Modèle cellulaire de carcinogenèse pour les cancers de l’oropharynx induits par le VPH

Problématique: Le virus du papillome humain (VPH) est présent dans près de 50% des cancers de l’oropharynx. Le potentiel oncogénique du VPH est encodé dans les oncoprotéines E6 et E7, qui agissent en modulant différents gènes, dont les gènes suppresseurs de tumeur p53 et pRb. Les cellules VPH positives démontrent une altération au niveau de la signalisation de la réponse aux dommages à l’ADN (RDA), un mécanisme de contrôle dans l’arrêt de la croissance des cellules ayant subit des dommages au niveau de leur ADN. Hypothèse et objectifs : Nous croyons que les défauts au niveau de la RDA des cancers VPH positifs peuvent être exploités afin de sensibiliser préférentiellement les cellules cancéreuses aux traitements de radiothérapie. Cette stratégie de recherche nécessite l’élaboration d’un modèle cellulaire de carcinogenèse isogénique pour le cancer de l’oropharynx que nous proposons de développer et de caractériser. L’étude vise à dériver des lignées isogéniques à partir de kératinocytes primaires et cellules épithéliales de l’oropharynx pour ensuite valider la carcinogenèse de notre modèle in vitro & in vivo Méthodologie : Des lignées cellulaires de kératinocytes primaires et de cellules épithéliales de l’oropharynx ont été successivement modifiées par transduction afin de présenter les mutations associées aux cancers de l’oropharynx induits par le VPH. Les cellules ont été modifiées avec des lentivirus codants pour la télomérase (hTERT), les oncogènes E6, E7 et RasV12. Afin de valider la cancérogenèse in vitro de notre modèle, des études d’invasion en matrigel et de croissance sans ancrage en agar mou ont été réalisées. Les populations cellulaires transformées ont été ensuite introduites dans des souris immunodéficientes afin d’évaluer leur tumorogénicité in vivo. Résultats : À partir des plasmides recombinés construits par méthodes de clonage traditionnelle et de recombinaison « Gateway », nous avons produit des lentivirus codants pour la télomérase humaine (hTERT), les oncogènes viraux E6 et E7 et l’oncogène Ras. Les kératinocytes primaires et cellules épithéliales de l’oropharynx ont été infectés successivement par transduction et sélectionnés. Nous avons validé l’expression de nos transgènes par méthode d’immunofluorescence, de Western Blot et de réaction de polymérisation en chaîne quantitative en temps réel (qRT-PCR). Nous avons établi trois lignées des cellules épithéliales de l’oropharynx (HNOE) à partir d’échantillons tissulaires prélevés lors d’amygdalectomie (HNOE42, HNO45, HNOE46). Les cellules transduites avec le lentivirus exprimant le promoteur fort CMV/TO de l’oncogène RasV12 ont présenté un changement morphologique compatible avec une sénescence prématurée induite par l’oncogène Ras. En exprimant des quantités plus faibles du RasV12 mutant, la lignée cellulaire HEKn hTERT-E6-E7 PGK RasV12 a réussi à échapper à la sénescence induite par l’oncogène Ras. La population cellulaire exprimant HEKn hTERT-E6-E7-PGK RasV12 a présenté un phénotype malin en culture et à l’étude d'invasion, mais n’a pas démontré de résultats positifs à l’étude de croissance sans ancrage en agar mou ni en xénogreffe en souris immunodéficientes. Conclusion : Nos résultats démontrent qu’en présence des oncogènes viraux E6 et E7, il y a un troisième mécanisme suppresseur de tumeur qui médie la sénescence induite par l’oncogène Ras. Nous avons identifié que la présence de E6 seule ne suffit pas à immortaliser les kératinocytes primaires humains (HEKn). Nous n’avons pas réussi à créer un modèle in vitro de carcinogenèse pour les cancers de l’oropharynx induits par le VPH.

Nouvelles stratégies pour l’analyse des cyanotoxines par spectrométrie de masse

Les cyanobactéries ont une place très importante dans les écosystèmes aquatiques et un nombre important d’espèces considéré comme nuisible de par leur production de métabolites toxiques. Ces cyanotoxines possèdent des propriétés très variées et ont souvent été associées à des épisodes d’empoisonnement. L’augmentation des épisodes d’efflorescence d’origine cyanobactériennes et le potentiel qu’ils augmentent avec les changements climatiques a renchéri l’intérêt de l’étude des cyanobactéries et de leurs toxines. Considérant la complexité chimique des cyanotoxines, le développement de méthodes de détection simples, sensibles et rapides est toujours considéré comme étant un défi analytique. Considérant ces défis, le développement de nouvelles approches analytiques pour la détection de cyanotoxines dans l’eau et les poissons ayant été contaminés par des efflorescences cyanobactériennes nuisibles a été proposé. Une première approche consiste en l’utilisation d’une extraction sur phase solide en ligne couplée à une chromatographie liquide et à une détection en spectrométrie de masse en tandem (SPE-LC-MS/MS) permettant l’analyse de six analogues de microcystines (MC), de l’anatoxine (ANA-a) et de la cylindrospermopsine (CYN). La méthode permet une analyse simple et rapide et ainsi que la séparation chromatographique d’ANA-a et de son interférence isobare, la phénylalanine. Les limites de détection obtenues se trouvaient entre 0,01 et 0,02 μg L-1 et des concentrations retrouvées dans des eaux de lacs du Québec se trouvaient entre 0,024 et 36 μg L-1. Une deuxième méthode a permis l’analyse du b-N-méthylamino-L-alanine (BMAA), d’ANA-a, de CYN et de la saxitoxine (STX) dans les eaux de lac contaminés. L’analyse de deux isomères de conformation du BMAA a été effectuée afin d’améliorer la sélectivité de la détection. L’utilisation d’une SPE manuelle permet la purification et préconcentration des échantillons et une dérivatisation à base de chlorure de dansyle permet une chromatographie simplifiée. L’analyse effectuée par LC couplée à la spectrométrie de masse à haute résolution (HRMS) et des limites de détections ont été obtenues entre 0,007 et 0,01 µg L-1. Des échantillons réels ont été analysés avec des concentrations entre 0,01 et 0,3 µg L-1 permettant ainsi la confirmation de la présence du BMAA dans les efflorescences de cyanobactéries au Québec. Un deuxième volet du projet consiste en l’utilisation d’une technologie d’introduction d’échantillon permettant des analyses ultra-rapides (< 15 secondes/échantillons) sans étape chromatographique, la désorption thermique à diode laser (LDTD) couplée à l’ionisation chimique à pression atmosphérique (APCI) et à la spectrométrie de masse (MS). Un premier projet consiste en l’analyse des MC totales par l’intermédiaire d’une oxydation de Lemieux permettant un bris de la molécule et obtenant une fraction commune aux multiples congénères existants des MC. Cette fraction, le MMPB, est analysée, après une extraction liquide-liquide, par LDTD-APCI-MS/MS. Une limite de détection de 0,2 µg L-1 a été obtenue et des concentrations entre 1 et 425 µg L-1 ont été trouvées dans des échantillons d’eau de lac contaminés du Québec. De plus, une analyse en parallèle avec des étalons pour divers congénères des MC a permis de suggérer la possible présence de congénères ou d’isomères non détectés. Un deuxième projet consiste en l’analyse directe d’ANA-a par LDTD-APCI-HRMS pour résoudre son interférence isobare, la phénylalanine, grâce à la détection à haute résolution. La LDTD n’offre pas de séparation chromatographique et l’utilisation de la HRMS permet de distinguer les signaux d’ANA-a de ceux de la phénylalanine. Une limite de détection de 0,2 µg L-1 a été obtenue et la méthode a été appliquée sur des échantillons réels d’eau avec un échantillon positif en ANA-a avec une concentration de 0,21 µg L-1. Finalement, à l’aide de la LDTD-APCI-HRMS, l’analyse des MC totales a été adaptée pour la chair de poisson afin de déterminer la fraction libre et liée des MC et comparer les résultats avec des analyses conventionnelles. L’utilisation d’une digestion par hydroxyde de sodium précédant l’oxydation de Lemieux suivi d’une purification par SPE a permis d’obtenir une limite de détection de 2,7 µg kg-1. Des échantillons de poissons contaminés ont été analysés, on a retrouvé des concentrations en MC totales de 2,9 et 13,2 µg kg-1 comparativement aux analyses usuelles qui avaient démontré un seul échantillon positif à 2 µg kg-1, indiquant la possible présence de MC non détectés en utilisant les méthodes conventionnelles.

Synthèse et étude de nouvelles molécules potentiellement polymérisables pour la fabrication de matériaux électroluminescents : analogues du 1,3,5 benzènetripyrrole, méthyle 3,5-bipyrrolebenzoate et 6,12-diméthyle-1,5-dipyrrolediazocane

Pyrroles are found in various natural products and in the chemical composition of certain drugs because of their interesting biological properties. Lipitor, Tolmetin and Amtolmetin are examples of drugs with 1,2,5-substituted pyrroles in their composition, in which biological activities have been certified. Moreover, pyrroles are used as precursors of semiconductor polymers, oligomers and dendrimers useful for the synthesis of electroluminescent materials used in devices, such as organic light-emitting diodes, field-effect transistors, solar and organic photovoltaic cells. We are interested in conjugated polymers based on pyrrole due to their optical properties, electrochemical and the conductivity produced by electron delocalization along their carbon chains. The overall objective of the work presented in this thesis is the synthesis of new molecules based on pyrrole for studying their electronic and electrochemical properties as well for the synthesis of conjugated polymers. Initially, we performed the synthesis of 1,3,5-tri-(1-alkyl-5-methylpyrrol-2-yl)benzenes, which may serve as precursors for the synthesis of conjugated dendrimers. Their synthesis was made in three steps starting from trimethyl 1,3,5-benzene-tricarboxylate which was converted to 1,3,5-tri-(pent-4-enoyl)benzene using vinylmagnesium bromide in a Grignard reaction catalyzed by copper cyanide. The olefins of 1,3,5-tri-(pent-4-enoyl)benzene were oxidized to produce 1,3,5-tri-(4-oxopentanoyl)benzene using a modified protocol of the Tsuji-Wacker reaction. Subsequent, Paal-Knorr condensation reactions on 1,3,5-tri-(4-oxopentanoyl)benzene with different amines were used to synthesize 1,3,5-tri-(1-alkyl-5-methylpyrrol-2-yl)benzenes with different N-substituents in yields between 44 and 60%. Incomplete reaction of vinylmagnesium bromide with trimethyl 1,3,5-benzenetricarboxylate gave the methyl-3,5-di(pent-4-enoyl)benzoate, which was converted to methyl-3,5-dipyrrolylbenzoate following the reaction of Tsuji- Wacker and Paal-Knorr with yields between 30 and 60%. The photochemical and electrochemical properties of the 1,3,5-tri-(1-alkyl-5-methylpyrrol-2-yl)benzenes and methyl-3,5-dipyrrolylbenzoates were studied in collaboration with the research group of professor William Skene. The results have shown that both types of pyrrole have potential for the synthesis of conjugated polymers and dendrimers used in the manufacture of electroluminescent materials. Following these encouraging results, we performed the synthesis of 6,12-dimethyl-1,5-dipyrrolediazocane. Methyl N-(Boc)-β-alaninate was converted to its corresponding homoallylic ketone, which was oxidized to N-(Boc)aminoheptan-3,6-dione. The Paal-Knorr condensation between N-(Boc)aminoheptan-3,6-dione and aminoheptan-3,6-dione hydrochloride gave 6,12-dimethyl-1,5-dipyrrolediazocane in 17% yield. In sum, we have synthesized and characterized seven new molecules, six of them having photochemical and electrochemical properties interesting for the synthesis of conjugated polymers and dendrimers. The latter offering potential as precursor for the conception of compounds of therapeutic interest.

Prévention de la maladie de Lyme : facteurs sociaux et priorisation des interventions

La maladie de Lyme est la maladie vectorielle la plus fréquente dans les pays tempérés et est en émergence dans plusieurs régions du monde. Plusieurs stratégies de prévention existent et comprennent des interventions qui visent les individus, comme le port de vêtements protecteurs, et d’autres qui sont implantées au niveau collectif, dont des interventions de contrôle des tiques dans l’environnement. L’efficacité de ces stratégies peut être influencée par divers facteurs, dont des facteurs sociaux tels que les connaissances, les perceptions et les comportements de la population ciblée. Elles peuvent également avoir des impacts parallèles non désirés, par exemple sur l’environnement et l’économie, et ces derniers peuvent s’opposer aux bénéfices des interventions jusqu’à remettre en cause la pertinence de leur mise en œuvre. Aussi, ces facteurs sociaux et les impacts des interventions sont susceptibles de varier selon la population ciblée et en fonction du contexte épidémiologique et social. L’objectif de cette thèse était donc d’étudier les principaux facteurs sociaux et enjeux d’importance à considérer pour évaluer l’efficacité et prioriser des interventions de prévention pour la maladie de Lyme dans deux populations exposées à des contextes différents, notamment en ce qui concerne leur situation épidémiologique, soient au Québec, où l’incidence de la maladie de Lyme est faible mais en émergence, et en Suisse, où elle est élevée et endémique depuis plus de trois décennies. L’approche choisie et le devis général de l’étude sont basés sur deux modèles théoriques principaux, soient le modèle des croyances relatives à la santé et celui de l’aide à la décision multicritère. Dans un premier temps, les facteurs associés à la perception du risque pour la maladie de Lyme, c’est-à-dire l’évaluation cognitive d’une personne face au risque auquel elle fait face, ont été étudiés. Les résultats suggèrent que les facteurs significatifs sont différents dans les deux régions à l’étude. Ensuite, l’impact des connaissances, de l’exposition, et des perceptions sur l’adoption de comportements préventifs individuels et sur l’acceptabilité des interventions de contrôle des tiques (acaricides, modifications de l’habitat, contrôle des cervidés) a été comparé. Les résultats suggèrent que l’impact des facteurs varierait en fonction du type du comportement et des interventions, mais que la perception de l’efficacité est un facteur commun fortement associé à ces deux aspects, et pourrait être un facteur-clé à cibler lors de campagnes de communication. Les résultats montrent également que les enjeux relatifs aux interventions de contrôle des tiques tels que perçus par la population générale seraient communs dans les deux contextes de l’étude, et partagés par les intervenants impliqués dans la prévention de la maladie de Lyme. Finalement, un modèle d’analyse multicritère a été développé à l’aide d’une approche participative pour le contexte du Québec puis adapté pour le contexte suisse et a permis d’évaluer et de prioriser les interventions préventives selon les différentes perspectives des intervenants. Les rangements produits par les modèles au Québec et en Suisse ont priorisé les interventions qui ciblent principalement les populations humaines, devant les interventions de contrôle des tiques. L’application de l’aide à la décision multicritère dans le contexte de la prévention de la maladie de Lyme a permis de développer un modèle décisionnel polyvalent et adaptable à différents contextes, dont la situation épidémiologique. Ces travaux démontrent que cette approche peut intégrer de façon rigoureuse et transparente les multiples perspectives des intervenants et les enjeux de la prévention relatifs à la santé publique, à la santé animale et environnementale, aux impacts sociaux, ainsi qu’aux considérations économiques, opérationnelles et stratégiques. L’utilisation de ces modèles en santé publique favoriserait l’adoption d’une approche « Une seule santé » pour la prévention de la maladie de Lyme et des zoonoses en général. Mots-clés : maladie de Lyme, prévention, facteurs sociaux, perception du risque, comportements préventifs, acceptabilité, priorisation des interventions, contrôle des tiques, aide à la décision multicritère, analyse multicritère, Québec, Suisse, « Une seule santé »

Entwicklung eines leistungsstarken Polarisators und Kompressors für 3 He für medizinische MR Tomographie

Zusammenfassung: Michael EbertEntwicklung eines leistungsstarken Polarisators und Kompressorsfür 3-He für medizinische MR Tomographie Durch Optisches Pumpen von metastabilem3-He*--Gas bei einem Druck von 1 mb und Spinübertrag mittels Metastabileraustauschstöße aufden Grundzustand, wird 3-He auf 53 % bei einemmittleren Fluß von f = 58 bar*liter/Tag aufpolarisiert. Bei einem Fluß von f = 122bar*l/Tag wird immer noch eine Polarisation von 30 % erzielt. DurchSteigerung der Laserleistung von derzeit 12 Watt aufwünschenswerte 30 Watt, könnten beigleichem Fluß Kernspinpolarisationen des Heliums von 70 % erreicht werden. Mittels einer eigens entwickelten Ganzmetall--Titan--Kolbenpumpeerfolgt die Kompression in zwei Stufen. Zuerst wird einZwischenvolumen auf Drücke 200 bis 800 mb,je nach Anwendung gefüllt. Mit dem selben Kompressor könnenanschließend abnehmbare, verschließbare Experimentierzellen ausdiesem Zwischenvolumen auf Drücke 1 bis 6 bar gefüllt werden. Auf Grund des großen Hubvolumens von 15,4 Liter können große Gasmengen proKompressionszyklus verdichtet werden. Wegen des großen Verhältnisaus Kompressionshub h = 100 cm undKompressordurchmesser 14 cm kommt es imKompressionsraum zu keinen meßbaren Polarisationsverlusten.Zusammen mit dem großen Kompressionsfaktor von K = 10000sind diese konstruktiven Maßnahmen für den vollständigen Erhaltder Polarisation bei der Kompression des polarizierten 3-He--Gasesverantwortlich. Diese großen Gasmengen an hyperpolarisiertem 3-He haben ersteklinische Studien funktioneller Lungen--MRT ermöglicht. DurchMessung des Sauerstoffpartialdrucks und dessen Abnahmerate, derBestimmung der Ventillation und Messung der DiffusionskonstantenADC in der Lunge, können die Funktionen dieses Organs lokalquantitativ beurteilt werden.

Aufbau des GDH-Experiments und Messung der Helizitätsabhängigkeit von gamma p p pi + pi- von der Schwelle bis 800 MeV

Das Experiment zur Überprüfung der Gerasimov-Drell-Hearn(GDH)-Summenregel am Mainzer Mikrotron diente zur Messunghelizitätsabhängiger Eigenschaften der Photoproduktion amProton. Hierbei konnten neben den totalen Photoabsorptionswirkungsquerschnitten auch Querschnitte partieller Kanäle der Einpion-, Zweipion- und Eta-Produktion bestimmt werden. Für die möglichen Doppel-Pion-Reaktionen sind zur Zeit nur wenig Information vorhanden. Daher sind die Reaktionsmechanismen der Doppel-Pion-Photoproduktion weitgehend noch unverstanden. Aus diesem Grund ist die Untersuchung weiterer Observablenerforderlich. Die Helizitätsabhängigkeit stellt eine solcheneue Observable dar und kann dadurch gemessen werden, daßein zirkular polarisiertes Photon mit einem longitudinalpolarisierten Nukleon wechselwirkt. Der Photonspin beträgt1 und der Fermionenspin des Nukleons beträgt 1/2.Die Spins koppeln zu 3/2 und 1/2. Dies liefert diehelizitätsabhängigen Wirkungsquerschnitte.Diese Dissertation beschreibt den Aufbau des Mainzer GDH-Experiments und die technische Realisation der Messung helizitätsabhängiger Photoabsorptionswirkungsquerschnitte. Die Helizitätsabhängigkeit der doppelt geladenen Doppel-Pion-Photoproduktion am Proton wurde anhand der gemessenen Daten untersucht. Diese Reaktion ist ein Zweistufenprozeß, wobei das angeregte Nukleon resonant oder nicht-resonant in die Endzustandsteilchen zerfällt. Durch die helizitätsabhängigen Daten wurden Freiheitsgradein der Doppel-Pion-Photoproduktion eingeschränkt, wodurch eine Verbesserung der Modelle der Gent-Mainz- und der Valencia-Gruppe ermöglicht wurde. Die im Rahmen dieser Arbeit ermittelten Daten haben zusätzlich eine Motivation für weitere Interpretationsansätze durch die genanntenTheoriegruppen geschaffen.

Charakterisierung der neuroprotektiven Eigenschaften des Corticotropin-Releasing-Hormons

Das Corticotropin Releasing Hormon (CRH) ist ein zentraler Mediator des neuroendokrinen Systems von Säugetieren und kontrolliert die physiologische Stressreaktion des Körpers. Zudem zeigten in vitro Daten, dass es Neuroprotektion gegenüber oxidativem Stress induzieren kann. In der vorliegenden Arbeit konnte erstmals ein neuroprotektiver Effekt des CRH in vivo gezeigt werden. Die Überexpression des CRH im ZNS von Mäusen konnte Nervenzellen in vivo vor Exzitotoxizität schützen; nach Injektion des Exzitotoxins Kainat verkürzte die CRH-Überexpression die Dauer der epileptischen Anfälle, schützte die Neurone der betroffenen Hippocampusregion vor Zelltod und verhinderte die bei Exzitotoxizität und vielen neurodegenerativen Erkrankungen auftretende Neuroinflammation. Desweiteren konnten in CRH-überexprimierenden Tieren erhöhte BDNF-Proteinspiegel nachgewiesen werden. BDNF, ein bedeutender neurotropher Faktor im ZNS, vermittelt daher teilweise die CRH-induzierte Neuroprotektion gegenüber der Exzitotoxizität in vivo. Im Rahmen dieser Arbeit wurde mit Connexin43, dem Haupt-Gap Junction-Protein der Astrozyten, ein neues CRH-Zielgen im ZNS identifiziert. Es konnte erstmals gezeigt werden, dass CRH sowohl die Expression des Connexin43-Gens als auch den Connexin43-Proteinspiegel in vitro und in vivo erhöht. Diese Effekte werden über die Aktivierung des CRH-Rezeptor 1 und nachfolgend der PKA- und MAPK-Signalwege vermittelt. In Übereinstimmung mit der Hochregulation des Connexin43-Proteinspiegels verstärkte CRH auch die interzelluläre Kommunikation über Gap Junctions. Physiologisch hat diese CRH-induzierte Verstärkung der astrozytären Gap Junction-Kommunikation eine große Bedeutung für die Neuroprotektion, da eine Hochregulation der interzellulären Kommunikation schnell toxische Moleküle verdünnt, Energiesubstrate und protektive Faktoren verteilt und Ionen abpuffert. Dadurch werden Schädigungen durch oxidativen Stress in den Zellen reduziert, was über die Analyse der Proteincarbonylierung gezeigt wurde. Die Relevanz der astrozytären Gap Junction-Kommunikation für das Überleben der Neurone konnte in organotypischen hippocampalen Schnitten und in Neuron-Astrozyten-Co-Kulturen deutlich gemacht werden. Die im Rahmen der vorliegenden Arbeit gewonnenen Daten zeigen, dass die Stress-induzierte Sekretion von CRH im ZNS zur verstärkten Expression neuroprotektiver Moleküle wie BDNF und Connexin43 beiträgt. Diese vermögen Neurone gegenüber toxischen Einflüssen zu schützen und zum Erhalt ihrer Funktion beizutragen. Die protektiven CRH-Effekte könnten speziell bei chronischen neurodegenerativen Krankheiten wie der Alzheimerschen Demenz und der Parkinsonschen Krankheit hilfreich sein.

Funktionelle Analyse der Polaritäts- und Tumorsuppressorgene hugl-1 und hugl-2 mittels siRNA-vermitteltem Gen-Silencing und konditionalem Gen-Knockout

Das menschliche Gen human giant larvae (hugl) ist ein Homolog des hochkonservierten Drosophila Gens lethal giant larvae (lgl), welches in Epithelzellen die Funktion eines neoplastischen Tumorsuppressors und Polaritätsregulators einnimmt. Ein Verlust oder eine verminderte Expression beider Homologe des Gens, hugl-1 und hugl-2, geht einher mit dem Auftreten und der Progression verschiedener epithelialer Tumorerkrankungen wie malignen Melanomen und Brust-, Kolon- oder Lungentumoren. Die exakte Funktion der Homologe Hugl-1 und Hugl-2 bezüglich der Regulation und Aufrechterhaltung der epithelialen Zellpolarität sowie ihre Rolle in der Genese humaner Tumore ist jedoch weitgehend unbekannt. Gänzlich unbekannt ist auch die Bedeutung von Hugl-1 und Hugl-2 als Polaritätsregulatoren für die Ausbildung und den Erhalt der T-Zellmorphologie und -funktion. Ziel der vorliegenden Arbeit war es daher, die Polaritäts- und Tumorsuppressorgene hugl-1 und hugl-2 in funktionellen Analysen mittels siRNA-vermitteltem Gen-Silencing in Epithelzellen und T-Lymphozyten zu charakterisieren. Darüber hinaus wurden die Funktionen und Eigenschaften von mgl-2, dem murinen Homologen von hugl-2, im Cre/loxP-vermittelten konditionalen Knockout Mausmodell in vivo analysiert.rnrnZur Charakterisierung der biologischen Effekte von Hugl-1 und Hugl-2 auf das Wachstumsverhalten, Migration und Invasion von Epithelzellen wurden in dieser Arbeit erfolgreich unterschiedliche shRNA-Expressionskonstrukte generiert sowie Hugl-supprimierte Zelllinien etabliert. In vitro Studien sowie in vivo Tumorigenizitätsanalysen lieferten übereinstimmend Hinweise darauf, dass verminderte Hugl-1- und Hugl-2-Expressionsspiegel eine signifikante Rolle in der Vermittlung invasiver und tumorigener Eigenschaften von Epithelzellen spielen. Dabei rief der Verlust beider Homologe deutlich stärkere Reaktionen hervor als die Suppression eines einzelnen Homologen. Zudem wiesen die Überexpression des Zellzyklusregulators Cyclin D1 sowie die Hyperproliferation von Hugl-1- und/oder Hugl-2-depletierten Epithelzellen auf eine wichtige Rolle der beiden Homologe in der Zellzyklusprogression und Zellproliferation hin. Ein geringer Expressionsstatus von Hugl-1 und -2 schien darüber hinaus mit einer verstärkten Resistenzbildung gegenüber Chemotherapeutika zu korrelieren. Im Rahmen dieser Arbeit konnte weiterhin gezeigt werden, dass die untersuchten T-Lymphozyten nur Hugl-1 exprimieren und dass letzteres notwendig für den F-Aktin-vermittelten Erhalt der T-Zellpolarität und -morphologie ist. Hugl-1-supprimierte, über voneinander unabhängige Signalwege (TCR- oder Chemokinrezeptor) stimulierte T-Lymphozyten wiesen eine bedeutende Störung der Lamellipodien- und Uropodausbildung auf und ließen eine Interaktion von Hugl-1 auf Ebene des F Aktins vermuten. Des Weiteren zeigte sich, dass der Polaritätsregulator Hugl-1 die CD3/TCR-induzierte Zelladhäsion positiv beeinflusst. Die Analyse der T-Zellmigration und -motilität offenbarte in Übereinstimmung dazu die Wichtigkeit von Hugl-1 für die Polarisierung und Migration der T-Zellen sowohl im Chemokingradienten als auch auf mDCs. rnrnFür die Aufklärung der funktionellen Rolle von mgl-2 in vivo wurde in dieser Arbeit eine Tamoxifen-induzierbare, Cre/loxP-vermittelte konditionale Mauslinie generiert und analysiert. Die mgl-2-deletierten Tiere wiesen weder signifikante phänotypische Unterschiede noch Abweichungen in der Organanatomie auf und ließen daher auf eine Kompensation durch das im Darmepithel koexprimierte und möglicherweise funktionell redundante mgl-1 Gen schließen.rn

Modifizierungen des Enzyms Silicatein alpha zur direkten Immobilisierung auf verschiedenen Oberflächen : neuartige Herstellung von Kompositmaterialien unter physiologischen Bedingungen

Das Silicatein α ist ein 24 kDa großes Enzym, welches im Schwamm Suberites domuncula für die Synthese von Biosilikat verantwortlich ist. Vorhergehende Studien haben gezeigt, dass Silicatein auch die Synthese anderer Metalloxide wie Titandioxid, Galliumoxid und Zirkoniumdioxid katalysieren kann. Diese Fähigkeiten machen das Silicatein α für biomedizinische und biotechnologische Anwendungen interessant, da die Synthese unter nahezu physiologischen Bedingungen ablaufen kann, was die Herstellung neuartiger Kompositmaterialien mit einzigartigen Eigenschaften erleichtern würde. Zur Immobilisierung des Silicatein α auf verschiedenen Oberflächen wurde bislang ein Nickel-NTA-Kopolymer eingesetzt. Diese Art der Immobilisierung bietet eine Reihe von Möglichkeiten in der Nanobiotechnologie, stößt aber in der Biomedizin an ihre Grenzen, da sich nicht alle Oberflächen für ein solches Coating eignen. Zudem können die zur Aktivierung des Polymers nötigen Lösungsmittel und die über die Zeit freigesetzten Monomere aus dem Polymergerüst toxische oder mutagene Wirkung auf das umliegende Gewebe haben. Deshalb wurde das Silicatein α in dieser Arbeit mit zwei Affinitäts-Tags so modifiziert, dass es an verschiedene Oberflächen immobilisiert werden kann und dabei seine Aktivität beibehält. Zuerst wurde das Silicatein mit einem Glu-tag am N-terminalen Ende modifiziert. Dadurch gelang die direkte Immobilisierung an Hydroxyapatit und die folgende, enzymkatalysierte Synthese von Biosilikat-Beschichtungen auf diesem Träger. Die Eigenschaften eines solchen HA-Kompositmaterials können zum Beispiel zu einem verbesserten, schnelleren und stabileren Einwachsen von Knochenimplantaten führen, da Biosilikat die Reifung und Differenzierung von Osteoblasten beschleunigt. rnMit dem an Hydroxyapatit-Plättchen immobilisierten Glu-tag-Silicatein wurde ein modifizierter Pull-down Assay etabliert, wodurch bekannte, aber auch bis dahin noch unbekannte Protein-Interaktionspartner identifiziert werden konnten. rnUm zu zeigen, dass der entwickelte Glu-tag an präformierte, calciumhaltige Oberflächen binden kann, wurden die Nadeln des Kalkschwammes Paraleucilla magna als Modellorganismus verwendet. Die Nadeln konnten durch das immobilisierte Silicatein mit einer Titandioxid-Schicht überzogen werden und unter Verwendung des Interaktionspartners Silintaphin-1 konnte diese Beschichtung noch verstärkt werden. Solche CaCO3-Kompositmaterialien könnten sowohl in der Biomedizin als auch in der Biotechnologie zum Einsatz kommen. Neben den erwähnten calciumhaltigen Materialien finden auch andere Stoffe wie TiO2-Nanodrähte Verwendung in der Forschung. In weiterführenden Experimenten konnte gezeigt werden, dass der entwickelte Glu-tag auch Affinität zu Titandioxid-Oberflächen vermittelt. Auch hier konnte durch das oberflächenimmobilisierte Enzym eine Biosilikatbeschichtung synthetisiert werden. rnMit der zweiten Modifikation - einem Cys-tag - konnte Silicatein direkt auf Goldoberflächen immobilisiert werden. Durch die Verwendung eines Polydimethylsiloxan (PDMS)-Stempels wurde das Cys-getaggte Silicatein in einem linienförmigen Muster auf das Gold übertragen und die Synthese von Titandioxid dort nachgewiesen.rnDie Experimente und Ergebnisse dieser Arbeit haben gezeigt, dass Silicatein α durch einfache Modifikationen an verschiedene Oberflächen immobilisiert werden kann und dabei immer noch seine Aktivität behält. rnHierdurch ergibt sich die Möglichkeit, unter Normalbedingungen verschiedenste Kompositmaterialien herzustellen.rn

Pathogenetische Bedeutung der Glutathionperoxidase-1 in der arteriellen Gefäßwand

Die antioxidative Aktivität des Enzyms Glutathionperoxidase-1 (GPx-1) schützt vor Atherosklerose und ihren Folgeerkrankungen. In einer Vorstudie konnten wir zeigen, dass der Mangel an GPx-1 die Atheroskleroseentwicklung in Apolipoprotein E defizienten (ApoE-/-) Mäusen beschleunigt und modifiziert. Allerdings sind die Verteilung der GPx-1 in atherosklerotischen Läsionen und die Mechanismen für den erhöhten Makrophagengehalt in der Läsion noch nicht geklärt. Deshalb haben wir (1) die in-situ Expression der GPx-Isoformen in atherosklerotischen Läsionen von GPx-1-/-ApoE-/- und ApoE-/- Mäusen und (2) den Einfluss der GPx-1 Defizienz auf die Schaumzellbildung und Proliferation der Peritonealmakrophagen in ApoE-/- Mäusen untersucht. Die GPx-1-/-ApoE-/- und ApoE-/- Weibchen wurden für 6 und 12 Wochen auf einer atherogenen „Western-type“ Diät gehalten. Die in situ-Hybridisierung zeigte, dass die verschiedenen Isoformen der GPx (GPx-1, GPx-3, GPx-4) vorwiegend in Makrophagen, nicht jedoch in glatten Muskelzellen der atherosklerotischen Läsionen von ApoE-/- Mäusen exprimiert wurden. Für die in vitro Untersuchungen wurden 5 Monate alte, GPx-1 defiziente und Wildtyp-Mäuse, gehalten auf Normaldiät, verwendet. Die Öl-Rot-O Färbung zeigte, dass die GPx-1 Defizienz die OxLDL (oxidiertes LDL) - und E-LDL (enzymatisch modifiziertes LDL) - induzierte Schaumzellbildung förderte. Darüber hinaus war die OxLDL-induzierte Cholesterinakkumulation (zellulärer Cholesterinester/ Cholesterin-Gehalt) in GPx-1 defizienten Makrophagen verstärkt, sodass ein Mangel an GPx-1 die Aufnahme von OxLDL durch Monozyten und damit die Umwandlung in Schaumzellen beschleunigt. Hinsichtlich der Proliferation zeigte sich, dass MCSF (Macrophage Colony-Stimulating Facotr) ein stärkerer Stimulus als OxLDL ist. Ein Mangel an GPx-1 fördert die Proliferation zusätzlich. Daran ist die ERK1/2 (extracellular-signal regulated kinase 1/2) - Kaskade beteiligt, denn es wurde eine schnelle Phosphorylierung der ERK1/2-Kaskade durch MCSF und/oder OxLDL nachgewiesen. Entsprechend reduzieren ERK1/2-Inhibitoren die proliferative Aktivität der Makrophagen. Die Hemmung der p38-MAPK (p38 mitogen-activated protein kinase) führt zur vermehrten Proliferation und bei gleichzeitig verringerter Caspase-3/7 Aktivität der Makrophagen unabhängig von der Expression der GPx-1. Ein Mangel an GPx-1 hat auch keinen Einfluss auf die MCSF-vermittelte Aktivierung der p38-MAPK und JNK (c-Jun N-terminal kinase). Zusammenfassend läßt sich feststellen, dass die GPx-1-Defizienz einen signifikanten Einfluss auf die Schaumzellbildung und Proliferation von Makrophagen hat, was zur Beschleunigung der Atherosklerose und zu vermehrter Zellularität der entstehenden atherosklerotischen Läsionen führt. Die Proliferation wird über den ERK1/2 Signal-transduktionsweg positiv und über den p38-MAPK Weg negativ reguliert, wobei die ERK1/2-Kaskade empfindlich gegenüber oxidativem Stress bei GPx-1-Defizienz ist.

Die Rolle von Myosin 9b und LFA-1 in Dendritischen Zellen für die DC,T-Zellinteraktion und die Induktion einer Immunantwort

In dieser Arbeit wurde zum Einen, die Interaktionsphysiologie zwischen verschiedenen DC-Populationen und naiven sowie regulatorischen T-Zellen analysiert. Dabei wurde die Kontaktdauer und Häufigkeit bestimmt sowie die daraus folgende Aktivierung der T-Zellen in einer 3D-Kollagenmatrix. rnZum zweiten wurde die Rolle des Aktin-Motorproteins Myosin 9b, bei der Zellmigration sowie bei der DC-T-Zellinteraktion und der Ausbildung von Immunantworten untersucht. Myo9b KO DC weisen in vitro in einer Kollagenmatrix sowie in vivo einen gestörten Migrationsphänotyp auf. Auch die Interaktion mit T-Zellen ist verändert und sie induzieren eine reduzierte T-Zellaktivierung in einer 3D-Umgebung sowie eine geringere Immunreaktion in vivo. Die Zugabe pharmakologischer Inhibitoren der Rho-Signalkaskade konnte die Migration und das T-Zellstimulierungspotential wiederherstellen. rnZum Dritten wurde analysiert, welche Bedeutung die konstitutive Aktivierung des Adhäsionsmoleküls LFA-1 auf DC (LFA-1 d/d) hat. LFA-1 d/d DC zeigten verlängerte Interaktionszeiten mit T-Zellen, gefolgt von einer reduzierten T-Zellproliferation in einer Kollagenmatrix. Durch die Inhibition von aktivem LFA-1 auf den DC mittels blockierender Antikörper konnte eine Normalisierung der Interaktionsparameter und T-Zellproliferation auf Wildtyp-Niveau wiederhergestellt werden. Durch ein Ausschalten von CYTIP in WT DC und dem damit einhergehenden Verlust der Deaktivierbarkeit von LFA-1 über Cytohesin wurde ebenfalls eine erhöhte Interaktionszeit mit T-Zellen und eine reduzierte T-Zellproliferation beobachtet.rn

Fine Mapping of qroot-yield-1.06, a QTL for Root, Plant Vigor and Yield in Maize

Root-yield-1.06 is a major QTL affecting root system architecture (RSA) and other agronomic traits in maize. The effect of this QTL has been evaluated with the development of near isogenic lines (NILs) differing at the QTL position. The objective of this study was to fine map qroot-yield-1.06 by marker-assisted searching for chromosome recombinants in the QTL interval and concurrent root phenotyping in both controlled and field conditions, through successive generations. Complementary approaches such as QTL meta-analysis and RNA-seq were deployed in order to help prioritizing candidate genes within the QTL target region. Using a selected group of genotypes, field based root analysis by ‘shovelomics’ enabled to accurately collect RSA information of adult maize plants. Shovelomics combined with software-assisted root imaging analysis proved to be an informative and relatively highly automated phenotyping protocol. A QTL interval mapping was conducted using a segregating population at the seedling stage grown in controlled environment. Results enabled to narrow down the QTL interval and to identify new polymorphic markers for MAS in field experiments. A collection of homozygous recombinant NILs was developed by screening segregating populations with markers flanking qroot-yield-1.06. A first set of lines from this collection was phenotyped based on the adapted shovelomics protocol. QTL analysis based on these data highlighted an interval of 1.3 Mb as completely linked with the target QTL but, a larger safer interval of 4.1 Mb was selected for further investigations. QTL meta-analysis allows to synthetize information on root QTLs and two mQTLs were identified in the qroot-yield-1.06 interval. Trascriptomics analysis based on RNA-seq data of the two contrasting QTL-NILs, confirmed alternative haplotypes at chromosome bin 1.06. qroot-yield-1.06 has now been delimited to a 4.1-Mb interval, and thanks to the availability of additional untested homozygous recombinant NILs, the potentially achievable mapping resolution at qroot-yield-1.06 is c. 50 kb.