios was demonstrated in larval mesocosm with cultures having su⁄cient concentration of antagonistic compounds in their culture supernatant. Investigations on the antagonistic properties of Bacillus MCCB 101, Pseudomonas MCCB 102 and MCCB 103 and Arthrobacter MCCB 104 against Vibrio harveyi MCCB111under in vitro conditions revealed that Pseudomonas MCCB 102 and MCCB 103 were inhibitory to the pathogen.These inhibitory propertieswere further con¢rmed in the larval rearing systems of P. monodon. All these four probionts signi¢cantly improved larval survival in long-term treatments as well as when challengedwith a pathogenic strain ofV. harveyiMCCB111. We could demonstrate that Pseudomonas MCCB 102 andMCCB103 accorded disease resistance and a higher survival rate in P. monodon larval rearing systems throughactive antagonism of vibrios,whereas Bacillus MCCB 101 and Arthrobacter MCCB 104 functioned as probiotics through immunostimulatory and digestive enzyme-supporting modes of action.

Anti-lipopolysaccharide factor and crustin-III, the anti-white spot virus peptides in Penaeus monodon: Control of viral infection by up-regulation

White Spot Syndrome Virus (WSSV) is the most devastating disease affecting shrimp culture around the world. Though, considerable progress has been made in the detection and molecular characterization of WSSV in recent years, information pertaining to immune gene expression in shrimps with respect to WSSV infection remains limited. In this context, the present study was undertaken to understand the differential expression of antimicrobial peptide (AMP) genes in the haemocytes of Penaeus monodon in response to WSSV infection on a time-course basis employing semi-quantitative RT-PCR. The present work analyzes the expression profile of six AMP genes (ALF, crustin-1, crustin-2, crustin-3, penaeidin-3 and penaeidin-5), eight WSSV genes (DNA polymerase, endonuclease, immediate early gene, latency related gene, protein kinase, ribonucleotide reductase, thymidine kinase and VP28) and three control genes (18S rRNA, β-actin and ELF) in P. monodon in response to WSSV challenge. Penaeidins were found to be up-regulated during early hours of infection and crustin-3 during late period of infection. However, ALF was found to be up-regulated early to late period of WSSV infection. The present study suggests that AMPs viz. ALF and crustin-3 play an important role in antiviral defense in shrimps. WSSV gene transcripts were detected post-challenge day 1 itself and increased considerably day 5 onwards. Evaluation of the control genes confirmed ELF as the most reliable control gene followed by 18S rRNA and β-actin for gene expression studies in shrimps. This study indicated the role of AMPs in the protection of shrimps against viral infection and their possible control through the up-regulation of AMPs

Truncated VP28 as oral vaccine candidate against WSSV infection in shrimp: An uptake and processing study in the midgut of Penaeus monodon

Several oral vaccination studies have been undertaken to evoke a better protection against white spot syndrome virus (WSSV), amajor shrimp pathogen. Formalin-inactivated virus andWSSV envelope protein VP28 were suggested as candidate vaccine components, but their uptake mechanism upon oral delivery was not elucidated. In this study the fate of these components and of live WSSV, orally intubated to black tiger shrimp (Penaeus monodon) was investigated by immunohistochemistry, employing antibodies specific for VP28 and haemocytes. The midgut has been identified as the most prominent site of WSSV uptake and processing. The truncated recombinant VP28 (rec-VP28), formalin-inactivated virus (IVP) and live WSSV follow an identical uptake route suggested as receptor-mediated endocytosis that starts with adherence of luminal antigens at the apical layers of gut epithelium. Processing of internalized antigens is performed in endo-lysosomal compartments leading to formation of supra-nuclear vacuoles. However, the majority of WSSV-antigens escape these compartments and are transported to the inter-cellular space via transcytosis. Accumulation of the transcytosed antigens in the connective tissue initiates aggregation and degranulation of haemocytes. Finally the antigens exiting the midgut seem to reach the haemolymph. The nearly identical uptake pattern of the different WSSV-antigens suggests that receptors on the apical membrane of shrimp enterocytes recognize rec-VP28 efficiently. Hence the truncated VP28 can be considered suitable for oral vaccination, when the digestion in the foregut can be bypassed

Marine yeast Candida MCCF 101 as feed supplement in aquaculture: nutritional quality, optimization of large scale production and evaluation of its protective effect on Koi carp from Aeromonas infection

Marine yeast have been regarded as safe and showing a beneficial impact on biotechnological process. It provides better nutritional and dietary values indicating their potential application as feed supplements in aquaculture. Brown et al. (1996) evaluated all the marine yeasts characterised with high protein content, carbohydrate, good amino acid composition and high levels of saturated fats. However, there is paucity of information on marine yeasts as feed supplements and no feed formulation has been found either in literature or in market supplemented with them. This statement supported by Zhenming et al. (2006) reported still a lack of feed composed of single cell protein (SCP) from marine yeasts with high content of protein and other nutrients. Recent research has shown that marine yeasts also have highly potential uses in food, feed, medical and biofuel industries as well as marine biotechnology (Chi et al., 2009; 2010). Sajeevan et al. (2006; 2009a) and Sarlin and Philip (2011) demonstrates that the marine yeasts Candida sake served as a high quality, inexpensive nutrient source and it had proven immunostimulatory properties for cultured shrimps. This strain has been made part of the culture collection of National Centre for Aquatic Animal Health, Cochin University of Science and Technology as Candida MCCF 101. Over the years marine yeasts have been gaining increased attention in animal feed industry due to their nutritional value and immune boosting property.Therefore, the present study was undertaken, and focused on the nutritional quality, optimization of large scale production and evaluation of its protective effect on Koi carp from Aeromonas infection

Virus infection speeds: theory versus experiment

In order to explain the speed of Vesicular Stomatitis Virus VSV infections, we develop a simple model that improves previous approaches to the propagation of virus infections. For VSV infections, we find that the delay time elapsed between the adsorption of a viral particle into a cell and the release of its progeny has a very important effect. Moreover, this delay time makes the adsorption rate essentially irrelevant in order to predict VSV infection speeds. Numerical simulations are in agreement with the analytical results. Our model satisfactorily explains the experimentally measured speeds of VSV infections

Desenvolupament d'un sistema de previsió de risc d'infecció per Stemphylium vesicarium. Avaluació, validació i implementació en parcel·les experimentals en camps comercials de perera

L'estemfiliosi de la perera és una malaltia fúngica ocasionada pel fong Deuteromicet Stemphylium vesicarium. Els símptomes característics d'aquesta malaltia són lesions necròtiques en fulles i fruits, provocant el depreciament econòmic d'aquests últims. Si les condicions climàtiques són favorables aquesta malaltia pot arribar a provocar la pèrdua total de la producció. La malaltia es localitza bàsicament en la conca mediterrània, sent les zones fructícoles de Girona a Catalunya i Emilia-Romagna a Itàlia els llocs on les pèrdues de producció són més grans. Actualment l'únic mètode de control és la cobertura permanent dels òrgans de la planta amb fungicides. Per obtenir aquesta protecció és necessari realitzar aplicacions preventives amb una cadència fixa, setmanal o quinzenal, de diferents fungicides en els arbres. Aquesta cadència d'aplicació comporta que al llarg del període vegetatiu de la perera es realitzin entre 20 i 25 aplicacions de fungicida, per cadències setmanals, o entre 10 i 13 aplicacions si la cadència és quinzenal. Aquest elevat nombre de tractaments comporta uns efectes toxicològics a nivell mediambiental i per a la salut humana, un augment del cost econòmic de la producció i en alguns casos afavorir l'aparició de resistències del patogen a determinats fungicides. Molts d' aquests tractaments es realitzen sense que les condicions ambientals siguin favorables a l'inici d'infeccions del fong, i són per tant innecessàries. Amb l'objectiu d'obtenir una eina per determinar el risc d'infeccions en funció de les condicions climàtiques i realitzar d'aquesta manera els tractaments amb fungicides només quan són necessaris, es va elaborar el Sistema pel Tractament Racionalitzat de l'Estemfiliosi de la Perera (STREP). El model consisteix en relacionar quantitativament amb la severitat de la malaltia els paràmetres climàtics de durada del període d'humectació i temperatura mitjana durant aquests períodes. En aquest treball s'ha determinat l'eficàcia en el control de la malaltia per diferents fungicides aplicats de manera preventiva amb una cadència fixa en diferents finques comercials i durant varis anys. S'ha constatat que no hi ha cap producte totalment eficaç en el control de la malaltia, sent l'eficàcia obtinguda mitjana. Aquesta eficàcia de control esta en funció del nivell de pressió de la malaltia, obtenint eficàcies inferiors quan el nivell en els testimonis no tractats és elevat. En assajos en condicions controlades s'ha determinat que els fungicides analitzats aplicats de manera curativa o postinfecciosa, quan ja s'han iniciat les infeccions, presenten una eficàcia més baixa que quan s'apliquen preventivament. El tiram és el producte amb una eficàcia més elevada en la major part de les condicions experimentals. S' ha analitzat durant 5 anys, 1992-1996, en diferents plantacions de perera de Girona, la dinàmica dels paràmetres ambientals de durada deis períodes amb humectació, la temperatura mitjana de l'aire, la temperatura mitjana durant els períodes d'humectació, la durada dels períodes amb humitat relativa superior al 90% i la pluviometria. S 'ha constatat que la humectació deguda a la rosada és la principal causa d'humectació i que és un procés lent i continu. Les durades més freqüents d'humectació han estat períodes inferiors a 12 hores i les temperatures més freqüents durant aquests períodes han estat entre 11 i 21°C. S'ha determinat també que existeixen períodes amb humitat relativa elevada però sense formació de pel·lícula d'aigua i s'ha observat que ocasionalment existeixen períodes breus d'interrupció de la humectació en que poden existir humanitats relatives elevades o baixes. La capacitat predictiva del model STREP ha estat avaluada mitjançant 42 assajos en condicions naturals i controlades, determinant que en més del 95 % dels casos avaluats les prediccions de malaltia s'han correspost amb les observades, i que només en dos casos el model ha infraestimat el nivell de risc d'infecció. Demostrant així que el model STREP és fiable en les seves prediccions. S'ha estudiat l'efecte de la humitat relativa durant els períodes interromputs d'humectació i les durades d'aquests períodes, en les infeccions produïdes pel fong. S'ha constatat que el model STREP hauria d'incorporar com a períodes separats els períodes d'humectació interromputs amb relatives elevades (>98%) s'haurien de considerar com a períodes continus. Per una altra banda s'ha comprovat que els períodes amb humitats relatives elevades sense formació d'humectació en condicions naturals no són suficients per provocar l'inici d'infeccions de S. Vesicarium. S'ha utilitzat el model STREP com a eina per guiar els tractaments fungicides en diferents parcel·les de finques comercials durant dos anys. D'aquests assajos es pot concloure que utilitzant valors de risc acumulat SA:0.4 com a llindar per a realitzar els tractaments es controla la malaltia amb una eficàcia semblant als tractaments setmanals, però amb una reducció del nombre d'aplicacions necessàries entre un 25 i un 50%. Utilitzar un llindar SA:0.6 en finques amb varietats sensibles i una pressió d'inòcul del patogen elevada presenta bons resultats però inferiors als obtinguts amb tractaments setmanals, no obstant l'estalvi de tractaments ha estat molt important (50-70%). De tots aquests resultats es conclou que el model STREP és adequat per ésser utilitzat en programes pilot a escala comercial en el control racional de l'estemfiliosi de la perera. En funció d'aquests resultats es considerarà la seva implementació en Estacions d'Avisos Fitosanitaris.

El virus de l'hepatitis C i la ribonucleasa Phumana: aspectes biològics i terapèutics

El virus de l'hepatitis C (VHC) provoca una hepatitis crònica que afecta a més de 170 milions de persones d'arreu del món. És un virus petit que es classifica dins de la família Flaviviridae i és un virus d'RNA de cadena positiva amb un genoma d'aproximadament 9.600 nucleòtids. A l'extrem 5' del genoma viral s'hi troba una regió no codificant (5'NCR) que comprèn els primers 341 nucleòtids i la seva funció està relaciona amb la traducció. Immediatament després hi ha una pauta de lectura oberta ORF que acaba en un únic codó d'aturada i codifica una poliproteïna de 3.010 aminoàcids. A continuació l'extrem 3' no codificant (3'NCR), que malgrat es desconeixen les seves funcions exactes, s'ha demostrat que és essencial per a la replicació vírica. La única poliproteïna generada és processada co- i postraduccionalment mitjançant proteases de l'hoste i víriques, donant lloc a les proteïnes estructurals (Core, E1 i E2-p7) i no estructurals (NS2-NS5B). Igual que la majoria de virus RNA, el VHC es caracteritza per tenir una taxa de mutació elevada. De fet, el genoma del virus no es pot definir com una única seqüència sinó per una població de variants molt relacionades entre sí. A aquesta manera d'organitzar la informació genètica se l'anomena quasiespècie viral i una de les seves implicacions principals és la facilitat amb què sorgeixen resistents al tractament. Els tractaments disponibles són llargs, cars, provoquen efectes secundaris considerables i només es resolen completament el 40% dels casos. Per aquesta raó es busquen altres solucions terapèutiques per combatre el virus entre les quals s'hi inclouen diferents estratègies. Una de les més innovadores i prometedores és la utilització de ribozims dirigits directament contra el genoma del virus. Aquest treball es centra en l'estudi de les noves estratègies terapèutiques basades en ribozims, concretament la ribonucleasa P. La ribonucleasa P és un ribozim que està present en tots els organismes ja que és l'enzim responsable de la maduració dels precursors d'RNA de transferència. El més interessant a nivell terapèutic és que s'ha demostrat que es pot dirigir la seva activitat cap a qualsevol RNA utilitzant una seqüència guia d'RNA que quan hibrida amb l'RNA diana, l'híbrid imita l'estructura secundària del substrat natural. En el cas del VHC, s'han estudiat ribozims dependents de seqüència (ribozims derivats d'RNAs satèl·lits i de viroides de plantes), sempre dirigits contra la regió més conservada del virus per evitar una disminució de l'eficiència del ribozim deguda a la variació de la diana. La ribonucleasa P és una endonucleasa d'activitat molt específica i es diferencia dels altres ribozims naturals en el sistema de reconeixement del substrat, reconeix elements estructurals i no de seqüència. L'objectiu final del treball és tallar in vitro l'RNA del VHC aprofitant la propietat que presenta aquest ribozim de reconèixer elements estructurals i no de seqüència ja que per a un mateix nombre de seqüències, el nombre d'estructures viables que pot adoptar l'RNA genòmic és molt més petit i per tant la variabilitat de la diana disminueix. S'han estudiat dos models d'RNasa P, la RNasa P humana guiada per seqüència guia externa (EGS) i l'RNA M1 de l'RNasa P d'E.coli unit a la seqüència guia per l'extrem 3' (ribozim M1GS). Abans però de dirigir el ribozim, s'han estudiat l'estructura i la variabilitat d'una regió del genoma del virus ja que s'ha descrit que són factors que poden limitar l'eficiència de qualsevol ribozim. Derivat d'aquests estudis s'aporten dades sobre accessibilitat i variabilitat d'una regió interna del genoma del virus de l'hepatitis C, la zona d'unió de la regió E2/NS2 (regió 2658-2869). L'estudi d'accessibilitat revela que la regió 2658-2869 del genoma del virus conté dominis oberts i tancats i que la transició entre uns i altres no és brusca si es compara amb altres regions d'estructura coneguda (regió 5' no codificant). Els resultats dels assajos in vitro amb els dos models de RNasa P mostren que s'ha aconseguit dirigir tant la ribonucleasa P humana com el ribozim M1GS cap a una zona, predeterminada segons l'estudi d'accessibilitat, com a poc estructurada i tallar l'RNA del virus. De l'anàlisi de mutacions, però, es dedueix que la regió estudiada és variable. Tot i dirigir el ribozim cap a la zona més accessible, la variació de la diana podria afectar la interacció amb la seqüència guia i per tant disminuir l'eficiència de tall. Si es proposés una estratègia terapèutica consistiria en un atac simultani de vàries dianes.D'altra banda i derivat d'un resultat inesperat on s'ha observat en els experiments control que l'extracte de RNasa P humana tallava l'RNA viral en absència de seqüències guia externes, s'ha caracteritzat una nova interacció entre l'RNA del VHC i la RNasa P humana. Per a la identificació de l'enzim responsable dels talls s'han aplicat diferents tècniques que es poden dividir en mètodes directes (RNA fingerprinting) i indirectes (immunoprecipitació i inhibicions competitives). Els resultats demostren que la ribonucleasa P humana, i no un altre enzim contaminant de l'extracte purificat, és la responsable dels dos talls específics observats i que es localitzen, un a l'entrada interna al ribosoma (IRES) i molt a prop del codó AUG d'inici de la traducció i l'altre entre la regió codificant estructural i no estructural. La ribonucleasa P és un dels enzims del metabolisme del tRNA que s'utilitza per identificar estructures similars al tRNA en substrats diferents del substrat natural. Així doncs, el fet que la ribonucleasa P reconegui i talli el genoma del VHC en dues posicions determinades suggereix que, a les zones de tall, el virus conté estructures semblants al substrat natural, és a dir estructures tipus tRNA. A més, tot i que el VHC és molt variable, els resultats indiquen que aquestes estructures poden ser importants per el virus, ja que es mantenen en totes les variants naturals analitzades. Creiem que la seva presència podria permetre al genoma interaccionar amb factors cel·lulars que intervenen en la biologia del tRNA,particularment en el cas de l'estructura tipus tRNA que es localitza a l'element IRES. Independentment però de la seva funció, es converteixen en unes noves dianes terapèutiques per a la RNasa P. S'ha de replantejar però l'estratègia inicial ja que la similitud amb el tRNA les fa susceptibles a l'atac de la ribonucleasa P, directament, en absència de seqüències guia externes.

Effect of ammonium and nitrate on indigenous mycorrhizal infection, rhizosphere pH change, and phosphorus uptake by sorghum

Sorghum (Sorghum bicolor L.) plants were grown in split pots in three Rothamsted soils with different soil pH values and phosphorus (P) contents. Ammonium addition resulted in higher plant dry weight and P content than comparable nitrate treatments. The pH of soils in the rhizosphere (0.51-mm average thickness) differed from the bulk soil depending on nitrogen (N) form and level. Ammonium application resulted in a pH decrease, but nitrate application slightly increased pH. To examine the effect of rhizosphere acidification on mobilization of phosphate, 0.5 M NaHCO3 extractable phosphate was measured. The lowering rhizosphere pH enhanced the solubility of P in the soil and maybe availability of P to plants. Rhizosphere-P depletion increased with increasing ammonium supply, but when N was supplied as nitrate, P depletion was not related to increasing nitrate supply. Low P status Hoosfield soils developed mycorrhizal infection., and as a result, P inflow was increased. Geescroft soil, which initially had a high P status, did not develop mycorrhizal infection, and P inflow was much smaller and was unaffected by N treatments. Therefore, plant growth and P uptake were influenced by both rhizosphere pH and indigenous mycorrhizal infection.

Drought, pod yield, pre-harvest Aspergillus infection and aflatoxin contamination on peanut in Niger

Soil moisture and soil temperature affect pre-harvest infection with Aspergillus flavus and production of aflatoxin. The objectives of our field research in Niger, West Africa, were to: (i) examine the effects of sowing date and irrigation treatments on pod yield, infection with A. flavus and aflatoxin concentration; and (ii) to quantify relations between infection, aflatoxin concentration and soil moisture stress. Seed of an aflatoxin susceptible peanut cv. JL24 was sown at two to four different sowing dates under four irrigation treatments (rainfed and irrigation at 7, 14 and 21 days intervals) between 1991 and 1994, giving 40 different 'environments'. Average air and soil temperatures of 28-34 degrees C were favourable for aflatoxin contamination. CROPGRO-peanut model was used to simulate the occurrence of moisture stress. The model was able to simulate yields of peanut well over the 40 environments (r(2) = 0.67). In general, early sowing produced greater pod yields, as well as less infection and lower aflatoxin concentration. There were negative linear relations between infection (r(2) = 0.62) and the average simulated fraction of extractable soil water (FESW) between flowering and harvest, and between aflatoxin concentration (r(2) = 0.54) and FESW in the last 25 days of pod-filling. This field study confirms that infection and aflatoxin concentration in peanut can be related to the occurrence of soil moisture stress during pod-filling when soil temperatures are near optimal for A. flavus. These relations could form the basis of a decision-support system to predict the risk of aflatoxin contamination in peanuts in similar environments. (c) 2005 Elsevier B.V. All rights reserved.

The effects of infection by Tetracapsuloides bryosalmonae (Myxozoa) and temperature on Fredericella sultana (Bryozoa)

The myxozoan, Tetracapsuloides bryosalmonae, exploits freshwater bryozoans as definitive hosts, occurring as cryptic stages in bryozoan colonies during covert infections and as spore-forming sacs during overt infections. Spores released from sacs are infective to salmonid fish, causing the devastating Proliferative Kidney Disease (PKD). We undertook laboratory studies using mesocosm systems running at 10, 14 and 20 degrees C to determine how infection by T bryosalmonae and water temperature influence fitness of one of its most important bryozoan hosts, Fredericella sultana, over a period of 4 weeks. The effects of infection were context-dependent and often undetectable. Covert infections appear to pose very low energetic costs. Thus, we found that growth of covertly infected F. sultana colonies was similar to that of uninfected colonies regardless of temperature, as was the propensity to produce dormant resting stages (statoblasts). Production of statoblasts, however, was associated with decreased growth. Overt infections imposed greater effects on correlates of host fitness by: (i) reducing growth rates at the two higher temperatures: (ii) increasing mortality rates at the highest temperature: (iii) inhibiting statoblast production. Our results indicate that parasitism should have a relatively small effect on host fitness in the field as the negative effects of infection were mainly expressed in environmentally extreme conditions (20 degrees C for 4 weeks). The generally low virulence of T. bryosalmonae is similar to that recently demonstrated for another myxozoan endoparasite of freshwater bryozoans. The unique opportunity for extensive vertical transmission in these colonial invertebrate hosts couples the reproductive interests of host and parasite and may well give rise to the low virulence that characterises these systems. Our study implies that climate change can be expected to exacerbate PKD outbreaks and increase the geographic range of PKD as a result of the combined responses of T. bryosalmonae and its bryozoan hosts to higher temperatures. Crown Copyright (C) 2009 Published by Elsevier Ltd. All rights reserved.

Infection of human airway epithelium by human and avian strains of influenza a virus

We describe the characterization of influenza A virus infection of an established in vitro model of human pseudostratified mucociliary airway epithelium (HAE). Sialic acid receptors for both human and avian viruses, alpha-2,6- and alpha-2,3-linked sialic acids, respectively, were detected on the HAE cell surface, and their distribution accurately reflected that in human tracheobronchial tissue. Nonciliated cells present a higher proportion of alpha-2,6-linked sialic acid, while ciliated cells possess both sialic acid linkages. Although we found that human influenza viruses infected both ciliated and nonciliated cell types in the first round of infection, recent human H3N2 viruses infected a higher proportion of nonciliated cells in HAE than a 1968 pandemic-era human virus, which infected proportionally more ciliated cells. In contrast, avian influenza viruses exclusively infected ciliated cells. Although a broad-range neuraminidase abolished infection of HAE by human parainfluenza virus type 3, this treatment did not significantly affect infection by influenza viruses. All human viruses replicated efficiently in HAE, leading to accumulation of nascent virus released from the apical surface between 6 and 24 h postinfection with a low multiplicity of infection. Avian influenza A viruses also infected HAE, but spread was limited compared to that of human viruses. The nonciliated cell tropism of recent human H3N2 viruses reflects a preference for the sialic acid linkages displayed on these cell types and suggests a drift in the receptor binding phenotype of the H3 hemagglutinin protein as it evolves in humans away from its avian virus precursor.

Inhibition of coxsackie B virus infection by soluble forms of its receptors: Binding affinities, altered particle formation, and competition with cellular receptors

We previously reported that soluble decay-accelerating factor (DAF) and coxsackievirus-adenovirus receptor (CAR) blocked coxsackievirus 133 (CVB3) myocarditis in mice, but only soluble CAR blocked CVB3-mediated pancreatitis. Here, we report that the in vitro mechanisms of viral inhibition by these soluble receptors also differ. Soluble DAF inhibited virus infection through the formation of reversible complexes with CVB3, while binding of soluble CAR to CVB induced the formation of altered (A) particles with a resultant irreversible loss of infectivity. A-particle formation was characterized by loss of VP4 from the virions and required incubation of CVB3-CAR complexes at 37 degrees C. Dimeric soluble DAF (DAF-Fc) was found to be 125-fold-more effective at inhibiting CVB3 than monomeric DAF, which corresponded to a 100-fold increase in binding affinity as determined by surface plasmon resonance analysis. Soluble CAR and soluble dimeric CAR (CAR-Fc) bound to CVB3 with 5,000- and 10,000-fold-higher affinities than the equivalent forms of DAF. While DAF-Fc was 125-fold-more effective at inhibiting virus than monomeric DAF, complement regulation by DAF-Fc was decreased 4 fold. Therefore, while the virus binding was a cooperative event, complement regulation was hindered by the molecular orientation of DAF-Fc, indicating that the regions responsible for complement regulation and virus binding do not completely overlap. Relative contributions of CVB binding affinity, receptor binding footprint on the virus capsid, and induction of capsid conformation alterations for the ability of cellular DAF and CAR to act as receptors are discussed.