BCR and TLR signalling pathways are recurrently targeted by genetic changes in splenic marginal zone lymphomas.

The genetics and pathogenesis of splenic marginal zone lymphoma are poorly understood. The lymphoma lacks chromosome translocation, and ~30% of cases are featured by 7q deletion, but the gene targeted by the deletion is unknown. A recent study showed inactivation of A20, a 'global' NF-kB negative regulator, in 1 of 12 splenic marginal zone lymphoma. To investigate further whether deregulation of the NF-kB pathway plays a role in the pathogenesis of splenic marginal zone lymphoma, we screened several NF-kB regulators for genetic changes by PCR and sequencing. Somatic mutations were found in A20 (6/46=13%), MYD88 (6/46=13%), CARD11 (3/34=8.8%), but not in CD79A, CD79B and ABIN1. Interestingly, these genetic changes are largely mutually exclusive from each other and MYD88 mutation was also mutually exclusive from 7q deletion. These results strongly suggest that deregulation of the TLR (toll like receptor) and BCR (B-cell receptor) signalling pathway may play an important role in the pathogenesis of splenic marginal zone lymphoma.

Mitochondrial reactive oxygen species generation triggers inflammatory response and tissue injury associated with hepatic ischemia-reperfusion: Therapeutic potential of mitochondrially targeted antioxidants.

Mitochondrial reactive oxygen species generation has been implicated in the pathophysiology of ischemia-reperfusion (I/R) injury; however, its exact role and its spatial-temporal relationship with inflammation are elusive. Herein we explore the spatial-temporal relationship of oxidative/nitrative stress and inflammatory response during the course of hepatic I/R and the possible therapeutic potential of mitochondrial-targeted antioxidants, using a mouse model of segmental hepatic ischemia-reperfusion injury. Hepatic I/R was characterized by early (at 2h of reperfusion) mitochondrial injury, decreased complex I activity, increased oxidant generation in the liver or liver mitochondria, and profound hepatocellular injury/dysfunction with acute proinflammatory response (TNF-α, MIP-1α/CCL3, MIP-2/CXCL2) without inflammatory cell infiltration, followed by marked neutrophil infiltration and a more pronounced secondary wave of oxidative/nitrative stress in the liver (starting from 6h of reperfusion and peaking at 24h). Mitochondrially targeted antioxidants, MitoQ or Mito-CP, dose-dependently attenuated I/R-induced liver dysfunction, the early and delayed oxidative and nitrative stress response (HNE/carbonyl adducts, malondialdehyde, 8-OHdG, and 3-nitrotyrosine formation), and mitochondrial and histopathological injury/dysfunction, as well as delayed inflammatory cell infiltration and cell death. Mitochondrially generated oxidants play a central role in triggering the deleterious cascade of events associated with hepatic I/R, which may be targeted by novel antioxidants for therapeutic advantage.

Cell therapies for tendons: old cell choice for modern innovation.

Although tissue engineering and cell therapies are becoming realistic approaches for medical therapeutics, it is likely that musculoskeletal applications will be among the first to benefit on a large scale. Cell sources for tissue engineering and cell therapies for tendon pathologies are reviewed with an emphasis on small defect tendon injuries as seen in the hand which could adapt well to injectable cell administration. Specifically, cell sources including tenocytes, tendon sheath fibroblasts, bone marrow or adipose-derived stem cells, amniotic cells, placenta cells and platelet-derivatives have been proposed to enhance tendon regeneration. The associated advantages and disadvantages for these different strategies will be discussed and evolving regulatory requirements for cellular therapies will also be addressed. Human progenitor tenocytes, along with their clinical cell banking potential, will be presented as an alternative cell source solution. Similar cell banking techniques have already been described with other progenitor cell types in the 1950's for vaccine production, and these "old" cell types incite potentially interesting therapeutic options that could be improved with modern innovation for tendon regeneration and repair.

Subgroup-specific structural variation across 1,000 medulloblastoma genomes.

Medulloblastoma, the most common malignant paediatric brain tumour, is currently treated with nonspecific cytotoxic therapies including surgery, whole-brain radiation, and aggressive chemotherapy. As medulloblastoma exhibits marked intertumoural heterogeneity, with at least four distinct molecular variants, previous attempts to identify targets for therapy have been underpowered because of small samples sizes. Here we report somatic copy number aberrations (SCNAs) in 1,087 unique medulloblastomas. SCNAs are common in medulloblastoma, and are predominantly subgroup-enriched. The most common region of focal copy number gain is a tandem duplication of SNCAIP, a gene associated with Parkinson's disease, which is exquisitely restricted to Group 4α. Recurrent translocations of PVT1, including PVT1-MYC and PVT1-NDRG1, that arise through chromothripsis are restricted to Group 3. Numerous targetable SCNAs, including recurrent events targeting TGF-β signalling in Group 3, and NF-κB signalling in Group 4, suggest future avenues for rational, targeted therapy.

3B.01: Performance of targeted screening for the identification of hypertension in children

OBJECTIVE: As universal screening of hypertension performs poorly in childhood, targeted screening to children at higher risk of hypertension has been proposed. Our goal was to assess the performance of combined parental history of hypertension and overweight/obesity to identify children with hypertension. We estimated the sensitivity, specificity, negative and positive predictive values of overweight/obesity and parental history of hypertension for the identification of hypertension in children. DESIGN AND METHOD: We analyzed data from a school-based cross-sectional study including 5207 children aged 10 to 14 years from all public 6th grade classes in the canton of Vaud, Switzerland. Blood pressure was measured with a clinically validated oscillometric automated device over up to three visits separated by one week. Children had hypertension if they had sustained elevated blood pressure over the three visits. Parents were interviewed about their history of hypertension. RESULTS: The prevalence of hypertension was 2.2%. 14% of children were overweight or obese and 20% had a positive history of hypertension in either or both parents. 30% of children had either or both conditions. After accounting for several potential confounding factors, parental history of hypertension (odds ratio (OR): 2.6; 95% confidence interval (CI): 1.8-4.0), overweight excluding obesity (OR: 2.5; 95% CI: 1.5-4.2) and obesity (OR: 10.1; 95% CI: 6.0-17.0) were associated with hypertension in children. Considered in isolation, the sensitivity and positive predictive values of parental history of hypertension (respectively 41% and 5%) or overweight/obesity (respectively 43% and 7%) were relatively low. Nevertheless, considered together, the sensitivity of targeted screening in children with either overweight/obesity or paternal history of hypertension was higher (65%) but the positive predictive value remained low (5%). The negative predictive value was systematically high. CONCLUSIONS: Restricting screening of hypertension to children with either overweight/obesity or with hypertensive parents would substantially limit the proportion of children to screen (30%) and allow the identification of a relatively large proportion (65%) of hypertensive cases. That could be a valuable alternative to universal screening.

Death for life : a study of targeted killing by States in international law

"Mémoire présenté à la faculté des études supérieures en vue de l'obtention du grade de Maîtrise en droit (LL.M.)". Ce mémoire a été accepté à l'unanimité et classé parmi les 10% des mémoires de la discipline.

Polymeric micelles as versatile carriers for drugs and nucleic acids

Le cancer est la principale cause de mortalité au Canada. Les taxanes (e.g. le paclitaxel et le docétaxel (DCTX)) constituent des remèdes efficaces contre une série de tumeurs solides telles que les cancers du sein, du poumon et de l’ovaire. Par ailleurs, des acides nucléiques (e.g. les oligonucléotides antisens (AON) ou les petits ARN interférents (siRNAs)), capables de supprimer sélectivement certains oncogènes impliqués dans la carcinogénèse, sont actuellement étudiés pour traiter une large gamme de cancers. Bien que l’activité des taxanes et des acides nucléiques soit bien établie sur des modèles humains et/ou animaux, plusieurs aspects physico-chimiques et cliniques restent encore à améliorer. Leur solubilité limitée (pour les taxanes), leur dégradation rapide dans le sang (pour les acides nucléiques), leur élimination précoce, leur absence de sélectivité et leur toxicité envers les tissus sains sont les principaux facteurs limitant leur efficacité. C’est pourquoi de nombreux efforts ont porté sur l’élaboration de systèmes de vectorisation ciblés à base de polymères, dans le but de surmonter les problèmes associés aux thérapies actuelles. Dans cette thèse, deux types de micelles polymères ont été développés pour la vectorisation de DCTX et d’acides nucléiques. D’une part, des micelles de poly(oxyde d’éthylène)-bloc-poly(oxyde de butylène/styrène) ont été étudiées pour la première fois pour solubiliser le DCTX et le protéger de l’hydrolyse. Ces polymères se sont révélés moins toxiques que le surfactant utilisé commercialement pour solubiliser le DCTX (i.e. polysorbate 80) et ont permis une libération prolongée du principe actif. D’autre part, deux systèmes différents de micelles polyioniques (PICM) ont été mis au point pour la vectorisation d’acides nucléiques. De nouveaux conjugués de poly(éthylène glycol) (PEG)-oligonucléotide ont été proposés pour la protection et la libération contrôlée d’AON. Lorsque ces conjugués ont été formulés avec des dendrimères de poly(amidoamine) (PAMAM), des complexes de taille homogène ont été obtenus. Ces PICM ont permis de prolonger la libération de l’AON et de le protéger efficacement contre la dégradation enzymatique. De plus, des polymères de poly(oxyde d’éthylène)-bloc-poly(méthacrylate de propyle-co-acide méthacrylique) ont été incorporés afin de conférer des propriétés acido-sensibles aux PICM. Dans ces micelles, formées de ce dernier polymère formulé avec le dendrimère PAMAM, des oligonucléotides (AON et siRNA) ciblant l’oncogène Bcl-2 ont été encapsulés. L’internalisation cellulaire fut assurée par un fragment d’anticorps monoclonal (Fab’) situé à l’extrémité de la couronne de PEG. Après l’internalisation cellulaire et la protonation des unités d’acide méthacrylique sous l’effet de l’acidification des endosomes, les micelles se sont affranchies de leur couronne. Elles ont ainsi exposé leur cœur composé d’acide nucléique et de dendrimère PAMAM, qui possède une charge positive et des propriétés endosomolytiques. En effet, ces PICM acido-sensibles ciblées ont permis d’augmenter la biodisponibilité des acides nucléiques vectorisés et se sont avérées plus efficaces pour silencer l’oncoprotéine Bcl-2 que les micelles non ciblées ou que le dendrimère de PAMAM commercial seul. Finalement, les nanovecteurs polymères présentés dans cette thèse se révèlent être des systèmes prometteurs pour la vectorisation des anticancéreux et des acides nucléiques.

Immuno-oncology of human prostate cancer : phenotypical characterization and study of the tumor-derived, androgen-regulated immunosuppressive microenvironment

Le cancer de la prostate est le cancer le plus fréquemment diagnostiqué chez les hommes canadiens et la troisième cause de décès relié au cancer. Lorsque diagnostiqué à un stade précoce de la maladie, le cancer de la prostate est traité de manière curative par chirurgie et radiothérapie. Par contre, les thérapies actuelles ne peuvent éradiquer la maladie lorsqu’elle progresse à des stades avancés. Ces thérapies, comme la chimiothérapie et l’hormonothérapie, demeurent donc palliatives. Il est primordial d’optimiser de nouvelles thérapies visant l’élimination des cellules cancéreuses chez les patients atteints des stades avancés de la maladie. Une de ces nouvelles options thérapeutiques est l’immunothérapie. L’immunothérapie du cancer a fait des progrès considérables durant les dernières années. Cependant, les avancements encourageants obtenus lors d’essais précliniques ne se sont pas encore traduits en des résultats cliniques significatifs. En ce qui concerne le cancer de la prostate, les résultats négligeables suivants des interventions immunothérapeutiques peuvent être causés par le fait que la plupart des études sur le microenvironnement immunologique furent effectuées chez des modèles animaux. De plus la majorité des études sur l’immunologie tumorale humaine furent effectuées chez des patients atteints d’autres cancers, tels que le mélanome, et non chez les patients atteints du cancer de la prostate. Donc, le but central de cette thèse de doctorat est d’étudier le microenvironnement immunologique chez les patients atteints du cancer de la prostate afin de mieux définir les impacts de la tumeur sur le développement de la réponse immunitaire antitumorale. Pour réaliser ce projet, nous avons établi deux principaux objectifs de travail : (i) la caractérisation précise des populations des cellules immunitaires infiltrant la tumeur primaire et les ganglions métastatiques chez les patients atteints du cancer de la prostate; (ii) l’identification et l’étude des mécanismes immunosuppressifs exprimés par les cellules cancéreuses de la prostate. Les résultats présentés dans cette thèse démontrent que la progression du cancer de la prostate est associée au développement d’un microenvironnement immunosuppressif qui, en partie, est régulé par la présence des androgènes. L’étude initiale avait comme but la caractérisation du microenvironnement immunologique des ganglions drainant la tumeur chez des patients du cancer de la prostate. Les résultats présentés dans le chapitre III nous a permis de démontrer que les ganglions métastatiques comportent des signes cellulaires et histopathologiques associés à une faible réactivité immunologique. Cette immunosuppression ganglionnaire semble dépendre de la présence des cellules métastatiques puisque des différences immunologiques notables existent entre les ganglions non-métastatiques et métastatiques chez un même patient. La progression du cancer de la prostate semble donc associée au développement d’une immunosuppression affectant les ganglions drainant la tumeur primaire. Par la suite, nous nous sommes intéressés à l’impact de la thérapie par déplétion des androgènes (TDA) sur le microenvironnement immunologique de la tumeur primaire. La TDA est associée à une augmentation marquée de l’inflammation prostatique. De plus, les protocoles d’immunothérapies pour le cancer de la prostate actuellement évalués en phase clinique sont dirigés aux patients hormonoréfractaires ayant subi et échoué la thérapie. Cependant, peu d’information existe sur la nature de l’infiltrat de cellules immunes chez les patients castrés. Il est donc essentiel de connaître la nature de cet infiltrat afin de savoir si celui-ci peut répondre de manière favorable à une intervention immunothérapeutique. Dans le chapitre IV, je présente les résultats sur l’abondance des cellules immunes infiltrant la tumeur primaire suivant la TDA. Chez les patients castrés, les densités de lymphocytes T CD3+ et CD8+ ainsi que des macrophages CD68+ sont plus importantes que chez les patients contrôles. Nous avons également observé une corrélation entre la densité de cellules NK et une diminution du risque de progression de la maladie (rechute biochimique). Inversement, une forte infiltration de macrophages est associée à un plus haut risque de progression. Conjointement, durant cette étude, nous avons développé une nouvelle approche informatisée permettant la standardisation de la quantification de l’infiltrat de cellules immunes dans les échantillons pathologiques. Cette approche facilitera la comparaison d’études indépendantes sur la densité de l’infiltrat immun. Ces résultats nous ont donc permis de confirmer que les effets pro-inflammatoires de la TDA chez les patients du cancer de la prostate ciblaient spécifiquement les lymphocytes T et les macrophages. L’hypothèse intéressante découlant de cette étude est que les androgènes pourraient réguler l’expression de mécanismes immunosuppressifs dans la tumeur primaire. Dans le chapitre V, nous avons donc étudié l’expression de mécanismes immunosuppressifs par les cellules cancéreuses du cancer de la prostate ainsi que leur régulation par les androgènes. Notre analyse démontre que les androgènes augmentent l’expression de molécules à propriétés immunosuppressives telles que l’arginase I et l’arginase II. Cette surexpression dépend de l’activité du récepteur aux androgènes. Chez les patients castrés, l’expression de l’arginase II était diminuée suggérant une régulation androgénique in vivo. Nous avons observé que l’arginase I et l’arginase II participent à la prolifération des cellules du cancer de la prostate ainsi qu’à leur potentiel immunosuppressif. Finalement, nous avons découvert que l’expression de l’interleukin-8 était aussi régulée par les androgènes. De plus, l’interleukin-8, indépendamment des androgènes, augmente l’expression de l’arginase II. Ces résultats confirment que les androgènes participent au développement d’une microenvironnement immunosuppressif dans le cancer de la prostate en régulant l’expression de l’arginase I, l’arginase II et l’interleukin-8. En conclusion, les résultats présentés dans cette thèse témoignent du caractère unique du microenvironnement immunologique chez les patients atteints du cancer de la prostate. Nos travaux ont également permis d’établir de nouvelles techniques basées sur des logiciels d’analyse d’image afin de mieux comprendre le dialogue entre la tumeur et le système immunitaire chez les patients. Approfondir les connaissances sur les mécanismes de régulation du microenvironnement immunologique chez les patients atteint du cancer de la prostate permettra d’optimiser des immunothérapies mieux adaptées à éradiquer cette maladie.

Development of cellular and gene therapies for b[beta]-Thalassemia and sickle cell disease

Thèse numérisée par la Division de la gestion de documents et des archives de l'Université de Montréal.

Identification de nouveaux substrats des kinases Erk1/2 par une approche bio-informatique, pharmacologique et phosphoprotéomique

La phosphorylation est une modification post-traductionnelle omniprésente des protéines Cette modification est ajoutée et enlevée par l’activité enzymatique respective des protéines kinases et phosphatases. Les kinases Erk1/2 sont au cœur d’une voie de signalisation importante qui régule l’activité de protéines impliquées dans la traduction, le cycle cellulaire, le réarrangement du cytosquelette et la transcription. Ces kinases sont aussi impliquées dans le développement de l’organisme, le métabolisme du glucose, la réponse immunitaire et la mémoire. Différentes pathologies humaines comme le diabète, les maladies cardiovasculaires et principalement le cancer, sont associées à une perturbation de la phosphorylation sur les différents acteurs de cette voie. Considérant l’importance biologique et clinique de ces deux kinases, connaître l’étendue de leur activité enzymatique pourrait mener au développement de nouvelles thérapies pharmacologiques. Dans ce contexte, l’objectif principal de cette thèse était de mesurer l’influence de cette voie sur le phosphoprotéome et de découvrir de nouveaux substrats des kinases Erk1/2. Une étude phosphoprotéomique de cinétique d’inhibition pharmacologique de la voie de signalisation Erk1/2 a alors été entreprise. Le succès de cette étude était basé sur trois technologies clés, soit l’enrichissement des phosphopeptides avec le dioxyde de titane, la spectrométrie de masse haut débit et haute résolution, et le développement d’une plateforme bio-informatique nommée ProteoConnections. Cette plateforme permet d’organiser les données de protéomique, évaluer leur qualité, indiquer les changements d’abondance et accélérer l’interprétation des données. Une fonctionnalité distinctive de ProteoConnections est l’annotation des sites phosphorylés identifiés (kinases, domaines, structures, conservation, interactions protéiques phospho-dépendantes). Ces informations ont été essentielles à l’analyse des 9615 sites phosphorylés sur les 2108 protéines identifiées dans cette étude, soit le plus large ensemble rapporté chez le rat jusqu’à ce jour. L’analyse des domaines protéiques a révélé que les domaines impliqués dans les interactions avec les protéines, les acides nucléiques et les autres molécules sont les plus fréquemment phosphorylés et que les sites sont stratégiquement localisés pour affecter les interactions. Un algorithme a été implémenté pour trouver les substrats potentiels des kinases Erk1/2 à partir des sites identifiés selon leur motif de phosphorylation, leur cinétique de stimulation au sérum et l’inhibition pharmacologique de Mek1/2. Une liste de 157 substrats potentiels des kinases Erk1/2 a ainsi été obtenue. Parmi les substrats identifiés, douze ont déjà été rapportés et plusieurs autres ont des fonctions associées aux substrats déjà connus. Six substrats (Ddx47, Hmg20a, Junb, Map2k2, Numa1, Rras2) ont été confirmés par un essai kinase in vitro avec Erk1. Nos expériences d’immunofluorescence ont démontré que la phosphorylation de Hmg20a sur la sérine 105 par Erk1/2 affecte la localisation nucléocytoplasmique de cette protéine. Finalement, les phosphopeptides isomériques positionnels, soit des peptides avec la même séquence d’acides aminés mais phosphorylés à différentes positions, ont été étudiés avec deux nouveaux algorithmes. Cette étude a permis de déterminer leur fréquence dans un extrait enrichi en phosphopeptides et d’évaluer leur séparation par chromatographie liquide en phase inverse. Une stratégie analytique employant un des algorithmes a été développée pour réaliser une analyse de spectrométrie de masse ciblée afin de découvrir les isomères ayant été manqués par la méthode d’analyse conventionnelle.

The Development, Validation and Implementation of a Broad-Based ADME Genotyping Assay into Research and Clinical Trials

Afin d’adresser la variabilité interindividuelle observée dans la réponse pharmacocinétique à de nombreux médicaments, nous avons créé un panel de génotypage personnalisée en utilisant des méthodes de conception et d’élaboration d’essais uniques. Celles-ci ont pour but premier de capturer les variations génétiques présentent dans les gènes clés impliqués dans les processus d'absorption, de distribution, de métabolisme et d’excrétion (ADME) de nombreux agents thérapeutiques. Bien que ces gènes et voies de signalement sont impliqués dans plusieurs mécanismes pharmacocinétiques qui sont bien connues, il y a eu jusqu’à présent peu d'efforts envers l’évaluation simultanée d’un grand nombre de ces gènes moyennant un seul outil expérimental. La recherche pharmacogénomique peut être réalisée en utilisant deux approches: 1) les marqueurs fonctionnels peuvent être utilisés pour présélectionner ou stratifier les populations de patients en se basant sur des états métaboliques connus; 2) les marqueurs Tag peuvent être utilisés pour découvrir de nouvelles corrélations génotype-phénotype. Présentement, il existe un besoin pour un outil de recherche qui englobe un grand nombre de gènes ADME et variantes et dont le contenu est applicable à ces deux modèles d'étude. Dans le cadre de cette thèse, nous avons développé un panel d’essais de génotypage de 3,000 marqueurs génétiques ADME qui peuvent satisfaire ce besoin. Dans le cadre de ce projet, les gènes et marqueurs associés avec la famille ADME ont été sélectionnés en collaboration avec plusieurs groupes du milieu universitaire et de l'industrie pharmaceutique. Pendant trois phases de développement de cet essai de génotypage, le taux de conversion pour 3,000 marqueurs a été amélioré de 83% à 97,4% grâce à l'incorporation de nouvelles stratégies ayant pour but de surmonter les zones d'interférence génomiques comprenant entre autres les régions homologues et les polymorphismes sous-jacent les régions d’intérêt. La précision du panel de génotypage a été validée par l’évaluation de plus de 200 échantillons pour lesquelles les génotypes sont connus pour lesquels nous avons obtenu une concordance > 98%. De plus, une comparaison croisée entre nos données provenant de cet essai et des données obtenues par différentes plateformes technologiques déjà disponibles sur le marché a révélé une concordance globale de > 99,5%. L'efficacité de notre stratégie de conception ont été démontrées par l'utilisation réussie de cet essai dans le cadre de plusieurs projets de recherche où plus de 1,000 échantillons ont été testés. Nous avons entre autre évalué avec succès 150 échantillons hépatiques qui ont été largement caractérisés pour plusieurs phénotypes. Dans ces échantillons, nous avons pu valider 13 gènes ADME avec cis-eQTL précédemment rapportés et de découvrir et de 13 autres gènes ADME avec cis eQTLs qui n'avaient pas été observés en utilisant des méthodes standard. Enfin, à l'appui de ce travail, un outil logiciel a été développé, Opitimus Primer, pour aider pour aider au développement du test. Le logiciel a également été utilisé pour aider à l'enrichissement de cibles génomiques pour d'expériences séquençage. Le contenu ainsi que la conception, l’optimisation et la validation de notre panel le distingue largement de l’ensemble des essais commerciaux couramment disponibles sur le marché qui comprennent soit des marqueurs fonctionnels pour seulement un petit nombre de gènes, ou alors n’offre pas une couverture adéquate pour les gènes connus d’ADME. Nous pouvons ainsi conclure que l’essai que nous avons développé est et continuera certainement d’être un outil d’une grande utilité pour les futures études et essais cliniques dans le domaine de la pharmacocinétique, qui bénéficieraient de l'évaluation d'une longue liste complète de gènes d’ADME.

Étude des tachykinines et de leurs dérivés peptidiques associés à la douleur neuropathique grâce à l’utilisation de modèles animaux et de la chromatographie en phase liquide couplée à la spectrométrie de masse

Thèse réalisée en co-tutelle avec l'Université Claude Bernard de Lyon 1, en France.

Role of the ASPP Family in the Regulation of p53-Mediated Apoptotic Death of Retinal Ganglion Cells after Optic Nerve Injury

Le glaucome est la première cause de cécité irréversible à travers le monde. À présent il n’existe aucun remède au glaucome, et les thérapies adoptées sont souvent inadéquates. La perte de vision causée par le glaucome est due à la mort sélective des cellules rétiniennes ganglionnaires, les neurones qui envoient de l’information visuelle de la rétine au cerveau. Le mécanisme principal menant au dommage des cellules rétiniennes ganglionnaires lors du glaucome n’est pas bien compris, mais quelques responsables putatifs ont été proposés tels que l’excitotoxicité, le manque de neurotrophines, la compression mécanique, l’ischémie, les astrocytes réactifs et le stress oxidatif, parmis d’autres. Indépendamment de la cause, il est bien établi que la perte des cellules rétiniennes ganglionnaires lors du glaucome est causée par la mort cellulaire programmée apoptotique. Cependant, les mécanismes moléculaires précis qui déclenchent l’apoptose dans les cellules rétiniennes ganglionnaires adultes sont mal définis. Pour aborder ce point, j’ai avancé l’hypothèse centrale que l’identification de voies de signalisations moléculaires impliquées dans la mort apoptotique des cellules rétiniennes ganglionnaires offrirait des avenues thérapeutiques pour ralentir ou même prévenir la mort de celles-ci lors de neuropathies oculaires telles que le glaucome. Dans la première partie de ma thèse, j’ai caractérisé le rôle de la famille de protéines stimulatrices d’apoptose de p53 (ASPP), protéines régulatrices de la famille p53, dans la mort apoptotique des cellules rétiniennes ganglionnaires. p53 est un facteur de transcription nucléaire impliqué dans des fonctions cellulaires variant de la transcription à l’apoptose. Les membres de la famille ASPP, soit ASPP1, ASPP2 et iASPP, sont des protéines de liaison de p53 qui régulent l’apoptose. Pourtant, le rôle de la famille des ASPP dans la mort des cellules rétiniennes ganglionnaires est inconnu. ASPP1 et ASPP2 étant pro-apoptotiques, l’hypothèse de cette première étude est que la baisse ciblée de ASPP1 et ASPP2 promouvrait la survie des cellules rétiniennes ganglionnaires après une blessure du nerf optique. Nous avons utilisé un modèle expérimental bien caractérisé de mort apoptotique neuronale induite par axotomie du nerf optique chez le rat de type Sprague Dawley. Les résultats de cette étude (Wilson et al. Journal of Neuroscience, 2013) ont démontré que p53 est impliqué dans la mort apoptotique des cellules rétiniennes ganglionnaires, et qu’une baisse ciblée de ASPP1 et ASPP2 par acide ribonucléique d’interference promeut la survie des cellules rétiniennes ganglionnaires. Dans la deuxième partie de ma thèse, j’ai caractérisé le rôle d’iASPP, le membre anti-apoptotique de la famille des ASPP, dans la mort apoptotique des cellules rétiniennes ganglionnaires. L’hypothèse de cette seconde étude est que la surexpression d’iASPP promouvrait la survie des cellules rétiniennes ganglionnaires après axotomie. Mes résultats (Wilson et al. PLoS ONE, 2014) démontrent que le knockdown ciblé de iASPP exacerbe la mort apoptotique des cellules rétiniennes ganglionnaires, et que la surexpression de iASPP par virus adéno-associé promeut la survie des cellules rétiniennes ganglionnaires. En conclusion, les résultats présentés dans cette thèse contribuent à une meilleure compréhension des mécanismes régulateurs sous-jacents la perte de cellules rétiniennes ganglionnaires par apoptose et pourraient fournir des pistes pour la conception de nouvelles stratégies neuroprotectrices pour le traitement de maladies neurodégénératives telles que le glaucome.

Liquid Chromatography-Electrospray Linear Ion Trap Mass Spectrometry Analysis of Targeted Neuropeptides in Tac1-/- Mouse Spinal Cords Reveal Significant Lower Concentration of Opioid Peptides.

Tachykinin and opioid peptides play a central role in pain transmission, modulation and inhibition. The treatment of pain is very important in medicine and many studies using NK1 receptor antagonists failed to show significant analgesic effects in humans. Recent investigations suggest that both pronociceptive tachykinins and the analgesic opioid systems are important for normal pain sensation. The analysis of opioid peptides in Tac1-/- spinal cord tissues offers a great opportunity to verify the influence of the tachykinin system on specific opioid peptides. The objectives of this study were to develop a HPLC–MS/MRM assay to quantify targeted peptides in spinal cord tissues. Secondly, we wanted to verify if the Tac1-/- mouse endogenous opioid system is hampered and therefore affect significantly the pain modulatory pathways. Targeted neuropeptides were analyzed by high performance liquid chromatography linear ion trap mass spectrometry. Our results reveal that EM-2, Leu-Enk and Dyn A were down-regulated in Tac1-/- spinal cord tissues. Interestingly, Dyn A was almost 3 fold down-regulated (p < 0.0001). No significant concentration differences were observed in mouse Tac1-/- spinal cords for Met-Enk and CGRP. The analysis of Tac1-/- mouse spinal cords revealed noteworthy decreases of EM-2, Leu-Enk and Dyn A concentrations which strongly suggest a significant impact on the endogenous pain-relieving mechanisms. These observations may have insightful impact on future analgesic drug developments and therapeutic strategies.