二穗短柄草的遗传转化及VER2等基因在水稻中的功能初探

作为模式植物，水稻和拟南芥对于禾本科植物的研究都有其不足，二穗短柄草（Brachypodiumdistachyon）有望成为它们良好的补充。它具有作为一种模式植物所应该具有的各项优点，并且它与温带禾本科植物的亲缘关系比水稻更近。建立其良好转化体系是其成功应用的一环。本论文第一章以建立其农杆菌转化体系为目的，成功的诱导了其胚性愈伤组织，获得了潮霉素抗性愈伤，发现乙酰丁香酮浓度与转化效率的关系，并证明Silwet L-77对提高其转化效率有明显的作用，为进一步完善其转化体系打下了基础。 VER2是由本实验室发现的小麦春化相关基因，并己证明它可能参与春化过程中O-CJlcNAc介导的信号传导。本论文第二章研究了将VER2在水稻中过表达所引起的表型，发现VER2与光有类似的抑制根生长的作用，并且能够互相影响对方的表型，说明二者在水稻内调控根生长的信号途径既有共同的作用，但是又相互制约。进一步的研究有可能会找到水稻根内IAA响应的重要因子。 在第三章中，根据芯片数据克隆了水稻的十个可能与赤霉素、茉莉酸和减数分裂相关的上下调基因，并对其中四个利用过表达和RNAi技术进行了水稻转化，以研究它们在水稻中的功能。其中一个基因过表达的表型与赤霉素缺陷造成矮化和叶色深绿两个特征一致，而RNAi导致植株高度增加、叶色黄绿。而该基因受赤霉素诱导上调的程度在三个芯片杂交结果中最大(log2=2.3275)这一点也为其功能提供了很好的提示，即可能参与了赤霉素信号途径。

查尔酮异构酶基因过表达对新疆雪莲类黄酮生物合成的调控

新疆雪莲（Saussurea involucrata Kar. et Kir.）是我国名贵中药材，其主要药用活性成分为黄酮类化合物。目前人们对新疆雪莲及它的黄酮类化合物的需求日益增多，但雪莲的人工栽培技术尚未成熟，在野生状态下，新疆雪莲只能生长在海拔4,000到5,000米的雪山上，现在由于过度采挖已濒临灭绝。为解决雪莲资源匮乏，提高雪莲中黄酮类成分的含量，本研究通过基因工程手段利用发根农杆菌将黄酮代谢途径中的关键酶－查尔酮异构酶（CHI）基因导入新疆雪莲，产生转基因新疆雪莲毛状根及再生苗，以期提高新疆雪莲的黄酮类物质含量，进行新疆雪莲黄酮类物质的生产。主要结果如下： 　　1．对克隆到的水母雪莲查尔酮异构酶基因（Smchi）进行功能分析。转Smchi正义、反义烟草的CHI酶活性实验结果表明，转Smchi正义的烟草CHI酶活性比对照提高3-6倍，而转反义Smchi基因的烟草CHI酶活性比对照则显著降低。分析不同株系的转基因烟草和对照烟草的黄酮含量和花色素含量表明，转Smchi正义的烟草积累比对照显著增高水平的总黄酮，其中株系CS-5黄酮含量是对照的6倍，转Smchi反义的烟草则积累较低水平的总黄酮，而且转基因烟草的总黄酮含量与Smchi基因的表达水平和CHI酶活性成正相关。但不论转Smchi基因正义或反义方向的烟草，其花色素含量和对照相比均没有发生显著变化。进一步对转基因烟草的黄酮成分进行分析，发现烟草中的主要黄酮成分芦丁在转Smchi正义烟草中有很高的积累。 　　2．发根农杆菌介导法将Smchi基因导入新疆雪莲，得到转Smchi基因的新疆雪莲毛状根。实验发现，35S-chi转基因对毛状根的生长没有显著影响，但35S-chi转基因毛状根能够合成显著提高水平的芹菜素和总黄酮，其中根系C46经过35 d培养，能产生32.1 mg/L的芹菜素和647.8 mg/L的总黄酮，分别是对照根系的12倍和4倍;不同根系的Smchi基因表达水平、CHI酶活性和芹菜素含量成正相关。本研究为通过基因工程手段提高新疆雪莲毛状根芹菜素和总黄酮含量提供了一个有效方法。 　　3．在1/2MS附加GA1.5 mg/L的培养基上，新疆雪莲毛状根的不定芽再生频率高且不定芽生长健壮。再生苗在MS+BA1.0 mg/L+NAA0.1 mg/L的培养基上继代培养生长量较大，经过20 d的培养，35S-chi转基因新疆雪莲再生苗株系（C17、C27、C46）、对照再生苗（Control-1）和正常试管苗（Control-2）之间生长量差异不显著，增殖倍数都在7倍左右;实验还发现，毛状根再生苗比各自来源的毛状根的芹菜素和总黄酮含量下降了20-30%，但转基因再生苗的芹菜素和总黄酮含量比Control-1和Control-2都有显著提高，其中C46芹菜素和总黄酮含量分别为1.86 mg/g 干重和37.3 mg/g干重，分别是Control-1的12倍和 2.4 倍，Control-2的4 倍和1.6倍。这些结果表明由毛状根诱导出的再生苗可作为增强目标次生代谢产物生产的另外一个有效来源。