Excision of the Staphylococcal Cassette Chromosome mec (SCCmec) and its crucial role in the horizontal transfer of methicillin resistance in staphylococci.

Staphylococcus aureus est un pathogène humain majeur ayant développé des résistances contre la quasi totalité des antibiotiques disponibles, incluant la très importante famille des β- lactamines. La résistance à cette classe d'antibiotiques est conférée par la « Staphylococcal Cassette Chromosome mec » (SCCmec), qui est un élément génétique mobile capable de s'insérer dans le chromosome bactérien et capable d'être transféré horizontalement chez d'autres staphylocoques. Le mécanisme moléculaire impliqué dans ce transfert horizontal demeure largement inconnu. L'une des premières étapes du transfert est l'excision du SCC mec du chromosome bactérien. Cette excision est promue par des enzymes codées par l'élément SCCmec lui- même et appelées de ce fait « Cassette Chromosome Recombinases » (Ccr). L'un des buts de ce travail de thèse a été de comprendre la régulation de l'expression des gènes codant pour les Ccr recombinases. En utilisant des outils moléculaires originaux, nous avons été en mesure de démontrer en premier lieu que les Ccr recombinases étaient exprimées de façon « bistable », c'est à dire qu'uniquement quelques pourcents de cellules dans une population exprimaient ces gènes à un temps donné. Dans un deuxième temps, nous avons également démontré que l'expression de ces gènes était régulée par des facteurs étrangers au SCC mec. L'expression bistable des recombinases est un concept important. Effectivement, cela permet à la majorité des cellules d'une population de conserver l'élément SCC mec, alors que seulement une petite fraction le perd afin de le rendre disponible pour un transfert. Ainsi, alors que l'élément SCC mec continue de se propager avec la multiplication des bactéries Staphylococcus aureus résistant à la méticilline (SARM), il peut être simultanément transmis à des souches susceptibles (Staphylococcus aureus susceptible à la méticilline, SASM), entraînant l'apparition de nouveaux SARM. De façon très intéressante, le fait que cette bistabilité est contrôlée par les bactéries, et non le SCCmec lui-même, montre que la décision de transférer ou non la cassette SCC mec appartient à la bactérie. En conséquence, il doit exister dans la nature des souches qui sont plus ou moins aptes à effectuer ce transfert. En nous appuyant sur ces observations, nous avons montré que l'excision du SCC mec était effectivement régulée de façon très étroite au cours de la division cellulaire, et ne se passait que pendant un temps limité au début de la croissance. Ce résultat est compatible avec une régulation génétique commandée par la densité cellulaire, qui pourrait être dépendante de la production de signaux extracellulaires, du type que l'on rencontre dans le quorum sensing. Les signaux hypothétiques entraînant l'excision du SCC mec restent inconnus à l'heure actuelle. La connaissance de ces signaux pourrait se révéler très importante afin de développer des stratégies pour interférer avec la dissémination de la résistance au β-lactamines. Deux sujets additionnels ont été logiquement investigués au vu de ces premiers résultats. Premièrement, si certaines souches de SARM sont plus ou moins aptes à déclencher l'excision du SCC mec, de même certaines souches de SASM devraient être plus ou moins aptes à acquérir cet élément. Deuxièmement, afin d'étudier ces mécanismes de transfert au niveau épidémiologique, il nous a été nécessaire de développer des outils nous permettant d'explorer le phénomène à une plus large échelle. Concernant le premier point, il a été postulé que certains SASM seraient réfractaires à l'intégration génomique d'un SCC mec en raison de polymorphismes particuliers à proximité du site d'insertion chromosomique (attB). En étudiant plus de 40 isolais de S. aureus, provenant de porteurs sains, nous avons confirmé ce polymorphisme dans l'environnement à'attB. De plus, nous avons pu montrer que ces régions polymorphiques ont évolué parallèlement à des groupes phylogénétiques bien connus. Ainsi, si des telles régions réfractaires à l'intégration de SCC mec existent, celles-ci devraient ségréger dans des complexes clonaux bien définis qui devraient être facilement identifiables au niveau épidémiologique. Concernant le second point, nous avons été capables de construire un système rapporteur de l'excision du SCCmec, en utilisant un plasmide à faible copie. Ce système consistait en un promoteur fort et un gène codant pour une protéine verte fluorescente (GFP) sous le contrôle d'un promoteur fort séparés à l'aide d'un élément SCC artificiel portant trois terminateurs de transcription. Ainsi, la fluorescence ne s'exprime que si l'élément SCC est excisé du plasmide. Ce système a été testé avec succès dans plusieurs types de staphylocoques, et est actuellement évalué dans d'autres souches et conditions stimulant ou inhibant l'excision. De manière générale, cette dissertation représente parcours scientifique à travers plusieurs aspects d'un problème de santé publique majeur en rapport avec la résistance bactérienne aux antibiotiques. Ce travail s'attaque à des problèmes fondamentaux concernant le transfert horizontal de l'élément SCC mec. De plus, il s'intéresse à des aspects plus généraux de cet élément génétique mobile qui pourraient se révéler très importants en terme de mouvement de gènes au sein des staphylocoques, voir d'autres bactéries gram-positives. Finalement ce travail de thèse met en place le fondamentaux requis pour des recherches futures visant à interférer avec le transfert horizontal de la résistance aux β-lactamines. - Staphylococcus aureus is a major human pathogen. Moreover, S. aureus have developed resistance to almost all available antibiotics, including the important family of β-lactam molecules. Intrinsic resistance to β-lactams is conferred by the Staphylococcal Cassette Chromosome mec (SCCmec), which is a mobile genomic island that inserts into the staphylococcal chromosome and can be horizontally transferred into other staphylococci. However, little is known about the molecular mechanisms involved in this horizontal transfer into naïve strains. One of the first steps in SCC mec horizontal transfer is its excision from the chromosome. Excision is mediated by recombinase enzymes that are encoded by SCC mec itself, and named accordingly Ccr recombinases - for Cassette Chromosome recombinases. One goal of this thesis was to understand the regulation these recombinase genes. By using original molecular tools we could demonstrate first that the Ccr recombinases were expressed in a "bistable" manner, i.e. in only few percentages of the bacterial cells at a given time, and second that they were regulated by determinants that were not encoded on the SCC mec element, but elsewhere on the staphylococcal genome. "Bistable" expression Ccr recombinases is an important concept. It allows SCC mec to be excised and thus available for horizontal transfer, while ensuring that only some cells, but not the whole population, loose their valuable SCC mec genes. Thus, while the SCC mec element expands with the multiplication of the MRSA colony, it can simultaneously be transmitted into methicillin-susceptible S. aureus (MSSA), which convert into new MRSA. Most interestingly, the fact that bistability was regulated by the cells, rather than by SCC mec, indicates that it was the choice of the bacteria to trigger or not SCC mec transfer. As a consequence, there must be, in nature, staphylococcal strains that are more or less prone to sustain SCC mec transfer. Following these seminal observations we found that excision was indeed tightly regulated during bacterial division, and occurred only during a limited period of time at the beginning of bacterial growth. This is compatible with cell-density mediated gene regulation, and may depend on the production of extracellular signal molecules that transmit appropriate orders to neighboring cells, such as in quorum sensing. The potential signal triggering SCCmec excision is as yet unknown. However, it could be critical in promoting the horizontal transfer of methicillin resistance, or for the possible development of means to interfere with it. Two additional hypothesis were logically investigated in the view of these first results. First, if some strains of MRSA might be more prone than others to promote SCC mec excision, then some strains of MS SA might be more or less prone to acquire the element as well. Second, to investigate these multiple mechanisms at an epidemiological level, one would need to develop tools amenable to explore S. aureus strains at a larger scale. Regarding the first issue, it was postulated by others that some MSSA might be refractory to SCC mec integration because they had peculiar DNA polymorphisms in the vicinity of the site-specific chromosomal entry point {attB) of SCC mec. By studying >40 S. aureus isolates from healthy carriers, we confirmed the polymorphism of the attB environment. Moreover, we could show that these polymorphic regions co-evolved with well-known phylogenic clonal clusters. Therefore, if SCCwec-refractory attB environments exist, then they would segregate in well- defined S. aureus clonal clusters that would be easy to identify at the epidemiological level. Regarding the second issue, we were able to construct a new excision reporter system in a low copy number S. aureus plasmid. The reporter system consists in a strong promoter driving a green fluorescent protein {gfp) gene, separated by an artificial SCC-like element carrying three transcriptional terminators. Thus, fluorescence is not expressed unless the SCC-like element is excised. The system has been successfully tested in several aureus and non- aureus staphylococci, and is now being applied to more strains and various excision- triggering or inhibiting conditions. Altogether the dissertation is a scientific journey through various aspects of a salient medical problem with regard to antibiotic resistance and public health threat. The research work tackles fundamental issues about the mechanisms of horizontal transfer of the SCC mec element. Moreover, it also addresses more general features of this mobile element, which could be of larger importance with regard to gene trafficking in staphylococci, and maybe other gram-positive bacteria. Finally, the dissertation sets the fundamentals for future work and possible new ways to interfere with the horizontal transfer of methicillin resistance.

Le rôle de l'infirmière de pratique avancée dans la gestion de la douleur

Les Conférences de l'IUFRS, Institut Universitaire de formation et de recherche en soins, Lausanne, Suisse, juin 2011

Formation continue: comment concilier devoir et besoins [Continuing education: how to reconcile needs and wants]

La formation continue fait à l'évidence partie intégrante de la vie du médecin, elle est non seulement un devoir éthique envers les patients mais également l'expression du besoin de se maintenir «à la page» dans sa pratique quotidienne, conséquence des progrès rapides en médecine, particulièrement en oncologie médicale. Elle peut être également source de plaisir quand il s'agit d'accroître ses connaissances. Ses règles minimales ont été définies depuis plusieurs années par la FMH qui délègue aux sociétés de disciplines son application pratique. En 2008, une révision nécessaire pour différentes raisons a facilité le calcul des crédits. Même si le total des heures de formation est resté le même (50 crédits), il a été partagé par deux : 25 pour la formation spécifique et 25 qui peuvent être acquis dans une autre discipline (révision de mars 2009 du Règlement pour la formation continue, art. 5a). Cette révision n'a pas réjoui toutes les sociétés de spécialistes qui gardent la faculté de revoir à la hausse le minimum jugé nécessaire à leur discipline. La quantité des offres de formation continue pour les médecins pose le problème d'être proprement pléthorique (congrès nationaux et internationaux, e-learning, symposiums locaux, etc.), il n'en va pas de même de leur qualité. Dans le domaine de l'oncologie médicale, les offres sont abondantes dans un contexte de marketing évident : les maisons pharmaceutiques parrainent des réunions avec un orateur mercenaire, prestigieux si possible, invité à vanter un produit spécifique dans un cycle de présentations en différents lieux de Romandie (avec à chaque fois, la possibilité d'inscrire des crédits à l'actif des participants)... Elles soutiennent également, par leur logistique, de miniconférences organisées par les différentes institutions locales et auxquelles les médecins ne participent que de façon sporadique vu leur intérêt souvent très secondaire - il n'est pas rare que l'auditoire médical se résume à cinq ou dix participants. Au final, ces offres dispersées et de qualité discutable monopolisent les ressources qui se raréfient rapidement dans le contexte économique actuel et qui doivent impérativement être utilisées de manière plus judicieuse, notamment en évitant les manifestations répétitives. Devant toutes ces offres, il est souvent difficile pour la société de discipline de séparer le bon grain de l'ivraie et en conséquence d'attribuer de manière objective les crédits de formation. Partant de ce constat, un petit groupe romand de médecins oncologues praticiens installés et des centres universitaires ont réfléchi à l'idée de regrouper au sein d'une seule structure romande l'organisation d'une formation continue qui réponde à la fois aux besoins et à l'exigence de qualité. Ses tâches sont multiples : mettre sur pied annuellement plusieurs demi-journées de formation, préaviser avec un comité scientifique de la qualité de la formation continue distillée sur son territoire de compétence (sans empiéter sur les prérogatives de la commission pour la formation postgraduée de la Société suisse d'oncologie médicale - SSOM) en rapprochant les centres universitaires, les hôpitaux cantonaux et régionaux, et les praticiens. Ainsi est née l'association FoROMe (Formation romande en oncologie médicale). Sa légitimité a été établie par la SSOM et par le Comité pour la formation postgraduée et continue (nouvellement SIWF) de la FMH. Elle est maintenant en mesure de mettre en application les tâches pour lesquelles elle a été constituée. Il est évident que cela n'ira pas sans résistance et que certains diront qu'ils ne voient pas la nécessité d'une structure supplémentaire, que les sociétés de disciplines font très bien leur travail, qu'il s'agit encore là d'une atteinte à la liberté. Cependant les nécessités économiques vont tôt ou tard venir au secours de la logique pour confirmer les changements que cette démarche a permis d'anticiper. A l'avenir, il s'agira d'assurer le bien-fondé de cette initiative et de rester vigilant au bon fonctionnement de cette structure à la satisfaction de nos membres.

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Cette contribution a pour objectif d'analyser dans quelle mesure la mise en oeuvre de la politique publique d'éducation (en Suisse) est compatible - ou incompatible - avec la politique conjoncturelle . Elle vise à mettre en évidence le lien - ou l'absence de lien - entre les réformes implémentées depuis les années 1970 dans le système éducatif et l'évolution conjoncturelle. En d'autres termes, elle cherche à déterminer si la mise en oeuvre des réformes éducationnelles a pu avoir une influence pro ou anti-cyclique sur la conjoncture.

System-level Support for Mobile Ad hoc Communications: an Algorithmic & Practical Approach

A mobile ad hoc network (MANET) is a decentralized and infrastructure-less network. This thesis aims to provide support at the system-level for developers of applications or protocols in such networks. To do this, we propose contributions in both the algorithmic realm and in the practical realm. In the algorithmic realm, we contribute to the field by proposing different context-aware broadcast and multicast algorithms in MANETs, namely six-shot broadcast, six-shot multicast, PLAN-B and ageneric algorithmic approach to optimize the power consumption of existing algorithms. For each algorithm we propose, we compare it to existing algorithms that are either probabilistic or context-aware, and then we evaluate their performance based on simulations. We demonstrate that in some cases, context-aware information, such as location or signal-strength, can improve the effciency. In the practical realm, we propose a testbed framework, namely ManetLab, to implement and to deploy MANET-specific protocols, and to evaluate their performance. This testbed framework aims to increase the accuracy of performance evaluation compared to simulations, while keeping the ease of use offered by the simulators to reproduce a performance evaluation. By evaluating the performance of different probabilistic algorithms with ManetLab, we observe that both simulations and testbeds should be used in a complementary way. In addition to the above original contributions, we also provide two surveys about system-level support for ad hoc communications in order to establish a state of the art. The first is about existing broadcast algorithms and the second is about existing middleware solutions and the way they deal with privacy and especially with location privacy. - Un réseau mobile ad hoc (MANET) est un réseau avec une architecture décentralisée et sans infrastructure. Cette thèse vise à fournir un support adéquat, au niveau système, aux développeurs d'applications ou de protocoles dans de tels réseaux. Dans ce but, nous proposons des contributions à la fois dans le domaine de l'algorithmique et dans celui de la pratique. Nous contribuons au domaine algorithmique en proposant différents algorithmes de diffusion dans les MANETs, algorithmes qui sont sensibles au contexte, à savoir six-shot broadcast,six-shot multicast, PLAN-B ainsi qu'une approche générique permettant d'optimiser la consommation d'énergie de ces algorithmes. Pour chaque algorithme que nous proposons, nous le comparons à des algorithmes existants qui sont soit probabilistes, soit sensibles au contexte, puis nous évaluons leurs performances sur la base de simulations. Nous montrons que, dans certains cas, des informations liées au contexte, telles que la localisation ou l'intensité du signal, peuvent améliorer l'efficience de ces algorithmes. Sur le plan pratique, nous proposons une plateforme logicielle pour la création de bancs d'essai, intitulé ManetLab, permettant d'implémenter, et de déployer des protocoles spécifiques aux MANETs, de sorte à évaluer leur performance. Cet outil logiciel vise à accroître la précision desévaluations de performance comparativement à celles fournies par des simulations, tout en conservant la facilité d'utilisation offerte par les simulateurs pour reproduire uneévaluation de performance. En évaluant les performances de différents algorithmes probabilistes avec ManetLab, nous observons que simulateurs et bancs d'essai doivent être utilisés de manière complémentaire. En plus de ces contributions principales, nous fournissons également deux états de l'art au sujet du support nécessaire pour les communications ad hoc. Le premier porte sur les algorithmes de diffusion existants et le second sur les solutions de type middleware existantes et la façon dont elles traitent de la confidentialité, en particulier celle de la localisation.

Negative impact of hypocaloric feeding and energy balance on clinical outcome in ICU patients

Résumé Introduction : Les patients nécessitant une prise en charge prolongée en milieu de soins intensifs et présentant une évolution compliquée, développent une réponse métabolique intense caractérisée généralement par un hypermétabolisme et un catabolisme protéique. La sévérité de leur atteinte pathologique expose ces patients à la malnutrition, due principalement à un apport nutritionnel insuffisant, et entraînant une balance énergétique déficitaire. Dans un nombre important d'unités de soins intensifs la nutrition des patients n'apparaît pas comme un objectif prioritaire de la prise en charge. En menant une étude prospective d'observation afin d'analyser la relation entre la balance énergétique et le pronostic clinique des patients avec séjours prolongés en soins intensifs, nous souhaitions changer cette attitude et démonter l'effet délétère de la malnutrition chez ce type de patient. Méthodes : Sur une période de 2 ans, tous les patients, dont le séjour en soins intensifs fut de 5 jours ou plus, ont été enrôlés. Les besoins en énergie pour chaque patient ont été déterminés soit par calorimétrie indirecte, soit au moyen d'une formule prenant en compte le poids du patient (30 kcal/kg/jour). Les patients ayant bénéficié d'une calorimétrie indirecte ont par ailleurs vérifié la justesse de la formule appliquée. L'âge, le sexe le poids préopératoire, la taille, et le « Body mass index » index de masse corporelle reconnu en milieu clinique ont été relevés. L'énergie délivrée l'était soit sous forme nutritionnelle (administration de nutrition entérale, parentérale ou mixte) soit sous forme non-nutritionnelle (perfusions : soluté glucosé, apport lipidique non nutritionnel). Les données de nutrition (cible théorique, cible prescrite, énergie nutritionnelle, énergie non-nutritionnelle, énergie totale, balance énergétique nutritionnelle, balance énergétique totale), et d'évolution clinique (nombre des jours de ventilation mécanique, nombre d'infections, utilisation des antibiotiques, durée du séjour, complications neurologiques, respiratoires gastro-intestinales, cardiovasculaires, rénales et hépatiques, scores de gravité pour patients en soins intensifs, valeurs hématologiques, sériques, microbiologiques) ont été analysées pour chacun des 669 jours de soins intensifs vécus par un total de 48 patients. Résultats : 48 patients de 57±16 ans dont le séjour a varié entre 5 et 49 jours (motif d'admission : polytraumatisés 10; chirurgie cardiaque 13; insuffisance respiratoire 7; pathologie gastro-intestinale 3; sepsis 3; transplantation 4; autre 8) ont été retenus. Si nous n'avons pu démontrer une relation entre la balance énergétique et plus particulièrement, le déficit énergétique, et la mortalité, il existe une relation hautement significative entre le déficit énergétique et la morbidité, à savoir les complications et les infections, qui prolongent naturellement la durée du séjour. De plus, bien que l'étude ne comporte aucune intervention et que nous ne puissions avancer qu'il existe une relation de cause à effet, l'analyse par régression multiple montre que le facteur pronostic le plus fiable est justement la balance énergétique, au détriment des scores habituellement utilisés en soins intensifs. L'évolution est indépendante tant de l'âge et du sexe, que du status nutritionnel préopératoire. L'étude ne prévoyait pas de récolter des données économiques : nous ne pouvons pas, dès lors, affirmer que l'augmentation des coûts engendrée par un séjour prolongé en unité de soins intensifs est induite par un déficit énergétique, même si le bon sens nous laisse penser qu'un séjour plus court engendre un coût moindre. Cette étude attire aussi l'attention sur l'origine du déficit énergétique : il se creuse au cours de la première semaine en soins intensifs, et pourrait donc être prévenu par une intervention nutritionnelle précoce, alors que les recommandations actuelles préconisent un apport énergétique, sous forme de nutrition artificielle, qu'à partir de 48 heures de séjour aux soins intensifs. Conclusions : L'étude montre que pour les patients de soins intensifs les plus graves, la balance énergétique devrait être considérée comme un objectif important de la prise en charge, nécessitant l'application d'un protocole de nutrition précoce. Enfin comme l'évolution à l'admission des patients est souvent imprévisible, et que le déficit s'installe dès la première semaine, il est légitime de s'interroger sur la nécessité d'appliquer ce protocole à tous les patients de soins intensifs et ceci dès leur admission. Summary Background and aims: Critically ill patients with complicated evolution are frequently hypermetabolic, catabolic, and at risk of underfeeding. The study aimed at assessing the relationship between energy balance and outcome in critically ill patients. Methods: Prospective observational study conducted in consecutive patients staying 5 days in the surgical ICU of a University hospital. Demographic data, time to feeding, route, energy delivery, and outcome were recorded. Energy balance was calculated as energy delivery minus target. Data in means+ SD, linear regressions between energy balance and outcome variables. Results: Forty eight patients aged 57±16 years were investigated; complete data are available in 669 days. Mechanical ventilation lasted 11±8 days, ICU stay 15+9 was days, and 30-days mortality was 38%. Time to feeding was 3.1 ±2.2 days. Enteral nutrition was the most frequent route with 433 days. Mean daily energy delivery was 1090±930 kcal. Combining enteral and parenteral nutrition achieved highest energy delivery. Cumulated energy balance was between -12,600+ 10,520 kcal, and correlated with complications (P<0.001), already after 1 week. Conclusion: Negative energy balances were correlated with increasing number of complications, particularly infections. Energy debt appears as a promising tool for nutritional follow-up, which should be further tested. Delaying initiation of nutritional support exposes the patients to energy deficits that cannot be compensated later on.

Data-driven clustering : new methods and applications

Abstract : This work is concerned with the development and application of novel unsupervised learning methods, having in mind two target applications: the analysis of forensic case data and the classification of remote sensing images. First, a method based on a symbolic optimization of the inter-sample distance measure is proposed to improve the flexibility of spectral clustering algorithms, and applied to the problem of forensic case data. This distance is optimized using a loss function related to the preservation of neighborhood structure between the input space and the space of principal components, and solutions are found using genetic programming. Results are compared to a variety of state-of--the-art clustering algorithms. Subsequently, a new large-scale clustering method based on a joint optimization of feature extraction and classification is proposed and applied to various databases, including two hyperspectral remote sensing images. The algorithm makes uses of a functional model (e.g., a neural network) for clustering which is trained by stochastic gradient descent. Results indicate that such a technique can easily scale to huge databases, can avoid the so-called out-of-sample problem, and can compete with or even outperform existing clustering algorithms on both artificial data and real remote sensing images. This is verified on small databases as well as very large problems. Résumé : Ce travail de recherche porte sur le développement et l'application de méthodes d'apprentissage dites non supervisées. Les applications visées par ces méthodes sont l'analyse de données forensiques et la classification d'images hyperspectrales en télédétection. Dans un premier temps, une méthodologie de classification non supervisée fondée sur l'optimisation symbolique d'une mesure de distance inter-échantillons est proposée. Cette mesure est obtenue en optimisant une fonction de coût reliée à la préservation de la structure de voisinage d'un point entre l'espace des variables initiales et l'espace des composantes principales. Cette méthode est appliquée à l'analyse de données forensiques et comparée à un éventail de méthodes déjà existantes. En second lieu, une méthode fondée sur une optimisation conjointe des tâches de sélection de variables et de classification est implémentée dans un réseau de neurones et appliquée à diverses bases de données, dont deux images hyperspectrales. Le réseau de neurones est entraîné à l'aide d'un algorithme de gradient stochastique, ce qui rend cette technique applicable à des images de très haute résolution. Les résultats de l'application de cette dernière montrent que l'utilisation d'une telle technique permet de classifier de très grandes bases de données sans difficulté et donne des résultats avantageusement comparables aux méthodes existantes.