The role of mechanistic target of rapamycin (mTOR) pathway and synaptic protein GABAA-R in cortical GABAergic cell connectivity

Quelque 30 % de la population neuronale du cortex mammalien est composée d’une population très hétérogène d’interneurones GABAergiques. Ces interneurones diffèrent quant à leur morphologie, leur expression génique, leurs propriétés électrophysiologiques et leurs cibles subcellulaires, formant une riche diversité. Après leur naissance dans les éminences ganglioniques, ces cellules migrent vers les différentes couches corticales. Les interneurones GABAergiques corticaux exprimant la parvalbumin (PV), lesquels constituent le sous-type majeur des interneurones GABAergiques, ciblent spécifiquement le soma et les dendrites proximales des neurones principaux et des neurones PV+. Ces interneurones sont nommés cellules à panier (Basket Cells –BCs) en raison de la complexité morphologique de leur axone. La maturation de la connectivité distincte des BCs PV+, caractérisée par une augmentation de la complexité de l’axone et de la densité synaptique, se déroule graduellement chez la souris juvénile. Des travaux précédents ont commencé à élucider les mécanismes contrôlant ce processus de maturation, identifiant des facteurs génétiques, l’activité neuronale ainsi que l’expérience sensorielle. Cette augmentation marquante de la complexité axonale et de la synaptogénèse durant cette phase de maturation suggère la nécessité d’une synthèse de protéines élevée. La voie de signalisation de la cible mécanistique de la rapamycine (Mechanistic Target Of Rapamycin -mTOR) a été impliquée dans le contrôle de plusieurs aspects neurodéveloppementaux en régulant la synthèse de protéines. Des mutations des régulateurs Tsc1 et Tsc2 du complexe mTOR1 causent la sclérose tubéreuse (TSC) chez l’humain. La majorité des patients TSC développent des problèmes neurologiques incluant des crises épileptiques, des retards mentaux et l’autisme. D’études récentes ont investigué le rôle de la dérégulation de la voie de signalisation de mTOR dans les neurones corticaux excitateurs. Toutefois, son rôle dans le développement des interneurones GABAergiques corticaux et la contribution spécifique de ces interneurones GABAergiques altérés dans les manifestations de la maladie demeurent largement inconnus. Ici, nous avons investigué si et comment l’ablation du gène Tsc1 perturbe le développement de la connectivité GABAergique, autant in vitro que in vivo. Pour investiguer le rôle de l’activation de mTORC1 dans le développement d’une BC unique, nous avons délété le gène Tsc1 en transfectant CRE-GFP dirigé par un promoteur spécifique aux BCs dans des cultures organotypiques provenant de souris Tsc1lox. Le knockdown in vitro de Tsc1 a causé une augmentation précoce de la densité des boutons et des embranchements terminaux formés par les BCs mutantes, augmentation renversée par le traitement à la rapamycine. Ces données suggèrent que l’hyperactivation de la voie de signalisation de mTOR affecte le rythme de la maturation des synapses des BCs. Pour investiguer le rôle de mTORC1 dans les interneurones GABAergiques in vivo, nous avons croisé les souris Tsc1lox avec les souris Nkx2.1-Cre et PV-Cre. À P18, les souris Tg(Nkx2.1-Cre);Tsc1flox/flox ont montré une hyperactivation de mTORC1 et une hypertrophie somatique des BCs de même qu’une augmentation de l’expression de PV dans la région périsomatique des neurones pyramidaux. Au contraire, à P45 nous avons découvert une réduction de la densité des punctas périsomatiques PV-gephyrin (un marqueur post-synaptique GABAergique). L’étude de la morphologie des BCs en cultures organotypiques provenant du knock-out conditionnel Nkx2.1-Cre a confirmé l’augmentation initiale du rythme de maturation, lequel s’effondre ensuite aux étapes développementales tardives. De plus, les souris Tg(Nkx2.1Cre);Tsc1flox/flox montrent des déficits dans la mémoire de travail et le comportement social et ce d’une façon dose-dépendante. En somme, ces résultats suggèrent que l’activation contrôlée de mTOR régule le déroulement de la maturation et la maintenance des synapses des BCs. Des dysfonctions de la neurotransmission GABAergique ont été impliquées dans des maladies telles que l’épilepsie et chez certains patients, elles sont associées avec des mutations du récepteur GABAA. De quelle façon ces mutations affectent le processus de maturation des BCs demeuret toutefois inconnu. Pour adresser cette question, nous avons utilisé la stratégie Cre-lox pour déléter le gène GABRA1, codant pour la sous-unité alpha-1 du récepteur GABAA dans une unique BC en culture organotypique. La perte de GABRA1 réduit l’étendue du champ d’innervation des BCs, suggérant que des variations dans les entrées inhibitrices en raison de l’absence de la sous-unité GABAAR α1 peuvent affecter le développement des BCs. La surexpression des sous-unités GABAAR α1 contenant des mutations identifiées chez des patients épileptiques ont montré des effets similaires en termes d’étendue du champ d’innervation des BCs. Pour approfondir, nous avons investigué les effets de ces mutations identifiées chez l’humain dans le développement des épines des neurones pyramidaux, lesquelles sont l’endroit privilégié pour la formation des synapses excitatrices. Somme toute, ces données montrent pour la première fois que différentes mutations de GABRA1 associées à des syndromes épileptiques peuvent affecter les épines dendritiques et la formation des boutons GABAergiques d’une façon mutation-spécifique.

Role of the cotransporter KCC2 in cortical excitatory synapse development and febrile seizure susceptibility

Le co-transporteur KCC2 spécifique au potassium et chlore a pour rôle principal de réduire la concentration intracellulaire de chlore, entraînant l’hyperpolarisation des courants GABAergic l’autorisant ainsi à devenir inhibiteur dans le cerveau mature. De plus, il est aussi impliqué dans le développement des synapses excitatrices, nommées aussi les épines dendritiques. Le but de notre projet est d’étudier l’effet des modifications concernant l'expression et la fonction de KCC2 dans le cortex du cerveau en développement dans un contexte de convulsions précoces. Les convulsions fébriles affectent environ 5% des enfants, et ce dès la première année de vie. Les enfants atteints de convulsions fébriles prolongées et atypiques sont plus susceptibles à développer l’épilepsie. De plus, la présence d’une malformation cérébrale prédispose au développement de convulsions fébriles atypiques, et d’épilepsie du lobe temporal. Ceci suggère que ces pathologies néonatales peuvent altérer le développement des circuits neuronaux irréversiblement. Cependant, les mécanismes qui sous-tendent ces effets ne sont pas encore compris. Nous avons pour but de comprendre l'impact des altérations de KCC2 sur la survenue des convulsions et dans la formation des épines dendritiques. Nous avons étudié KCC2 dans un modèle animal de convulsions précédemment validé, qui combine une lésion corticale à P1 (premier jour de vie postnatale), suivie d'une convulsion induite par hyperthermie à P10 (nommés rats LHS). À la suite de ces insultes, 86% des rats mâles LHS développent l’épilepsie à l’âge adulte, au même titre que des troubles d’apprentissage. À P20, ces animaux presentent une augmentation de l'expression de KCC2 associée à une hyperpolarisation du potentiel de réversion de GABA. De plus, nous avons observé des réductions dans la taille des épines dendritiques et l'amplitude des courants post-synaptiques excitateurs miniatures, ainsi qu’un déficit de mémoire spatial, et ce avant le développement des convulsions spontanées. Dans le but de rétablir les déficits observés chez les rats LHS, nous avons alors réalisé un knock-down de KCC2 par shARN spécifique par électroporation in utero. Nos résultats ont montré une diminution de la susceptibilité aux convulsions due à la lésion corticale, ainsi qu'une restauration de la taille des épines. Ainsi, l’augmentation de KCC2 à la suite d'une convulsion précoce, augmente la susceptibilité aux convulsions modifiant la morphologie des épines dendritiques, probable facteur contribuant à l’atrophie de l’hippocampe et l’occurrence des déficits cognitifs. Le deuxième objectif a été d'inspecter l’effet de la surexpression précoce de KCC2 dans le développement des épines dendritiques de l’hippocampe. Nous avons ainsi surexprimé KCC2 aussi bien in vitro dans des cultures organotypiques d’hippocampe, qu' in vivo par électroporation in utero. À l'inverse des résultats publiés dans le cortex, nous avons observé une diminution de la densité d’épines dendritiques et une augmentation de la taille des épines. Afin de confirmer la spécificité du rôle de KCC2 face à la région néocorticale étudiée, nous avons surexprimé KCC2 dans le cortex par électroporation in utero. Cette manipulation a eu pour conséquences d’augmenter la densité et la longueur des épines synaptiques de l’arbre dendritique des cellules glutamatergiques. En conséquent, ces résultats ont démontré pour la première fois, que les modifications de l’expression de KCC2 sont spécifiques à la région affectée. Ceci souligne les obstacles auxquels nous faisons face dans le développement de thérapie adéquat pour l’épilepsie ayant pour but de moduler l’expression de KCC2 de façon spécifique.

The role of mechanistic target of rapamycin (mTOR) pathway and synaptic protein GABAA-R in cortical GABAergic cell connectivity

Quelque 30 % de la population neuronale du cortex mammalien est composée d’une population très hétérogène d’interneurones GABAergiques. Ces interneurones diffèrent quant à leur morphologie, leur expression génique, leurs propriétés électrophysiologiques et leurs cibles subcellulaires, formant une riche diversité. Après leur naissance dans les éminences ganglioniques, ces cellules migrent vers les différentes couches corticales. Les interneurones GABAergiques corticaux exprimant la parvalbumin (PV), lesquels constituent le sous-type majeur des interneurones GABAergiques, ciblent spécifiquement le soma et les dendrites proximales des neurones principaux et des neurones PV+. Ces interneurones sont nommés cellules à panier (Basket Cells –BCs) en raison de la complexité morphologique de leur axone. La maturation de la connectivité distincte des BCs PV+, caractérisée par une augmentation de la complexité de l’axone et de la densité synaptique, se déroule graduellement chez la souris juvénile. Des travaux précédents ont commencé à élucider les mécanismes contrôlant ce processus de maturation, identifiant des facteurs génétiques, l’activité neuronale ainsi que l’expérience sensorielle. Cette augmentation marquante de la complexité axonale et de la synaptogénèse durant cette phase de maturation suggère la nécessité d’une synthèse de protéines élevée. La voie de signalisation de la cible mécanistique de la rapamycine (Mechanistic Target Of Rapamycin -mTOR) a été impliquée dans le contrôle de plusieurs aspects neurodéveloppementaux en régulant la synthèse de protéines. Des mutations des régulateurs Tsc1 et Tsc2 du complexe mTOR1 causent la sclérose tubéreuse (TSC) chez l’humain. La majorité des patients TSC développent des problèmes neurologiques incluant des crises épileptiques, des retards mentaux et l’autisme. D’études récentes ont investigué le rôle de la dérégulation de la voie de signalisation de mTOR dans les neurones corticaux excitateurs. Toutefois, son rôle dans le développement des interneurones GABAergiques corticaux et la contribution spécifique de ces interneurones GABAergiques altérés dans les manifestations de la maladie demeurent largement inconnus. Ici, nous avons investigué si et comment l’ablation du gène Tsc1 perturbe le développement de la connectivité GABAergique, autant in vitro que in vivo. Pour investiguer le rôle de l’activation de mTORC1 dans le développement d’une BC unique, nous avons délété le gène Tsc1 en transfectant CRE-GFP dirigé par un promoteur spécifique aux BCs dans des cultures organotypiques provenant de souris Tsc1lox. Le knockdown in vitro de Tsc1 a causé une augmentation précoce de la densité des boutons et des embranchements terminaux formés par les BCs mutantes, augmentation renversée par le traitement à la rapamycine. Ces données suggèrent que l’hyperactivation de la voie de signalisation de mTOR affecte le rythme de la maturation des synapses des BCs. Pour investiguer le rôle de mTORC1 dans les interneurones GABAergiques in vivo, nous avons croisé les souris Tsc1lox avec les souris Nkx2.1-Cre et PV-Cre. À P18, les souris Tg(Nkx2.1-Cre);Tsc1flox/flox ont montré une hyperactivation de mTORC1 et une hypertrophie somatique des BCs de même qu’une augmentation de l’expression de PV dans la région périsomatique des neurones pyramidaux. Au contraire, à P45 nous avons découvert une réduction de la densité des punctas périsomatiques PV-gephyrin (un marqueur post-synaptique GABAergique). L’étude de la morphologie des BCs en cultures organotypiques provenant du knock-out conditionnel Nkx2.1-Cre a confirmé l’augmentation initiale du rythme de maturation, lequel s’effondre ensuite aux étapes développementales tardives. De plus, les souris Tg(Nkx2.1Cre);Tsc1flox/flox montrent des déficits dans la mémoire de travail et le comportement social et ce d’une façon dose-dépendante. En somme, ces résultats suggèrent que l’activation contrôlée de mTOR régule le déroulement de la maturation et la maintenance des synapses des BCs. Des dysfonctions de la neurotransmission GABAergique ont été impliquées dans des maladies telles que l’épilepsie et chez certains patients, elles sont associées avec des mutations du récepteur GABAA. De quelle façon ces mutations affectent le processus de maturation des BCs demeuret toutefois inconnu. Pour adresser cette question, nous avons utilisé la stratégie Cre-lox pour déléter le gène GABRA1, codant pour la sous-unité alpha-1 du récepteur GABAA dans une unique BC en culture organotypique. La perte de GABRA1 réduit l’étendue du champ d’innervation des BCs, suggérant que des variations dans les entrées inhibitrices en raison de l’absence de la sous-unité GABAAR α1 peuvent affecter le développement des BCs. La surexpression des sous-unités GABAAR α1 contenant des mutations identifiées chez des patients épileptiques ont montré des effets similaires en termes d’étendue du champ d’innervation des BCs. Pour approfondir, nous avons investigué les effets de ces mutations identifiées chez l’humain dans le développement des épines des neurones pyramidaux, lesquelles sont l’endroit privilégié pour la formation des synapses excitatrices. Somme toute, ces données montrent pour la première fois que différentes mutations de GABRA1 associées à des syndromes épileptiques peuvent affecter les épines dendritiques et la formation des boutons GABAergiques d’une façon mutation-spécifique.

Los calzones de Bandilac : vodevil en tres actos y en prosa /

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Medial prefrontal cortex suppression of the hypothalamic–pituitary–adrenal axis response to a physical stressor, systemic delivery of interleukin-1β

Previous studies have shown that the medial prefrontal cortex can suppress the hypothalamic-pituitary-adrenal axis response to stress. However, this effect appears to vary with the type of stressor. Furthermore, the absence of direct projections between the medial prefrontal cortex and corticotropin-releasing factor cells at the apex of the hypothalamic-pituitary-adrenal axis suggest that other brain regions must act as a relay when this inhibitory mechanism is activated. In the present study, we first established that electrolytic lesions involving the prelimbic and infralimbic medial prefrontal cortex increased plasma adrenocorticotropic hormone levels seen in response to a physical stressor, the systemic delivery of interleukin-1beta. However, medial prefrontal cortex lesions did not alter plasma adrenocorticotropic hormone levels seen in response to a psychological stressor, noise. To identify brain regions that might mediate the effect of medial prefrontal cortex lesions on hypothalamic-pituitary-adrenal axis responses to systemic interleukin-1beta, we next mapped the effects of similar lesions on interleukin-1beta-induced Fos expression in regions previously shown to regulate the hypothalamic-pituitary-adrenal axis response to this stressor. It was found that medial prefrontal cortex lesions reduced the number of Fos-positive cells in the ventral aspect of the bed nucleus of the stria terminalis. However, the final experiment, which involved combining retrograde tracing with Fos immunolabelling, revealed that bed nucleus of the stria terminalis-projecting medial prefrontal cortex neurons were largely separate from medial prefrontal cortex neurons recruited by systemic interleukin-1beta, an outcome that is difficult to reconcile with a simple medial prefrontal cortex-bed nucleus of the stria terminalis-corticotropin-releasing factor cell control circuit.

Genes and gene expression in the brain of the alcoholic

Chronic alcoholism leads to localized brain damage, which is prominent in superior frontal cortex but mild in motor cortex. The likelihood of developing alcohol dependence is associated with genetic markers. GABA(A) receptor expression differs between alcoholics and controls, whereas glutamate receptor differences are muted. We determined whether genotype differentiated the localized expression of glutamate and gamma-aminobutyric acid (GABA) receptors to influence the severity of alcohol-induced brain damage. Cerebrocortical tissue was obtained at autopsy from alcoholics without alcohol-related disease, alcoholics with cirrhosis, and matched controls. DRD2A, DRD2B, GABB2, EAAT2, and 5HTT genotypes did not divide alcoholic cases and controls on N-methyl-D-aspartate (NMDA) receptor parameters. In contrast, alcohol dehydrogenase (ADH)3 genotype interacted significantly with NMDA receptor efficacy and affinity in a region-specific manner. EAAT2 genotype interacted significantly with local GABAA receptor subunit mRNA expression, and GABB2 and DRD2B genotypes with p subunit isoform protein expression. Genotype may modulate amino acid transmission locally so as to mediate neuronal vulnerability. This has implications for the effectiveness of pharmacological interventions aimed at ameliorating brain damage and, possibly, dependence. (C) 2004 Elsevier Ltd. All rights reserved

GABAA receptor beta subunit mRNA expression in the human alcoholic brain

A competitive RT-PCR assay was used to quantify the expression of the GABA(A) receptor beta(1), beta(2) and beta(3) isoform mRNA transcripts in the superior frontal cortex and motor cortex of 21 control and 22 alcoholic cases. A single set of primers was designed that permitted amplification of all three transcripts and the internal standard simultaneously; differentiation of the individual transcripts was achieved by restriction enzyme digestion. Construction of a standard curve, using the internal standard and a concentration range of beta(2) cRNA-enabled quantitation of mRNA expression levels. No significant difference in mRNA expression was found between the control and alcoholic case groups in either the superior frontal or motor cortex for the beta(2) or beta(3) isoforms. A significant interaction was found between isoform and area, although, the two case groups did not partition on this measure. The interaction was due to a significant difference between superior frontal and motor cortex for the beta(3) isoform; this regional comparison was not significant for beta(2) mRNA. Age at death and post-mortem delay (PMD) had no significant effect on beta mRNA expression in either case group in either region. A beta(1) signal could not be detected in the RT-PCR assay. (C) 2004 Elsevier Ltd. All rights reserved.

Type 1 nitrergic (ND1) cells of the rabbit retina: Comparison with other axon-bearing amacrine cells

NADPH diaphorase (NADPHd) histochemistry labels two types of nitrergic amacrine cells in the rabbit retina. Both the large ND1 cells and the small ND2 cells stratify in the middle of the inner plexiform layer, and their overlapping processes produce a dense plexus, which makes it difficult to trace the morphology of single cells. The complete morphology of the ND1 amacrine cells has been revealed by injecting Neurobiotin into large round somata in the inner nuclear layer, which resulted in the labelling of amacrine cells whose proximal morphology and stratification matched those of the ND1 cells stained by NADPHd histochemistry. The Neurobiotin-injected ND1 cells showed strong homologous tracer coupling to surrounding ND1 cells, and double-labelling experiments confirmed that these coupled cells showed NADPHd reactivity. The ND1 amacrine cells branch in stratum 3 of the inner plexiform layer, where they produce a sparsely branched dendritic tree of 400-600 mum diameter in ventral peripheral retina. In addition, each cell gives rise to several fine beaded processes, which arise either from a side branch of the dendritic tree or from the tapering of a distal dendrite. These axon-like processes branch successively within the vicinity of the dendritic field before extending, with little or no further branching, for 3-5 mm from the soma in ventral peripheral retina. Consequently, these cells may span one-third of the visual field of each eye, and their spatial extent appears to be greater than that of most other types of axon-bearing amacrine cells injected with Neurobiotin in this study. The morphology and tracer-coupling pattern of the ND1 cells are compared with those of confirmed type 1 catecholaminergic cells, a presumptive type 2 catecholaminergic cell, the type 1 polyaxonal. cells, the long-range amacrine cells, a novel type of axon-bearing cell that also branches in stratum 3, and a type of displaced amacrine cell that may correspond to the type 2 polyaxonal cell. (C) 2004 Wiley-Liss, Inc.

The type 1 polyaxonal amacrine cells of the rabbit retina: A tracer-coupling study

The type 1 polyaxonal (PA1) cell is a distinct type of axon-bearing amacrine cell whose soma commonly occupies an interstitial position in the inner plexiform layer; the proximal branches of the sparse dendritic tree produce 1-4 axon-like processes, which form an extensive axonal arbor that is concentric with the smaller dendritic tree (Dacey, 1989; Famiglietti, 1992a,b). In this study, intracellular injections of Neurobiotin have revealed the complete dendritic and axonal morphology of the PA1 cells in the rabbit retina, as well as labeling the local array of PA1 cells through homologous tracer coupling. The dendritic-field area of the PA1 cells increased from a minimum of 0.15 mm(2) (0.44-mm equivalent diameter) on the visual streak to a maximum of 0.67 mm(2) (0.92-mm diameter) in the far periphery; the axonal-field area also showed a 3-fold variation across the retina, ranging from 3.1 mm(2) (2.0-mm diameter) to 10.2 mm(2) (3.6-mm diameter). The increase in dendritic- and axonal-field size was accompanied by a reduction in cell density, from 60 cells/mm(2) in the visual streak to 20 cells/mm(2) in the far periphery, so that the PA1 cells showed a 12 times overlap of their dendritic fields across the retina and a 200-300 times overlap of their axonal fields. Consequently, the axonal plexus was much denser than the dendritic plexus, with each square millimeter of retina containing similar to100 mm of dendrites and similar to1000 mm of axonal processes. The strong homologous tracer coupling revealed that similar to45% of the PA1 somata were located in the inner nuclear layer, similar to50% in the inner plexiform layer, and similar to5% in the ganglion cell layer. In addition, the Neurobiotin-injected PA1 cells sometimes showed clear heterologous tracer coupling to a regular array of small ganglion cells, which were present at half the density of the PA1 cells. The PA1 cells were also shown to contain elevated levels of gamma-aminobutyric acid (GABA), like other axon-bearing amacrine cells.

Functional maturation of isolated neural progenitor cells from the adult rat hippocampus

Although neural progenitor cells (NPCs) may provide a source of new neurons to alleviate neural trauma, little is known about their electrical properties as they differentiate. We have previously shown that single NPCs from the adult rat hippocampus can be cloned in the presence of heparan sulphate chains purified from the hippocampus, and that these cells can be pushed into a proliferative phenotype with the mitogen FGF2 [Chipperfield, H., Bedi, K.S., Cool, S.M. & Nurcombe, V. (2002) Int. J. Dev. Biol., 46, 661-670]. In this study, the active and passive electrical properties of both undifferentiated and differentiated adult hippocampal NPCs, from 0 to 12 days in vitro as single-cell preparations, were investigated. Sparsely plated, undifferentiated NPCs had a resting membrane potential of approximate to -90 mV and were electrically inexcitable. In > 70%, ATP and benzoylbenzoyl-ATP evoked an inward current and membrane depolarization, whereas acetylcholine, noradrenaline, glutamate and GABA had no detectable effect. In Fura-2-loaded undifferentiated NPCs, ATP and benzoylbenzoyl-ATP evoked a transient increase in the intracellular free Ca2+ concentration, which was dependent on extracellular Ca2+ and was inhibited reversibly by pyridoxalphosphate-6-azophenyl-2'-4'-disulphonic acid (PPADS), a P2 receptor antagonist. After differentiation, NPC-derived neurons became electrically excitable, expressing voltage-dependent TTX-sensitive Na+ channels, low- and high-voltage-activated Ca2+ channels and delayed-rectifier K+ channels. Differentiated cells also possessed functional glutamate, GABA, glycine and purinergic (P2X) receptors. Appearance of voltage-dependent and ligand-gated ion channels appears to be an important early step in the differentiation of NPCs.

Comparison of taurine- and glycine-induced conformational changes in the M2-M3 domain of the glycine receptor

In the ionotropic glutamate receptor, the global conformational changes induced by partial agonists are smaller than those induced by full agonists. However, in the pentameric ligand-gated ion channel receptor family, the structural basis of partial agonism is not understood. This study investigated whether full and partial agonists induce different conformation changes in the glycine receptor chloride channel ( GlyR). A substituted cysteine accessibility analysis demonstrated previously that glycine binding induced an increase in surface accessibility of all residues from Arg(271) to Lys(276) in the M2-M3 domain of the homomeric alpha1 GlyR. Here we compare the surface accessibility changes induced by the full agonist, glycine, and the partial agonist, taurine. In GlyRs incorporating the A272C, S273C, L274C, or P275C mutation, the reaction rate of the cysteine-specific compound, methanethiosulfonate ethyltrimethylammonium, depended on how strongly the receptors were activated but was agonist-independent. Reaction rates could not be compared in the R271C and K276C mutant GlyRs because methanethiosulfonate ethyltrimethylammonium did not modify the extremely small currents induced by saturating taurine or equivalent low glycine concentrations. The results indicate that bound taurine and glycine molecules impose identical conformational changes to the M2-M3 domain. We therefore conclude that the higher efficacy of glycine is due to an increased ability to stabilize a common activated configuration.

A picrotoxin-specific conformational change in the glycine receptor M2-M3 loop.

The external loop linking the M2 and M3 transmembrane domains is crucial for coupling agonist binding to channel gating in the glycine receptor chloride channel (GlyR). A substituted cysteine accessibility scan previously showed that glycine activation increased the surface accessibility of 6 contiguous residues (Arg(271) Lys(276)) toward the N-terminal end of the homomeric alpha 1 GlyR M2 - M3 loop. In the present study we used a similar approach to determine whether the allosteric antagonist, picrotoxin, could impose conformational changes to this domain that cannot be induced by varying agonist concentrations alone. Picrotoxin slowed the reaction rate of a sulfhydryl-containing compound ( MTSET) with A272C, S273C, and L274C. Before interpreting this as a picrotoxin-specific conformational change, it was necessary to eliminate the possibility of steric competition between picrotoxin and MTSET. Accordingly, we showed that picrotoxin and the structurally unrelated blocker, bilobalide, were both trapped in the R271C GlyR in the closed state and that a point mutation to the pore-lining Thr(6') residue abolished inhibition by both compounds. We also demonstrated that the picrotoxin dissociation rate was linearly related to the channel open probability. These observations constitute a strong case for picrotoxin binding in the pore. We thus conclude that the picrotoxin-specific effects on the M2 - M3 loop are mediated allosterically. This suggests that the M2 - M3 loop responds differently to the occupation of different binding sites.

Developmental Vitamin D-3 deficiency alters the adult rat brain

There is growing evidence that Vitamin D-3 (1,25-dihydroxyvitamin D-3) is involved in brain development. We have recently shown that the brains of newborn rats from Vitamin D-3 deficient dams were larger than controls, had increased cell proliferation, larger lateral ventricles, and reduced cortical thickness. Brains from these animals also had reduced expression of nerve growth factor (NGF) and glial cell line-derived neurotrophic factor. The aim of the current study was to examine if there were any permanent outcomes into adulthood when the offspring of Vitamin D-3 deficient dams were restored to a normal diet. The brains of adult rats were examined at 10 weeks of age after Vitamin D-3 deficiency until birth or weaning. Compared to controls animals that were exposed to transient early Vitamin D-3 deficiency had larger lateral ventricles, reduced NGF protein content, and reduced expression of a number genes involved in neuronal structure, i.e. neurofilament or MAP-2 or neurotransmission, i.e. GABA-(alpha 4). We conclude that transient early life hypovitaminosis D-3 not only disrupts brain development but leads to persistent changes in the adult brain. In light of the high incidence of hypovitammosis D-3 in women of child-bearing age, the public health implications of these findings warrant attention. (c) 2005 Elsevier Inc. All rights reserved.

Ligand-gated channels

Ligand-gated ion channels (LGICs) are fast-responding channels in which the receptor, which binds the activating molecule (the ligand), and the ion channel are part of the same nanomolecular protein complex. This paper will describe the properties and functions of the nicotinic acetylcholine LGIC superfamily, which plays a critical role in the fast chemical transmission of electrical signals between nerve cells and between nerve and muscle cells. The superfamily will mainly be exemplified by the excitatory nicotinic acetylcholine receptor (nAChR) and the inhibitory glycine receptor (GlyR) channels.

Glycinergic and GABAergic synaptic activity differentially regulate motoneuron survival and skeletal muscle innervation

GABAergic and glycinergic synaptic transmission is proposed to promote the maturation and refinement of the developing CNS. Here we provide morphological and functional evidence that glycinergic and GABAergic synapses control motoneuron development in a region-specific manner during programmed cell death. In gephyrin-deficient mice that lack all postsynaptic glycine receptor and some GABA(A) receptor clusters, there was increased spontaneous respiratory motor activity, reduced respiratory motoneuron survival, and decreased innervation of the diaphragm. In contrast, limb-innervating motoneurons showed decreased spontaneous activity, increased survival, and increased innervation of their target muscles. Both GABA and glycine increased limb-innervating motoneuron activity and decreased respiratory motoneuron activity in wild-type mice, but only glycine responses were abolished in gephyrin-deficient mice. Our results provide genetic evidence that the development of glycinergic and GABAergic synaptic inputs onto motoneurons plays an important role in the survival, axonal branching, and spontaneous activity of motoneurons in developing mammalian embryos.