Étude des voies d’apprêtement des antigènes viraux menant à la présentation antigénique par les CMH de classe I

Le contrôle immunitaire des infections virales est effectué, en grande partie, par les lymphocytes T CD8+ cytotoxiques. Pour y parvenir, les lymphocytes T CD8+ doivent être en mesure de reconnaître les cellules infectées et de les éliminer. Cette reconnaissance des cellules infectées s’effectue par l’interaction du récepteur T (TCR) des lymphocytes T CD8+ et des peptides viraux associés au complexe majeur d’histocompatibilité (CMH) de classe I à la surface des cellules hôtes. Cette interaction constitue l’élément déclencheur permettant l’élimination de la cellule infectée. On comprend donc toute l’importance des mécanismes cellulaires menant à la génération des peptides antigéniques à partir des protéines virales produites au cours d’une infection. La vision traditionnelle de cet apprêtement protéique menant à la présentation d’antigènes par les molécules du CMH propose deux voies cataboliques distinctes. En effet, il est largement admis que les antigènes endogènes sont apprêtés par la voie dite ‘‘classique’’ de présentation antigénique par les CMH de classe I. Cette voie implique la dégradation des antigènes intracellulaires par le protéasome dans le cytoplasme, le transport des peptides résultant de cette dégradation à l’intérieur du réticulum endoplasmique, leur chargement sur les molécules du CMH de classe I et finalement le transport des complexes peptide-CMH à la surface de la cellule où ils pourront activer les lymphocytes T CD8+. Dans la seconde voie impliquant des antigènes exogènes, le dogme veut que ceux-ci soient apprêtés par les protéases du compartiment endovacuolaire. Les peptides ainsi générés sont directement chargés sur les molécules de CMH de classe II à l’intérieur de ce compartiment. Par la suite, des mécanismes de recyclage vésiculaire assurent le transport des complexes peptide-CMH de classe II à la surface de la cellule afin de stimuler les lymphocytes T CD4+. Cependant, cette stricte ségrégation des voies d’apprêtement antigénique a été durement éprouvée par la capacité des cellules présentatrices d’antigènes à effectuer l’apprêtement d’antigènes exogènes et permettre leur présentation sur des molécules de CMH de classe I. De plus, l’identification récente de peptides d’origine intracellulaire associés à des molécules de CMH de classe II a clairement indiqué la présence d’interactions entre les deux voies d’apprêtement antigénique permettant de transgresser le dogme préalablement établi. L’objectif du travail présenté ici était de caractériser les voies d’apprêtement antigénique menant à la présentation d’antigènes viraux par les molécules du CMH de classe I lors d’une infection par le virus de l’Herpès simplex de type I (HSV-1). Dans les résultats rapportés ici, nous décrivons une nouvelle voie d’apprêtement antigénique résultant de la formation d’autophagosomes dans les cellules infectées. Cette nouvelle voie permet le transfert d’antigènes viraux vers un compartiment vacuolaire dégradatif dans la phase tardive de l’infection par le virus HSV-1. Cette mise en branle d’une seconde voie d’apprêtement antigénique permet d’augmenter le niveau de présentation de la glycoprotéine B (gB) virale utilisée comme modèle dans cette étude. De plus, nos résultats décrivent la formation d’une nouvelle forme d’autophagosomes dérivés de l’enveloppe nucléaire en réponse à l’infection par le virus HSV-1. Ces nouveaux autophagosomes permettent le transfert d’antigènes viraux vers un compartiment vacuolaire lytique, action également assurée par les autophagosomes dits classiques. Dans la deuxième partie du travail présenté ici, nous utilisons l’infection par le virus HSV-1 et la production de la gB qui en résulte pour étudier le trafic membranaire permettant le transfert de la gB vers un compartiment vacuolaire dégradatif. Nos résultats mettent en valeur l’importance du réticulum endoplasmique, et des compartiments autophagiques qui en dérivent, dans ces mécanismes de transfert antigénique permettant d’amplifier la présentation antigénique de la protéine virale gB sur des CMH de classe I via une voie vacuolaire. L’ensemble de nos résultats démontrent également une étroite collaboration entre la voie classique de présentation antigénique par les CMH de classe I et la voie vacuolaire soulignant, encore une fois, la présence d’interaction entre les deux voies.

Étude du polymorphisme du gène majeur d’histocompatibilité de classe IIb (MHIIb) chez l’omble de fontaine (Salvelinus fontinalis)

Les molécules classiques du complexe majeur d’histocompatibilité de classe II (CMHII) sont des glycoprotéines de surface spécialisées dans la présentation de peptides, principalement dérivés de pathogènes extracellulaires, aux récepteurs des lymphocytes T CD4+ afin d’initier la réponse immunitaire adaptative. Elles sont encodées, avec celles du CMH de classe I, par les gènes les plus polymorphiques identifiés jusqu’à maintenant, avec plusieurs loci et une grande diversité allélique à chacun d’eux. De plus, le polymorphisme des gènes du CMHII n’est pas limité qu’aux séquences codantes. Il est également observé dans les promoteurs où on a démontré ses effets sur le niveau d’expression des gènes. La variation de la régulation d’un gène est considérée comme un facteur important et pour laquelle des modifications morphologiques, physiologiques et comportementales sont observées chez tous les organismes. Des séquences d’ADN répétées impliquées dans cette régulation ont été identifiées dans les régions non-codantes des génomes. D’un autre côté, la sélection par les pathogènes permettrait l’évolution et le maintien du polymorphisme des gènes du CMH chez les vertébrés. À ce sujet, plusieurs études ont montré l’implication de différents allèles du CMH dans la résistance ou la susceptibilité aux maladies. Cette étude avait pour objectifs de caractériser le polymorphisme du gène MHIIb chez l’omble de fontaine (Salvelinus fontinalis) et de documenter ses effets au niveau de la survie conférée par des allèles et/ou génotypes particuliers lors d’une infection, ainsi que sur la variation du niveau d’expression du gène dans différentes conditions. Dans une première partie, nous avons identifié un total de 6 allèles du gène MHIIb, désignés Safo-DAB*0101 à Safo-DAB*0601, qui montrent une grande similarité avec les séquences codantes provenant de poissons téléostéens et de l’humain. L’analyse des séquences du domaine b1 a permis de détecter l’effet d’une pression sélective positive pour maintenir le polymorphisme dans cette région de la molécule. Quatre de ces allèles ont été testés lors d’une expérience d’infection avec le pathogène Aeromonas salmonicida afin d’évaluer l’effet qu’ils pouvaient avoir sur la survie des poissons. Nous avons trouvé que l’allèle DAB*0101 était significativement associé à la résistance à la furonculose. En plus d’avoir été identifié chez les individus homozygotes pour cet allèle, l’effet a également été remarqué au niveau de la survie les poissons de génotype DAB*0101/*0201. À l’opposé, les facteurs de risque élevé obtenus pour les génotypes DAB*0201/*0301 et DAB*0301/*0401 suggèrent plutôt une association à la susceptibilité. Étant donné la faible fréquence à laquelle l’allèle DAB*0101 a été retrouvé dans la population, le modèle de la sélection dépendante de la fréquence pourrait expliquer l’avantage conféré par ce dernier et souligne l’importance de ce mécanisme pour le maintien du polymorphisme du gène MHIIb chez l’omble de fontaine. Dans une seconde partie, nous avons rapporté la présence d’un minisatellite polymorphique formé d’un motif de 32 nucléotides dans le second intron du gène MHIIb, et pour lequel un nombre exclusif de répétitions du motif a été associé à chaque allèle (69, 27, 20, 40, 19 et 25 répétitions pour les allèles DAB*0101 à DAB*0601 respectivement). L’expression relative de quatre allèles a été évaluée dans des poissons hétérozygotes aux températures de 6 ºC et 18 ºC. Les résultats indiquent que les allèles possédant un long minisatellite montrent une réduction de l’expression du gène d’un facteur 1,67 à 2,56 par rapport aux allèles qui en contiennent un court. De même, des allèles qui incluent des minisatellites de tailles similaires n’affichent pas de différence significative au niveau de l’abondance du transcrit aux deux températures. De plus, l’effet répressif associé aux longs minisatellites est amplifié à la température de 18 ºC dans des poissons de trois génotypes différents. Nous avons finalement observé une augmentation significative par un facteur 2,08 de l’expression totale du gène MHIIb à la température de 6 ºC. Ces résultats appuient l’implication des séquences d’ADN répétées dans la régulation de l’activité transcriptionnelle d’un gène et suggèrent qu’un minisatellite sensible aux différences de températures pourrait être soumis aux forces sélectives et jouer un rôle important dans l’expression de gènes et l’évolution des organismes poïkilothermes.

Étude polarimétrique d’étoiles jeunes

Afin de mieux comprendre l'évolution des étoiles jeunes, nous avons utilisé un code Monte Carlo simulant leur environnement afin d'étudier une nouvelle distribution chez les étoiles Herbig Ae/Be et pour reproduire des cartes d'intensité et de polarisation linéaire obtenues au télescope Canada-France-Hawaii (TCFH) en novembre 2003. Le code datant de la fin des années 80, nous avons dû non seulement le corriger, mais aussi ajouter quelques éléments afin de tenir compte des dernières avancées dans le domaine de la polarisation provenant du milieu circumstellaire. Les étoiles à l'étude étant jeunes (moins de quelques millions d'années), leur voisinage est toujours constitué de grains de poussière mélangés avec du gaz. Selon leur âge, nous retrouvons cette poussière sous différentes structures soit, par exemple, par un disque entouré d'une enveloppe (objets jeunes de classe I) ou par un simple disque (objets de classe II et III). Selon la structure que prend la poussière, les cartes de polarisation et d'intensité qui en résultent vont changer. Nous allons discuter de cette variation des cartes de polarisation selon la distribution de poussière. Suite aux modifications apportées au code, il a fallu s'assurer que celui-ci fonctionne bien. Pour ce faire, nous avons mis au point quelques critères qui nous assurent, s'ils sont satisfaits, que le code Monte Carlo produit de bons résultats. Après avoir validé le code, il est maintenant possible de l'utiliser aux fins d'avancer le domaine de la polarisation. En effet, Dullemond et al.(2001) proposent une nouvelle distribution de grain autour des étoiles Herbig Ae/Be afin de mieux expliquer leur distribution d'énergie spectrale. Par contre, qu'en est-il des cartes de polarisation résultantes? C'est sur cette question que nous nous sommes arrêtés. Par la suite, nous avons essayé de reproduire du mieux possible, tenant compte des limitations du code, les cartes de polarisation obtenues au TCFH. Nous avons étudié en détail les données de R Mon (résultats qui seront présentés sous forme d'article pour fin de publication) et de V376 Cas. De plus, notre étude de V376 Cas nous a permis d'amener des conclusions sur les processus causant les vecteurs parallèles aux disques des étoiles jeunes.

Exploration fonctionnelle des réponses cellulaires T CD4+ et CD8+ dans l’infection par le VIH-1

L’infection par le VIH-1 est caractérisée par une déplétion progressive des cellules T CD4+ ainsi que par un dysfonctionnement des cellules T qui, en l’absence de traitements anti-rétroviraux, conduit inéluctablement à la progression de la maladie vers le stade SIDA. Certains des mécanismes impliqués dans ce dysfonctionnement de la réponse cellulaire T ont été élucidés et ont révélé un rôle important de la molécule PD-1 dans l’exhaustion des cellules T en phase chronique de l’infection. En effet, des niveaux élevés de PD-1 ont été associés à une charge virale élevée ainsi qu’à une diminution de la production de cytokines et de la capacité de proliférer des cellules T spécifiques du virus. De plus, bloquer in vitro l’interaction de PD-1 avec son ligand PD-L1 en utilisant un anticorps bloquant rétabli la fonction de ces cellules. De façon intéressante, notre groupe ainsi que d’autres équipes, ont montré que l’expression de PD-1 était non seulement augmentée sur les cellules spécifiques de l’antigène mais aussi sur les cellules T totales. Cependant, peu de choses sont connues quant à l’impact de l’expression de PD-1 sur le renouvellement et la différenciation des cellules T qui expriment PD-1, et ce au cours de l’infection. L’expression de PD-1 n’a notamment pas été étudiée en phase aigue de l’infection. Nous montrons clairement que, aussi bien chez les individus en phase aigue qu’en phase chronique de l’infection, l’expression de PD-1 est augmentée sur toutes les sous-populations T, y compris les cellules naïves. Nous avons également mis en relief une distribution anormale des sous-populations T, ces cellules ayant un phénotype plus différencié, et ce à tous les stades de la maladie. Dans cette thèse, nous discutons le rôle possible de PD-1 dans l’homéostasie des cellules T chez les individus infectés par le VIH-1. En étudiant la transition de la phase aigue à la phase chronique de l’infection, nous avons trouvé que les sous-populations T CD8+ des individus récemment infectés exprimaient moins de PD-1 que celles des individus à un stade plus avancé de la maladie. Ces niveaux plus élevés de PD-1 sur les cellules T CD8+ en phase chronique sont associés à des niveaux réduits de prolifération in vivo – comme mesuré par l’expression de Ki67 – suggérant que l’expression de PD-1 est partiellement impliquée dans cette perte de fonction des cellules T CD8+. De plus, les cellules naïves s’accumulent en fréquence lors de la transition de la phase aigue à la phase chronique de l’infection. Considérant que les cellules naïves expriment déjà des hauts niveaux de PD-1, nous avons émis l’hypothèse que l’activation initiale des cellules T chez les individus chroniquement infectés est affectée. En résumé, nous proposons un modèle où des hauts niveaux d’expression de PD-1 sont associés à (1) un dysfonctionnement de la réponse cellulaire T CD8+ et (2) un défaut d’activation des cellules naïves ce qui contribue non seulement à la progression de la maladie mais aussi ce qui va limiter l’efficacité de potentiels vaccins dans l’infection par le VIH-1 en empêchant toute nouvelle réponse d’être initiée. Afin de mieux disséquer la réponse immunitaire mise en place lors d’une infection comme celle du VIH-1, nous avons développé un outil qui permet de détecter les cellules T CD4+ i.e. des tétramères de CMH de classe II. Ces réactifs ont pour but d’augmenter l’avidité du CMH de classe II pour son ligand et donc de détecter des TCR de faible affinité. Dans cette thèse, nous décrivons une méthode originale et efficace pour produire diverses molécules de HLA-DR liant de façon covalente le peptide antigénique. Mieux déterminer les mécanismes responsables de l’exhaustion des cellules T dans l’infection par le VIH-1 et de la progression de la maladie, ainsi que développer des outils de pointe pour suivre ces réponses T, est central à une meilleure compréhension de l’interaction entre le virus et le système immunitaire de l’hôte, et permettra ainsi le développement de stratégies pertinentes pour lutter contre l’infection par le VIH-1.

Étude structure-fonction des fructose-1,6-bisphosphate aldolases métallo-dépendantes : mécanisme catalytique et développement d’antimicrobiens

Les fructose-1,6-bisphosphate aldolases (FBPA) sont des enzymes glycolytiques (EC 4.1.2.13) qui catalysent la transformation réversible du fructose-1,6-bisphosphate (FBP) en deux trioses-phosphates, le glycéraldéhyde-3-phosphate (G3P) et le dihydroxyacétone phosphate (DHAP). Il existe deux classes de FBPA qui diffèrent au niveau de leur mécanisme catalytique. Les classes I passent par la formation d’un intermédiaire covalent de type iminium alors que les classes II, métallodépendantes, utilisent généralement un zinc catalytique. Contrairement au mécanisme des classes I qui a été très étudié, de nombreuses interrogations subsistent au sujet de celui des classes II. Nous avons donc entrepris une analyse détaillée de leur mécanisme réactionnel en nous basant principalement sur la résolution de structures cristallographiques. De nombreux complexes à haute résolution furent obtenus et ont permis de détailler le rôle de plusieurs résidus du site actif de l’enzyme. Nous avons ainsi corrigé l’identification du résidu responsable de l’abstraction du proton de l’O4 du FBP, une étape cruciale du mécanisme. Ce rôle, faussement attribué à l’Asp82 (chez Helicobacter pylori), est en fait rempli par l’His180, un des résidus coordonant le zinc. L’Asp82 n’en demeure pas moins essentiel car il oriente, active et stabilise les substrats. Enfin, notre étude met en évidence le caractère dynamique de notre enzyme dont la catalyse nécessite la relocalisation du zinc et de nombreux résidus. La dynamique de la protéine ne permet pas d’étudier tous les aspects du mécanisme uniquement par l’approche cristallographique. En particulier, le résidu effectuant le transfert stéréospécifique du proton pro(S) sur le carbone 3 (C3) du DHAP est situé sur une boucle qui n’est visible dans aucune de nos structures. Nous avons donc développé un protocole de dynamique moléculaire afin d’étudier sa dynamique. Validé par l’étude d’inhibiteurs de la classe I, l’application de notre protocole aux FBPA de classe II a confirmé l’identification du résidu responsable de cette abstraction chez Escherichia coli (Glu182) mais pointe vers un résidu diffèrent chez H. pylori (Glu149 au lieu de Glu142). Nos validations expérimentales confirment ces observations et seront consolidées dans le futur. Les FBPA de classe II sont absentes du protéome humain mais sont retrouvées chez de nombreux pathogènes, pouvant même s'y révéler essentielles. Elles apparaissent donc comme étant une cible idéale pour le développement de nouveaux agents anti-microbiens. L’obtention de nouveaux analogues des substrats pour ces enzymes a donc un double intérêt, obtenir de nouveaux outils d’étude du mécanisme mais aussi développer des molécules à visée pharmacologique. En collaboration avec un groupe de chimistes, nous avons optimisé le seul inhibiteur connu des FBPA de classe II. Les composés obtenus, à la fois plus spécifiques et plus puissants, permettent d’envisager une utilisation pharmacologique. En somme, c’est par l’utilisation de techniques complémentaires que de nouveaux détails moléculaires de la catalyse des FBPA de classe II ont pu être étudiés. Ces techniques permettront d’approfondir la compréhension fine du mécanisme catalytique de l’enzyme et offrent aussi de nouvelles perspectives thérapeutiques.

Développement d'une méthode d'isolation des noyaux adaptée aux macrophages pour une caractérisation protéomique d'une nouvelle structure autophagique induite par le virus HSV-1

L’autophagie est un processus cellulaire catabolique qui a été conservé durant l’évolution de la levure à l’homme. Cet important mécanisme consiste en une dégradation des composants cytoplasmiques dans une structure lytique, le lysosome. Il existe trois types de l’autophagie : la microautophagie, l’autophagie médiée par les chaperones et la macroautophagie nommée « autophagie ». Il a été démontré que lors de l’autophagie, le matériel cytoplasmique (protéines cytosoliques et organites) est séquestré dans l’autophagosome qui finit par fusionner avec le lysosome, formant ainsi l’autophagolysosome. Le matériel séquestré et la membrane interne de l’autophagosome seront dégradés par les hydrolases lysosomales. Plusieurs études se sont focalisées sur la détermination de la machinerie moléculaire et les mécanismes de l’autophagie. Il a été démontré l’implication de 31 molécules Atg essentielles dans le processus de l’autophagie. L’identification de ces protéines a permis de déceler le rôle de l’autophagie non seulement dans le maintien de l’homéostasie cellulaire mais aussi dans la défense contre les agents pathogènes. En effet, l’autophagie joue un rôle important dans l’immunité innée conduisant à contrôler l’évasion des pathogènes dont les bactéries et les virus. Également, l’autophagie est impliquée dans l’immunité adaptative en favorisant la présentation des antigènes viraux par le CMH de classe II aux cellules T CD4+. De plus, une étude récente suggère que l’autophagie contribue à la présentation antigénique par le CMH de classe I aux cellules T CD8+ durant une infection virale par le virus HSV-1 (Herpes simplex type 1). Toutefois, certains virus y compris HSV-1 ont pu développer des mécanismes pour contourner et inhiber en partie le rôle protecteur de l’autophagie. Récemment, une étude dans notre laboratoire a mis en évidence, lors d’une infection virale par HSV-1 des cellules macrophages BMA, la présence d’une nouvelle structure autophagique dans une phase tardive de l’infection. Cette nouvelle structure est différente des autophagosomes classiques à double membrane et est caractérisée morphologiquement par quatre membranes dérivées de l’enveloppe nucléaire interne et externe. Peu de choses ont été rapportées sur cette nouvelle voie autophagique qui peut être un mécanisme de défense cellulaire quand l’autophagie classique dans le cytosol est inhibée par HSV-1. Il devient donc intéressant de caractériser les molécules impliquées dans la formation de ces autophagosomes issus du noyau par spectrométrie de masse. Pour ce faire, il était impératif d’établir un outil d’isolation des noyaux à partir de macrophages infectés par HSV-1 dans lesquels les autophagosomes issus des noyaux seront formés. La validation de cette méthode d’isolation a été effectuée en déterminant la pureté et l’intégrité des noyaux isolés à partir des cellules non infectées (contrôle) et infectées par HSV-1. La pureté des préparations de noyaux isolés a été caractérisée par l’absence de contaminants cellulaires et un enrichissement en noyaux. Également, il a fallu déterminer la cinétique de formation des autophagosomes issus des noyaux pour les deux lignées cellulaires de macrophages utilisées dans ce projet. Dans une perspective future, l’analyse protéomique à partir des échantillons purs des noyaux isolés (non infectés et infectés) mènera à identifier les protéines impliquées dans la formation des autophagosomes dérivés des noyaux, ce qui permettra ultérieurement d’effectuer des études sur les mécanismes moléculaires et les fonctions de cette nouvelle voie autophagique.

Molecular interactions of arbuscular mycorrhizal fungi with mycotoxin-producing fungi and their role in plant defense responses

Les trichothécènes de Fusarium appartiennent au groupe des sesquiterpènes qui sont des inhibiteurs la synthèse des protéines des eucaryotes. Les trichothécènes causent d’une part de sérieux problèmes de santé aux humains et aux animaux qui ont consommé des aliments infectés par le champignon et de l’autre part, elles sont des facteurs importants de la virulence chez plantes. Dans cette étude, nous avons isolé et caractérisé seize isolats de Fusarium de la pomme de terre infectée naturellement dans un champs. Les tests de pathogénicité ont été réalisés pour évaluer la virulence des isolats sur la pomme de terre ainsi que leur capacité à produire des trichothécènes. Nous avons choisi F. sambucinum souche T5 comme un modèle pour cette étude parce qu’il était le plus agressif sur la pomme de terre en serre en induisant un flétrissement rapide, un jaunissement suivi de la mort des plantes. Cette souche produit le 4,15-diacétoxyscirpénol (4,15-DAS) lorsqu’elle est cultivée en milieu liquide. Nous avons amplifié et caractérisé cinq gènes de biosynthèse trichothécènes (TRI5, TRI4, TRI3, TRI11, et TRI101) impliqués dans la production du 4,15-DAS. La comparaison des séquences avec les bases de données a montré 98% et 97% d'identité de séquence avec les gènes de la biosynthèse des trichothécènes chez F. sporotrichioides et Gibberella zeae, respectivement. Nous avons confrenté F. sambucinum avec le champignon mycorhizien à arbuscule Glomus irregulare en culture in vitro. Les racines de carotte et F. sambucinum seul, ont été utilisés comme témoins. Nous avons observé que la croissance de F. sambucinum a été significativement réduite avec la présence de G. irregulare par rapport aux témoins. Nous avons remarqué que l'inhibition de la croissance F. sambucinum a été associée avec des changements morphologiques, qui ont été observés lorsque les hyphes de G. irregulare ont atteint le mycélium de F. sambucinum. Ceci suggère que G. irregulare pourrait produire des composés qui inhibent la croissance de F. sambucinum. Nous avons étudié les patrons d’expression des gènes de biosynthèse de trichothécènes de F. sambucinum en présence ou non de G. irregulare, en utilisant le PCR en temps-réel. Nous avons observé que TRI5 et TRI6 étaient sur-exprimés, tandis que TRI4, TRI13 et TRI101 étaient en sous-exprimés en présence de G. irregulare. Des analyses par chromatographie en phase-gazeuse (GC-MS) montrent clairement que la présence de G. irregulare réduit significativement la production des trichothécènes par F. sambucinum. Le dosage du 4,15-DAS a été réduit à 39 μg/ml milieu GYEP par G. irregulare, comparativement à 144 μg/ml milieu GYEP quand F. sambucinum est cultivé sans G. irregulare. Nous avons testé la capacité de G. irregulare à induire la défense des plants de pomme de terre contre l'infection de F. sambucinum. Des essais en chambre de croissance montrent que G. irregulare réduit significativement l’incidence de la maladie causée par F. sambucinum. Nous avons aussi observé que G. irregulare augmente la biomasse des racines, des feuilles et des tubercules. En utilisant le PCR en temps-réel, nous avons étudié les niveaux d’expression des gènes impliqué dans la défense des plants de pommes de terre tels que : chitinase class II (ChtA3), 1,3-β-glucanase (Glub), peroxidase (CEVI16), osmotin-like protéin (OSM-8e) et pathogenèses-related protein (PR-1). Nous avons observé que G. irregulare a induit une sur-expression de tous ces gènes dans les racines après 72 heures de l'infection avec F. sambucinum. Nous avons également trové que la baisse provoquée par F. sambucinum des gènes Glub et CEVI16 dans les feuilles pourrait etre bloquée par le traitement AMF. Ceci montre que l’inoculation avec G. irregulare constitut un bio-inducteur systémique même dans les parties non infectées par F. sambucinum. En conclusion, cette étude apporte de nouvelles connaissances importantes sur les interactions entre les plants et les microbes, d’une part sur les effets directs des champignons mycorhiziens sur l’inhibition de la croissance et la diminution de la production des mycotoxines chez Fusarium et d’autre part, l’atténuation de la sévérité de la maladie dans des plantes par stimulation leur défense. Les données présentées ouvrent de nouvelles perspectives de bio-contrôle contre les pathogènes mycotoxinogènes des plantes.

Étude pilote des effets du Tandem Forsus Maxillary Corrector sur la croissance des maxillaires

Objectif : Récemment, un nouvel appareil issu de la technologie du Forsus™ et visant à corriger les malocclusions de classe III a été mis sur le marché et se popularise dans la pratique orthodontique : le Tandem Forsus Maxillary Corrector (TFMC). L’objectif de la présente étude est de mesurer les effets squelettiques, l’influence réelle sur la croissance, et les effets dento-alvéolaires du port du TFMC. Matériel et méthodes : 14 patients présentant une malocclusion de classe III (âge moyen de 9 ans 6 mois) traités par le même orthodontiste ont participé à cette étude prospective. Le groupe consiste en 10 garçons et 4 filles. Le Tandem Forsus Maxillary Corrector est porté de 12 à 14 heures par jour jusqu’à l’obtention d’une surcorrection du surplomb horizontal et une relation dentaire de classe I. Le traitement est généralement d’une durée de 8 à 9 mois. Des radiographies céphalométriques latérales prises avant (T1) et après (T2) le traitement ont été analysées afin de déterminer les changements dentaires et squelettiques. Les résultats ont été comparés à un groupe contrôle composé de 42 enfants provenant du Centre de croissance de l’Université de Montréal. Les radiographies ont été tracées et analysées de manière aveugle à l’aide du logiciel Dolphin Imaging (ver 11.0, Patterson Dental, Chatsworth, California). L’erreur sur la méthode a été évaluée avec la formule de Dahlberg, le coefficient de corrélation intra-classe et l’indice de Bland-Altman. L’effet du traitement a été évalué à l’aide du test t pour échantillons appariés. L’effet de la croissance pour le groupe contrôle a été calculé à l’aide d’un test t pour échantillons indépendants. Résultats : L’utilisation du TFMC produit un mouvement antérieur et une rotation antihoraire du maxillaire. De plus, il procline les incisives supérieures et rétrocline les incisives inférieures. Une rotation antihoraire du plan occlusal contribue aussi à la correction de la malocclusion de classe III. Par contre, le TFMC ne semble pas avoir pour effet de restreindre la croissance mandibulaire. Conclusion : La présente étude tend à démontrer que le port de l’appareil TFMC a un effet orthopédique et dento-alvéolaire significatif lors du traitement correctif des malocclusions modérées de classe III.

Implication des protéines WHIRLY dans la biogénèse du chloroplaste en association avec la protéine SIG6

Le mode vie autotrophique des plantes repose entièrement sur l’intégrité du chloroplaste et notamment l’étape de la biogénèse. La transcription des gènes chloroplastiques, assurée par une PEP (ARN polymérase encodée par le chloroplaste) et deux NEPs (ARN polymérase encodée par le noyau), est l’une des étapes primordiales dans le développement d’un chloroplaste photosynthétique. On distingue trois classes de gènes chloroplastiques : les gènes de classe I, transcrit par la PEP exclusivement; les gènes de classe II, transcrits par la PEP ou les NEPs; et les gènes de classe III, transcrits exclusivement par les NEPs. Pour assurer sa fonction, la PEP doit être associée à des facteurs sigmas. L’un de ceux-ci, la protéine SIG6, est un facteur sigma général et, associé à la PEP, assure la transcription de l’ensemble des gènes de classe I et II lors du développement du chloroplaste photosynthétique. Ainsi, le mutant sig6 présente un phénotype de cotylédons pâles, associé à un retard de biogénèse chloroplastique, ainsi qu’une diminution de la transcription des gènes de classe I, provoquant la diminution de la quantité de protéines de classe I. Dans le laboratoire, nous étudions les deux protéines WHIRLY chloroplastiques (WHY1 et WHY3) pour leur rôle dans le maintien de la stabilité génomique chloroplastique. Toutefois, peu de choses sont encore connues sur leur rôle potentiel dans la transcription ou la biogénèse chloroplastique. Par exemple, lorsque l’on tente de purifier la PEP, on obtient un gros complexe transcriptionnel nommé PTAC (Plastid Transcriptionally Active Chromosome) dans lequel sont retrouvées les deux protéines WHIRLY, suggérant qu’elles pourraient être impliquées dans la transcription chloroplastique. De plus, un possible rôle dans la biogénèse chloroplastique leur a été prêté, notamment chez le maïs. Dans cette étude, nous avons donc cherché à vérifier l’implication des protéines WHIRLY dans la biogénèse chloroplastique par une approche génétique de croisements entre les mutants sig6 et why1why3. Pour cela, nous avons isolé des doubles mutants sig6why1 et sig6why3, ainsi qu’un triple mutant sig6why1why3. À l’aide d’une caractérisation phénotypique et de la quantification de quelques protéines chloroplastiques, nous avons remarqué que la perte d’un des WHIRLY permet de complémenter le phénotype de cotylédons pâles du mutant sig6 et favorise l’expression normale de protéines en principe sous-exprimées dans le mutant sig6. Toutefois, la perte des deux WHIRLY ne permet pas de compenser le phénotype de cotylédons pâles et provoque l’apparition d’un phénotype persistant associé à une expression anormale des protéines chloroplastiques. Ces résultats ne peuvent être expliqués par le rôle des WHIRLY dans le maintien de la stabilité génomique chloroplastique étant donné que le triple mutant sig6why1why3 présente moins de réarrangements que le double mutant why1why3. Finalement, nous montrons que les effets de la perte d’un WHIRLY sur le mutant sig6 peuvent être mimés par l’utilisation de la rifampicine, une drogue inhibant l’ARN polymérase chloroplastique de type bactérienne (PEP). Ensemble, ces résultats démontrent donc l’implication des protéines WHIRLY chloroplastiques dans la biogénèse chloroplastique en association avec la protéine SIG6. Nous proposons un modèle selon lequel les deux protéines WHIRLY permettraient de favoriser l’activité de l’ARN polymérase de type bactérienne, notamment lors du développement du chloroplaste photosynthétique. En cas d’absence d’une des deux protéines, cette diminution partielle d’activité de la PEP favoriserait la mise en place d’un mécanisme de complémentation par le NEPs, permettant finalement de rétablir la biogénèse chloroplastique dans un mutant sig6. En l’absence des deux WHIRLY, le mécanisme de complémentation par les NEPs serait incapable de compenser la forte inhibition de la PEP, se traduisant par une aggravation du retard de développement du chloroplaste dans le mutant sig6.

Antigen and superantigen presentation as defined by the MHCII-accessory proteins and associated-peptides

MHCII molecules expose a weave of antigens, which send survival or activation signals to T lymphocytes. The ongoing process of peptide binding to the MHC class II groove implicates three accessory molecules: the invariant chain, DM and DO. The invariant chain folds and directs the MHCII molecules to the endosomal pathway. Then, DM exchanges the CLIP peptide, which is a remnant of the degraded invariant chain, for peptides of better affinity. Expressed in highly specialized antigen presenting cells, DO competes with MHCII molecules for DM binding and favors the presentation of receptor-internalized antigens. Altogether, these molecules exhibit potential immunomodulatory properties that can be exploited to increase the potency of peptide vaccines. DO requires DM for maturation and to exit the ER. Interestingly, it is possible to monitor this interaction through a conformation change on DOβ that is recognized by the Mags.DO5 monoclonal antibody. Using Mags.DO5, we showed that DM stabilizes the interactions between the DO α1 and β1 chains and that DM influences DO folding in the ER. Thus, the Mags.DO5+ conformation correlates with DO egress from the ER. To further evaluate this conformation change, directed evolution was applied to DO. Of the 41 unique mutants obtained, 25% were localized at the DM-DO binding interface and 12% are at the solvent-exposed β1 domain, which is thought to be the Mags.DO5 epitope. In addition, I used the library to test the ability of HLA-DO to inhibit HLA-DM and sorted for the amount of CLIP. Interestingly, most of the mutants showed a decrease inhibitory effect, supporting the notion that the intrinsic instability of DO is a required for its function. Finally, these results support the model in which DO competes against classical MHCII molecules by sequestering DM chaperone’s function. MHCII molecules are also characterized by their ability to present superantigens, a group of bacterial or viral toxins that coerces MHCII-TCR binding in a less promiscuous fashion than what is observed in a canonical setting. While the mechanism of how bacterial superantigens form trimeric complexes with TCR and MHCII is well understood, the mouse mammary tumor virus superantigens (vSAG) are poorly defined. In the absence of a crystal structure, I chose a functional approach to examine the relation between vSAG, MHCII and TCR with the goal of uncovering the overall trimolecular architecture. I showed that TCR concomitantly binds both the MHCII α chain and the vSAG and that TCR-MHCII docking is almost canonical when coerced by vSAGs. Because many peptides may be tolerated in the MHCII groove, the pressure exerted by vSAG seems to tweak conventional TCR-MHCII interactions. Furthermore, my results demonstrate that vSAG binding to MHCII molecules is conformation-dependent and abrogated by the CLIP amino-terminal residues extending outside the peptide-binding groove. In addition, they also suggest that vSAGs cross-link adjacent MHCIIs and activate T cells via a TGXY motif.

Simulation and Design of a high speed Solid State Switch for Excimer Laser

Excimerlaser sind gepulste Gaslaser, die Laseremission in Form von Linienstrahlung – abhängig von der Gasmischung – im UV erzeugen. Der erste entladungsgepumpte Excimerlaser wurde 1977 von Ischenko demonstriert. Alle kommerziell verfügbaren Excimerlaser sind entladungsgepumpte Systeme. Um eine Inversion der Besetzungsdichte zu erhalten, die notwendig ist, um den Laser zum Anschwingen zu bekommen, muss aufgrund der kurzen Wellenlänge sehr stark gepumpt werden. Diese Pumpleistung muss von einem Impulsleistungsmodul erzeugt werden. Als Schaltelement gebräuchlich sind Thyratrons, Niederdruckschaltröhren, deren Lebensdauer jedoch sehr limitiert ist. Deshalb haben sich seit Mitte der 1990iger Jahre Halbleiterschalter mit Pulskompressionsstufen auch in dieser Anwendung mehr und mehr durchgesetzt. In dieser Arbeit wird versucht, die Pulskompression durch einen direkt schaltenden Halbleiterstapel zu ersetzen und dadurch die Verluste zu reduzieren sowie den Aufwand für diese Pulskompression einzusparen. Zudem kann auch die maximal mögliche Repetitionsrate erhöht werden. Um die Belastung der Bauelemente zu berechnen, wurden für alle Komponenten möglichst einfache, aber leistungsfähige Modelle entwickelt. Da die normalerweise verfügbaren Daten der Bauelemente sich aber auf andere Applikationen beziehen, mussten für alle Bauteile grundlegende Messungen im Zeitbereich der späteren Applikation gemacht werden. Für die nichtlinearen Induktivitäten wurde ein einfaches Testverfahren entwickelt um die Verluste bei sehr hohen Magnetisierungsgeschwindigkeiten zu bestimmen. Diese Messungen sind die Grundlagen für das Modell, das im Wesentlichen eine stromabhängige Induktivität beschreibt. Dieses Modell wurde für den „magnetic assist“ benützt, der die Einschaltverluste in den Halbleitern reduziert. Die Impulskondensatoren wurden ebenfalls mit einem in der Arbeit entwickelten Verfahren nahe den späteren Einsatzparametern vermessen. Dabei zeigte sich, dass die sehr gebräuchlichen Class II Keramikkondensatoren für diese Anwendung nicht geeignet sind. In der Arbeit wurden deshalb Class I Hochspannungs- Vielschicht- Kondensatoren als Speicherbank verwendet, die ein deutlich besseres Verhalten zeigen. Die eingesetzten Halbleiterelemente wurden ebenfalls in einem Testverfahren nahe den späteren Einsatzparametern vermessen. Dabei zeigte sich, dass nur moderne Leistungs-MOSFET´s für diesen Einsatz geeignet sind. Bei den Dioden ergab sich, dass nur Siliziumkarbid (SiC) Schottky Dioden für die Applikation einsetzbar sind. Für die Anwendung sind prinzipiell verschiedene Topologien möglich. Bei näherer Betrachtung zeigt sich jedoch, dass nur die C-C Transfer Anordnung die gewünschten Ergebnisse liefern kann. Diese Topologie wurde realisiert. Sie besteht im Wesentlichen aus einer Speicherbank, die vom Netzteil aufgeladen wird. Aus dieser wird dann die Energie in den Laserkopf über den Schalter transferiert. Aufgrund der hohen Spannungen und Ströme müssen 24 Schaltelemente in Serie und je 4 parallel geschaltet werden. Die Ansteuerung der Schalter wird über hochisolierende „Gate“-Transformatoren erreicht. Es zeigte sich, dass eine sorgfältig ausgelegte dynamische und statische Spannungsteilung für einen sicheren Betrieb notwendig ist. In der Arbeit konnte ein Betrieb mit realer Laserkammer als Last bis 6 kHz realisiert werden, der nur durch die maximal mögliche Repetitionsrate der Laserkammer begrenzt war.

Development of designed site-directed pseudopeptide-peptido-mimetic immunogens as novel minimal subunit-vaccine candidates for malaria

Synthetic vaccines constitute the most promising tools for controlling and preventing infectious diseases. When synthetic immunogens are designed from the pathogen native sequences, these are normally poorly immunogenic and do not induce protection, as demonstrated in our research. After attempting many synthetic strategies for improving the immunogenicity properties of these sequences, the approach consisting of identifying high binding motifs present in those, and then performing specific changes on amino-acids belonging to such motifs, has proven to be a workable strategy. In addition, other strategies consisting of chemically introducing non-natural constraints to the backbone topology of the molecule and modifying the a-carbon asymmetry are becoming valuable tools to be considered in this pursuit. Non-natural structural constraints to the peptide backbone can be achieved by introducing peptide bond isosters such as reduced amides, partially retro or retro-inverso modifications or even including urea motifs. The second can be obtained by strategically replacing L-amino-acids with their enantiomeric forms for obtaining both structurally site-directed designed immunogens as potential vaccine candidates and their Ig structural molecular images, both having immunotherapeutic effects for preventing and controlling malaria.

3D Analysis of the TCR/pMHCII Complex Formation in Monkeys Vaccinated with the First Peptide Inducing Sterilizing Immunity against Human Malaria

T-cell receptor gene rearrangements were studied in Aotus monkeys developing high antibody titers and sterilizing immunity against the Plasmodium falciparum malaria parasite upon vaccination with the modified synthetic peptide 24112, which was identified in the Merozoite Surface Protein 2 (MSP-2) and is known to bind to HLA-DR beta 1*0403 molecules with high capacity. Spectratyping analysis showed a preferential usage of V beta 12 and V beta 6 TCR gene families in 67% of HLA-DR beta 1*0403-like genotyped monkeys. Docking of peptide 24112 into the HLA-DR beta 1*0401-HA peptide-HA1.7TCR complex containing the VDJ rearrangements identified in fully protected monkeys showed a different structural signature compared to nonprotected monkeys. These striking results show the exquisite specificity of the TCR/pMHCII complex formation needed for inducing sterilizing immunity and provide important hints for a logical and rational methodology to develop multiepitopic, minimal subunit-based synthetic vaccines against infectious diseases, among them malaria.

Prevalencia de enfermedad celiaca en Latinoamérica: revisión sistemática de la literatura y meta-análisis

Introducción: La enfermedad celiaca (EC) es una enfermedad autoinmune (EA) intestinal desencadenada por la ingesta de gluten. Por la falta de información de la presencia de EC en Latinoamérica (LA), nosotros investigamos la prevalencia de la enfermedad en esta región utilizando una revisión sistemática de la literatura y un meta-análisis. Métodos y resultados: Este trabajo fue realizado en dos fases: La primera, fue un estudio de corte transversal de 300 individuos Colombianos. La segunda, fue una revisión sistemática y una meta-regresión siguiendo las guías PRSIMA. Nuestros resultados ponen de manifiesto una falta de anti-transglutaminasa tisular (tTG) e IgA anti-endomisio (EMA) en la población Colombiana. En la revisión sistemática, 72 artículos cumplían con los criterios de selección, la prevalencia estimada de EC en LA fue de 0,46% a 0,64%, mientras que la prevalencia en familiares de primer grado fue de 5,5 a 5,6%, y en los pacientes con diabetes mellitus tipo 1 fue de 4,6% a 8,7% Conclusión: Nuestro estudio muestra que la prevalencia de EC en pacientes sanos de LA es similar a la notificada en la población europea.

Enfermedad tiroidea autoinmune en pacientes colombianos con lupus eritematoso sistémico

Objetivos: Determinar la prevalencia y los factores asociados con el desarrollo de hipotiroidismo autoinmune (HA) en una cohorte de pacientes con lupus eritematoso sistémico (LES), y analizar la información actual en cuanto a la prevalencia e impacto de la enfermedad tiroidea autoinmune y la autoinmunidad tiroidea en pacientes con LES. Métodos: Este fue un estudio realizado en dos pasos. Primero, un total de 376 pacientes con LES fueron evaluados sistemáticamente por la presencia de: 1) HA confirmado, 2) positividad para anticuerpos tiroperoxidasa/tiroglobulina (TPOAb/TgAb) sin hipotiroidismo, 3) hipotiroidismo no autoinmune, y 4) pacientes con LES sin hipotiroidismo ni positividad para TPOAb/TgAb. Se construyeron modelos multivariados y árboles de regresión y clasificación para analizar los datos. Segundo, la información actual fue evaluada a través de una revisión sistemática de la literatura (RLS). Se siguieron las guías PRISMA para la búsqueda en las bases de datos PubMed, Scopus, SciELO y Librería Virtual en Salud. Resultados: En nuestra cohorte, la prevalencia de HA confirmado fue de 12% (Grupo 1). Sin embargo, la frecuencia de positividad para TPOAb y TgAb fue de 21% y 10%, respectivamente (Grupo 2). Los pacientes con LES sin HA, hipotiroidismo no autoinmune ni positividad para TPOAb/TgAb constituyeron el 40% de la corhorte. Los pacientes con HA confirmada fueron estadísticamente significativo de mayor edad y tuvieron un inicio tardío de la enfermedad. El tabaquismo (ORA 6.93, IC 95% 1.98-28.54, p= 0.004), la presencia de Síndrome de Sjögren (SS) (ORA 23.2, IC 95% 1.89-359.53, p= 0.015) y la positividad para anticuerpos anti-péptido cíclico citrulinado (anti-CCP) (ORA 10.35, IC 95% 1.04-121.26, p= 0.047) se asociaron con la coexistencia de LES-HA, ajustado por género y duración de la enfermedad. El tabaquismo y el SS fueron confirmados como factores predictivos para LES-HA (AUC del modelo CART = 0.72). En la RSL, la prevalencia de ETA en LES varío entre 1% al 60%. Los factores asociados con esta poliautoinmunidad fueron el género femenino, edad avanzada, tabaquismo, positividad para algunos anticuerpos, SS y el compromiso articular y cutáneo. Conclusiones: La ETA es frecuente en pacientes con LES, y no afecta la severidad del LES. Los factores de riesgo identificados ayudarán a los clínicos en la búsqueda de ETA. Nuestros resultados deben estimular políticas para la suspensión del tabaquismo en pacientes con LES.