Évaluation d’une intervention infirmière basée sur une approche caring et cognitive comportementale sur l’acceptation d’un défibrillateur cardiaque implantable

Le taux de mortalité chez les patients à risque d’arythmies cardiaques menaçantes à la vie a été considérablement réduit grâce au défibrillateur cardiaque implantable (DCI). Toutefois, des préoccupations uniques face au DCI, y compris les chocs que l’appareil peut déclencher, sont susceptibles de provoquer des symptômes d'anxiété et une limitation perçue des activités chez les porteurs de DCI. Ces réactions émotives et modifications de comportement peuvent affecter l’acceptation du patient envers le DCI. Cette étude pilote randomisée avec groupe contrôle (n=15 /groupe) visait à examiner la faisabilité et l'acceptabilité d'une intervention infirmière individualisée de même que ses effets préliminaires sur l’anxiété, le fonctionnement dans les activités de la vie quotidienne et l’acceptation du DCI auprès de nouveaux porteurs de DCI. L'intervention infirmière, basée sur la théorie du Human Caring et teintée d’une approche cognitive comportementale, ciblait les préoccupations individuelles face au DCI. À partir des préoccupations identifiées, l’infirmière intervenait en mettant l'accent sur les croyances contraignantes du patient, qui pouvaient mener à de l’anxiété et des comportements d'évitement. Après randomisation, les patients du groupe intervention (GI) ont participé à un premier entretien en face-à-face avant le congé hospitalier. Subséquemment, deux entretiens se sont faits par téléphone, à environ 7 et 14 jours suite au congé hospitalier. Les résultats soutiennent la faisabilité et l’acceptabilité du devis de l’étude et de l’intervention évaluée. De plus, ils soulignent le potentiel de l’intervention à diminuer les sentiments anxieux chez les participants du GI. Les résultats de cette étude pilote offrent des pistes de recherches futures et permettront de guider la pratique clinique.

Le peptide natriurétique auriculaire induit la différenciation cardiaque dans les cellules souches embryonnaires carcinomateuses de souris P19

Traditionnellement associée à la reproduction féminine, l'ocytocine (OT), une hormone peptidique synthétisée par les noyaux paraventriculaire et supraoptique de l'hypothalamus et sécrétée par l'hypophyse postérieure (neurohypophyse), a été récemment revue et a été démontrée avoir plusieurs nouveaux rôles dans le système cardio-vasculaire. En effet, notre laboratoire a montré que l’OT peut induire la différenciation des cellules souches embryonnaires (CSE) en cardiomyocytes (CM) fonctionnels. À l’aide du modèle cellulaire embryonnaire carcinomateux de souris P19, il a été démontré que ce processus survenait suite à la libération de la guanosine monophosphate cyclique (GMPc) dépendante du monoxyde d’azote. De même, il est connu que le peptide natriurétique auriculaire (ANP), un peptide produit, stocké et sécrété par les myocytes cardiaques, peut aussi induire la production du GMPc. De nombreuses études ont démontré que le cœur ayant subi un infarctus pouvait être régénéré à partir d’une population isolée de cellules souches et progénitrices transplantées. Une de ces populations de cellules, fréquemment isolées à partir d'organes provenant d'animaux aux stades de développement embryonnaire et adulte, appelée « Side Population » (SP), sont identifiées par cytométrie en flux (FACS) comme une population de cellules non marquées par le colorant fluorescent Hoechst 33342 (Ho). Les cellules SP expriment des protéines de transport spécifiques, de la famille ATP-binding cassette, qui ont pour rôle de transporter activement le colorant fluorescent Ho de leur cytoplasme. La sous-population de cellules SP isolée du cœur affiche un potentiel de différenciation cardiaque amélioré en réponse à un traitement avec l’OT. Récemment, l'hétérogénéité phénotypique et fonctionnelle des CSE a été mise en évidence, et cela a été corrélé avec la présence de sous-populations cellulaires ressemblant beaucoup aux cellules SP issues du cœur. Puisque l’ANP peut induire la production du GMPc et qu’il a été démontré que la différenciation cardiaque était médiée par la production du GMPc, alors nous émettons l'hypothèse selon laquelle l’ANP pourrait induire la différenciation cardiaque. Étant donné que les CSE sont composés d’un mélange de différents types cellulaires alors nous émettons aussi l’hypothèse selon laquelle l’utilisation d’une sous-population de CSE plus homogène renforcerait le potentiel de différenciation de l'ANP. Méthodes : Les SP ont été isolées des cellules P19 par FACS en utilisant la méthode d’exclusion du colorant fluorescent Ho. Puis, leur phénotype a été caractérisé par immunofluorescence (IF) pour les marqueurs de l’état indifférencié, d’auto-renouvellement et de pluripotence octamer-binding transcription factor 4 (OCT4) et stage-specific embryonic antigen-1 (SSEA1). Ensuite, la dose pharmacologique optimale d’ANP a été déterminée via des tests de cytotoxicité sur des cellules P19 (MTT assay). Pour induire la différenciation en cardiomyocytes, des cellules à l’état de sphéroïdes ont été formées à l’aide de la technique du « Hanging-Drop » sous la stimulation de l’ANP pendant 5 jours. Puis, des cryosections ont été faites dans les sphéroïdes afin de mettre en évidence la présence de marqueurs de cellules cardiaques progénitrices tels que GATA4, Nkx2.5 et un marqueur mitochondrial spécifique Tom22. Ensuite, les cellules SP P19 ont été stimulées dans les sphéroïdes cellulaires par le traitement avec de l'ANP (10-7 M) ou de l’OT (10-7 M), de l’antagoniste spécifique du guanylate cyclase particulé (GCp) A71915 (10-6 M), ainsi que la combinaison des inducteurs OT+ANP, OT+A71915, ANP+A71915. Après la mise en culture, la différenciation en cardiomyocytes a été identifié par l’apparition de colonies de cellules battantes caractéristiques des cellules cardiaques, par la détermination du phénotype cellulaire par IF, et enfin par l’extraction d'ARN et de protéines qui ont été utilisés pour le dosage du GMPc par RIA, l’expression des ARNm par RT-PCR et l’expression des protéines par immunobuvardage de type western. Résultats : Les sphéroïdes obtenus à l’aide de la technique du « Hanging-Drop » ont montré une hausse modeste de l’expression des ARNm suivants : OTR, ANP et GATA4 comparativement aux cellules cultivées en monocouches. Les sphéroïdes induits par l’ANP ont présenté une augmentation significative des facteurs de transcription cardiaque GATA4 et Nkx2.5 ainsi qu’un plus grand nombre de mitochondries caractérisé par une plus grande présence de Tom22. De plus, L’ANP a induit l’apparition de colonies de cellules battantes du jour 7 (stade précoce) au jour 14 (stade mature) de façon presque similaire à l’OT. Cependant, la combinaison de l’ANP avec l’OT n’a pas induit de colonies de cellules battantes suggérant un effet opposé à celui de l’OT. Par IF, nous avons quantifié (nombre de cellules positives) et caractérisé, du jour 6 au jour 14 de différenciation, le phénotype cardiaque de nos cellules en utilisant les marqueurs suivants : Troponine T Cardiaque, ANP, Connexines 40 et 43, l’isoforme ventriculaire de la chaîne légère de myosine (MLC-2v), OTR. Les SP différenciées sous la stimulation de l’ANP ont montré une augmentation significative du GMPc intracellulaire comparé aux cellules non différenciées. À notre grande surprise, l’antagoniste A71915 a induit une plus grande apparition de colonies de cellules battantes comparativement à l’OT et l’ANP à un jour précoce de différenciation cardiaque et l’ajout de l’OT ou de l’ANP a potentialisé ses effets, augmentant encore plus la proportion de colonies de cellules battantes. De plus, la taille des colonies de cellules battantes était encore plus importante que sous la simple stimulation de l’OT ou de l’ANP. Les analyses radioimmunologiques dans les cellules SP P19 stimulés avec l’ANP, A71915 et la combinaison des deux pendant 15min, 30min et 60min a montré que l’ANP stimule significativement la production du GMPc, cependant A71915 n’abolit pas les effets de l’ANP et celui-ci au contraire stimule la production du GMPc via des effets agonistes partiels. Conclusion : Nos résultats démontrent d’une part que l’ANP induit la différenciation des cellules SP P19 en CM fonctionnels. D’autre part, il semblerait que la voie de signalisation NPRA-B/GCp/GMPc soit impliquée dans le mécanisme de différenciation cardiaque puisque l’abolition du GMPc médiée par le GCp potentialise la différenciation cardiaque et il semblerait que cette voie de signalisation soit additive de la voie de signalisation induite par l’OT, NO/GCs/GMPc, puisque l’ajout de l’OT à l’antagoniste A71915 stimule plus fortement la différenciation cardiaque que l’OT ou l’A71915 seuls. Cela suggère que l’effet thérapeutique des peptides natriurétiques observé dans la défaillance cardiaque ainsi que les propriétés vasodilatatrices de certains antagonistes des récepteurs peptidiques natriurétiques inclus la stimulation de la différenciation des cellules souches en cardiomyocytes. Cela laisse donc à penser que les peptides natriurétiques ou les antagonistes des récepteurs peptidiques natriurétiques pourraient être une alternative très intéressante dans la thérapie cellulaire visant à induire la régénération cardiovasculaire.

Mechanism and Prediction of Post-Operative Atrial Fibrillation Based on Atrial Electrograms

La fibrillation auriculaire (FA) est une arythmie touchant les oreillettes. En FA, la contraction auriculaire est rapide et irrégulière. Le remplissage des ventricules devient incomplet, ce qui réduit le débit cardiaque. La FA peut entraîner des palpitations, des évanouissements, des douleurs thoraciques ou l’insuffisance cardiaque. Elle augmente aussi le risque d'accident vasculaire. Le pontage coronarien est une intervention chirurgicale réalisée pour restaurer le flux sanguin dans les cas de maladie coronarienne sévère. 10% à 65% des patients qui n'ont jamais subi de FA, en sont victime le plus souvent lors du deuxième ou troisième jour postopératoire. La FA est particulièrement fréquente après une chirurgie de la valve mitrale, survenant alors dans environ 64% des patients. L'apparition de la FA postopératoire est associée à une augmentation de la morbidité, de la durée et des coûts d'hospitalisation. Les mécanismes responsables de la FA postopératoire ne sont pas bien compris. L'identification des patients à haut risque de FA après un pontage coronarien serait utile pour sa prévention. Le présent projet est basé sur l'analyse d’électrogrammes cardiaques enregistrées chez les patients après pontage un aorte-coronaire. Le premier objectif de la recherche est d'étudier si les enregistrements affichent des changements typiques avant l'apparition de la FA. Le deuxième objectif est d'identifier des facteurs prédictifs permettant d’identifier les patients qui vont développer une FA. Les enregistrements ont été réalisés par l'équipe du Dr Pierre Pagé sur 137 patients traités par pontage coronarien. Trois électrodes unipolaires ont été suturées sur l'épicarde des oreillettes pour enregistrer en continu pendant les 4 premiers jours postopératoires. La première tâche était de développer un algorithme pour détecter et distinguer les activations auriculaires et ventriculaires sur chaque canal, et pour combiner les activations des trois canaux appartenant à un même événement cardiaque. L'algorithme a été développé et optimisé sur un premier ensemble de marqueurs, et sa performance évaluée sur un second ensemble. Un logiciel de validation a été développé pour préparer ces deux ensembles et pour corriger les détections sur tous les enregistrements qui ont été utilisés plus tard dans les analyses. Il a été complété par des outils pour former, étiqueter et valider les battements sinusaux normaux, les activations auriculaires et ventriculaires prématurées (PAA, PVA), ainsi que les épisodes d'arythmie. Les données cliniques préopératoires ont ensuite été analysées pour établir le risque préopératoire de FA. L’âge, le niveau de créatinine sérique et un diagnostic d'infarctus du myocarde se sont révélés être les plus importants facteurs de prédiction. Bien que le niveau du risque préopératoire puisse dans une certaine mesure prédire qui développera la FA, il n'était pas corrélé avec le temps de l'apparition de la FA postopératoire. Pour l'ensemble des patients ayant eu au moins un épisode de FA d’une durée de 10 minutes ou plus, les deux heures précédant la première FA prolongée ont été analysées. Cette première FA prolongée était toujours déclenchée par un PAA dont l’origine était le plus souvent sur l'oreillette gauche. Cependant, au cours des deux heures pré-FA, la distribution des PAA et de la fraction de ceux-ci provenant de l'oreillette gauche était large et inhomogène parmi les patients. Le nombre de PAA, la durée des arythmies transitoires, le rythme cardiaque sinusal, la portion basse fréquence de la variabilité du rythme cardiaque (LF portion) montraient des changements significatifs dans la dernière heure avant le début de la FA. La dernière étape consistait à comparer les patients avec et sans FA prolongée pour trouver des facteurs permettant de discriminer les deux groupes. Cinq types de modèles de régression logistique ont été comparés. Ils avaient une sensibilité, une spécificité et une courbe opérateur-receveur similaires, et tous avaient un niveau de prédiction des patients sans FA très faible. Une méthode de moyenne glissante a été proposée pour améliorer la discrimination, surtout pour les patients sans FA. Deux modèles ont été retenus, sélectionnés sur les critères de robustesse, de précision, et d’applicabilité. Autour 70% patients sans FA et 75% de patients avec FA ont été correctement identifiés dans la dernière heure avant la FA. Le taux de PAA, la fraction des PAA initiés dans l'oreillette gauche, le pNN50, le temps de conduction auriculo-ventriculaire, et la corrélation entre ce dernier et le rythme cardiaque étaient les variables de prédiction communes à ces deux modèles.

Identification des bases génétiques des myopathies à multi-minicores avec ou sans cardiomyopathie

Thèse réalisée en cotutelle avec l'Université Pierre et Marie Curie, Paris 6(UPMC, Paris, France).

Optimization Studies to Improve MSC-based Cardiac Cell Therapy : Cytokine Preconditioning and Nanoparticle Coupling

Contexte: La cardiopathie ischémique (IHD) reste une cause majeure de mortalité en Amérique du Nord. La thérapie cellulaire cardiaque (CCT) a émergé comme une thérapie prometteuse pour aider à guérir certaines malades cardiaques. Parmi les cellulaires avec propriétés pluripotentes, les cellules stromales mésenchymateuses (MSC) sont prometteuses. Cependant, plusieurs questions demeurent non résolues et certaines défis empêchent l'application clinique de la CCT se dans l'IHD, tels que le faible taux de rétention cellulaire in situ, le suivi des cellules in vivo post-implantation et post-acheminements et l`apoptose. Ici, le traitement préliminaire des MSC avec des facteurs de croissance et leur couplage avec des nanoparticules (NP) seront étudiés comme des méthodes pour optimiser MSC. Méthodes: Des MSCs provenant du rat (rMSC) et du cochon (pMSC) ont été isolés à partir de moelle osseuse. Les rMSC ont été préconditionnées avec SDF-1a, TSG-6 et PDGF-BB, et ensuite soumises à une hypoxie, une privation de sérum et a un stress oxydatif. Des études de cicatrisation ont également été effectués avec rMSCs préconditionnées. En parallèle, de nouvelles NP ferromagnétiques liées aux silicones ont été synthétisées. Les NPs ont été couplées aux pMSCs suivant leur fonctionnalisation avec l`anticorps, CD44, un antigène de surface du MSC bien connu. Par la suite, les études de biocompatibilité ont été réalisées sur pMSC-NP et en incluant des tests des processus cellulaires tels que la migration, l'adhésion, la prolifération et les propriétés de la différenciation. Résultats: Parmi toutes les cytokines testées, PDGF-BB a démontré la plus grande capacité à améliorer la survie de MSC dans des conditions d'hypoxie, de privation de sérum et en reponse au stress oxydatif. La conjugaison de NP a atténué la migration et la prolifération des pMSCs, mais n`a pas changé leur capacité de différenciation. Enfin, la complexe du MSC-NP est détectable par IRM. Conclusion: Nos données suggèrent que de nouvelles stratégies, telles que traitement préliminaire de PDGF-BB et le couplage des nanoparticules ferromagnétiques, peuvent être considérés comme des avenues prometteuse pour optimiser les MSCs pour la CCT.

The Role of MicroRNA Regulation of Cardiac Ion Channel in Arrhythmia

La fibrillation auriculaire (FA) est le trouble du rythme le plus fréquemment observé en pratique clinique. Elle constitue un risque important de morbi-mortalité. Le traitement de la FA reste un défi majeur en lien avec les nombreux effets secondaires associés aux approches thérapeutiques actuelles. Dans ce contexte, une meilleure compréhension des mécanismes sous-jacents à la FA est essentielle pour le développement de nouvelles thérapies offrant un meilleur rapport bénéfice/risque pour les patients. La FA est caractérisée par i) un remodelage électrique délétère associé le plus souvent ii) à un remodelage structurel du myocarde favorisant la récurrence et le maintien de l’arythmie. La diminution de la période réfractaire effective au sein du tissu auriculaire est un élément clef du remodelage électrique. Le remodelage structurel, quant à lui, se manifeste principalement par une fibrose tissulaire qui altère la propagation de l’influx électrique dans les oreillettes. Les mécanismes moléculaires impliqués dans la mise en place de ces deux substrats restent mal connus. Récemment, le rôle des microARNs (miARNs) a été pointé du doigt dans de nombreuses pathologies notamment cardiaques. Dans ce contexte les objectifs principaux de ce travail ont été i) d'acquérir une compréhension approfondie du rôle des miARNs dans la régulation de l’expression des canaux ioniques et ii) de mieux comprendre le rôle de ces molécules dans l’installation d’un substrat favorable a la FA. Nous avons, dans un premier temps, effectué une analyse bio-informatique combinée à des approches expérimentales spécifiques afin d’identifier clairement les miARNs démontrant un fort potentiel de régulation des gènes codant pour l’expression des canaux ioniques cardiaques humains. Nous avons identifié un nombre limité de miARNs cardiaques qui possédaient ces propriétés. Sur la base de ces résultats, nous avons démontré que l’altération de l'expression des canaux ioniques, observée dans diverse maladies cardiaques (par exemple, les cardiomyopathies, l’ischémie myocardique, et la fibrillation auriculaire), peut être soumise à ces miARNs suggérant leur implication dans l’arythmogénèse. La régulation du courant potassique IK1 est un facteur déterminant du remodelage électrique auriculaire associée à la FA. Les mécanismes moléculaires sous-jacents sont peu connus. Nous avons émis l’hypothèse que l'altération de l’expression des miARNs soit corrélée à l’augmentation de l’expression d’IK1 dans la FA. Nous avons constaté que l’expression de miR-26 est réduite dans la FA et qu’elle régule IK1 en modulant l’expression de sa sous-unité Kir2.1. Nous avons démontré que miR-26 est sous la répression transcriptionnelle du facteur nucléaire des lymphocytes T activés (NFAT) et que l’activité accrue de NFATc3/c4, aboutit à une expression réduite de miR-26. En conséquence IK1 augmente lors de la FA. Nous avons enfin démontré que l’interférence in vivo de miR-26 influence la susceptibilité à la FA en régulant IK1, confirmant le rôle prépondérant de miR-26 dans le remodelage auriculaire électrique. La fibrose auriculaire est un constituant majeur du remodelage structurel associé à la FA, impliquant l'activation des fibroblastes et l’influx cellulaire du Ca2 +. Nous avons cherché à déterminer i) si le canal perméable au Ca2+, TRPC3, jouait un rôle dans la fibrose auriculaire en favorisant l'activation des fibroblastes et ii) étudié le rôle potentiel des miARNs dans ce contexte. Nous avons démontré que les canaux TRPC3 favorisent l’influx du Ca2 +, activant la signalisation Ca2 +-dépendante ERK et en conséquence activent la prolifération des fibroblastes. Nous avons également démontré que l’expression du TRPC3 est augmentée dans la FA et que le blocage in vivo de TRPC3 empêche le développement de substrats reliés à la FA. Nous avons par ailleurs validé que miR-26 régule les canaux TRPC3 en diminuant leur expression dans les fibroblastes. Enfin, nous avons montré que l'expression réduite du miR-26 est également due à l’activité augmentée de NFATc3/c4 dans les fibroblastes, expliquant ainsi l’augmentation de TRPC3 lors de la FA, confirmant la contribution de miR-26 dans le processus de remodelage structurel lié à la FA. En conclusion, nos résultats mettent en évidence l'importance des miARNs dans la régulation des canaux ioniques cardiaques. Notamment, miR-26 joue un rôle important dans le remodelage électrique et structurel associé à la FA et ce, en régulant IK1 et l’expression du canal TRPC3. Notre étude démasque ainsi un mécanisme moléculaire de contrôle de la FA innovateur associant des miARNs. miR-26 en particulier représente apres ces travaux une nouvelle cible thérapeutique prometteuse pour traiter la FA.

Influence de la testostérone sur les paramètres électrocardiographiques des hommes et des femmes

Les hommes et les femmes diffèrent devant la survenue de plusieurs types d’arythmies cardiaques. Ainsi, la prévalence des fibrillations auriculaires, ou celle du syndrome de Brugada est plus élevée chez les hommes, tandis que les femmes sont plus susceptibles de développer des torsades de pointe. La survenue de ces arythmies pourrait être affectée par l’existence de disparités entre les sexes au niveau de l’activité électrique cardiaque normale. Des différences ont d’ailleurs été décrites dans les paramètres électrocardiographiques des hommes et des femmes, et notamment au niveau des paramètres traduisant la phase de repolarisation ventriculaire. Par ailleurs, plusieurs études cliniques et expérimentales ont permis d’avancer que les androgènes pourraient contribuer à expliquer les différences homme-femme observées dans la repolarisation ventriculaire. Leur influence sur les autres paramètres électrocardiographiques a toutefois reçu peu d’attention jusqu’à aujourd’hui. Dans ce contexte, l’objectif de ce travail était de mieux comprendre l’implication de la testostérone dans les différences sexuelles observées au niveau de l’électrocardiogramme. En travaillant à partir d’une cohorte de volontaires sains, nous avons tout d’abord confirmé l’existence de différences électrocardiographiques rapportées précédemment dans la littérature. Nous avons de plus noté un segment PR plus long chez les hommes, bien que l’onde P et l’intervalle PR n’étaient pas significativement différents entre les sexes. Par la suite, nous avons évalué l’association de la testostérone avec les différents paramètres de l’électrocardiogramme humain. La testostérone était le plus fortement associée au complexe QRS, au segment ST et à l’intervalle QTc. Nous avons donc examiné la contribution de la testostérone dans les mécanismes responsables des différences sexuelles pour ces trois paramètres. D’après les résultats obtenus, la testostérone ne semblait toutefois pas expliquer ces différences homme-femme. En conclusion, les résultats de cette étude suggèrent que la testostérone n’est pas responsable des différences observées au niveau du complexe QRS, du segment ST et de l’intervalle QTc des hommes et des femmes de notre cohorte. D’autres médiateurs, seuls ou en association avec la testostérone, pourraient jouer un rôle dans l’établissement de ces différences électrocardiographiques associées au sexe.

Protective signaling of oxytocin in an in vitro model of myocardial ischemia - reperfusion

Introduction : La prévention de la mort de cellules cardiaques contractiles suite à un épisode d'infarctus du myocarde représente le plus grand défi dans la récupération de la fonction cardiaque. On a démontré à maintes reprises que l'ocytocine (OT), l'hormone bien connue pour ses rôles dans le comportement social et reproductif et couramment utilisée dans l’induction de l’accouchement, diminue la taille de l'infarctus et améliore la récupération fonctionnelle du myocarde blessé. Les mécanismes de cette protection ne sont pas totalement compris. Objectif : Étudier les effets d'un traitement avec de l'ocytocine sur des cardiomyocytes isolés en utilisant un modèle in vitro qui simule les conditions d'un infarctus du myocarde. Méthodes : La lignée cellulaire myoblastique H9c2 a été utilisée comme modèle de cardiomyocyte. Pour simuler le dommage d'ischémie-reperfusion (IR), les cellules ont été placées dans un tampon ischémique et incubées dans une chambre anoxique pendant 2 heures. La reperfusion a été accomplie par la restauration du milieu de culture régulier dans des conditions normales d'oxygène. L'OT a été administrée en présence ou en absence d'inhibiteurs de kinases connues pour être impliquées dans la cardioprotection. La mortalité cellulaire a été évaluée par TUNEL et l'activité mitochondriale par la production de formazan pendant 1 à 4 heures de reperfusion. La microscopie confocale a servie pour localiser les structures cellulaires. Résultats : Le modèle expérimental de l'IR dans les cellules H9c2 a été caractérisé par une diminution dans la production de formazan (aux alentours de 50 à 70 % du groupe témoin, p < 0.001) et par l'augmentation du nombre de noyaux TUNEL-positif (11.7 ± 4.5% contre 1.3 ± 0.7% pour le contrôle). L'addition de l'OT (10-7 a 10-9 M) au commencement de la reperfusion a inversé les effets de l'IR jusqu'aux niveaux du contrôle (p < 0.001). L'effet protecteur de l'OT a été abrogé par : i) un antagoniste de l'OT ; ii) le knockdown de l'expression du récepteur à l'OT induit par le siRNA ; iii) la wortmannin, l'inhibiteur de phosphatidylinositol 3-kinases ; iv) KT5823, l'inhibiteur de la protéine kinase dépendante du cGMP (PKG); v) l'ODQ, un inhibiteur du guanylate cyclase (GC) soluble, et A71915, un antagoniste du GC membranaire. L'analyse confocale des cellules traitées avec OT a révélé la translocation du récepteur à l'OT et la forme phosphorylée de l'Akt (Thr 308, p-Akt) dans le noyau et dans les mitochondries. Conclusions : L'OT protège directement la viabilité des cardiomyocytes, lorsqu'elle est administrée au début de la reperfusion, par le déclenchement de la signalisation du PI3K, la phosphorylation de l'Akt et son trafic cellulaire. La cytoprotection médiée par l'OT implique la production de cGMP par les deux formes de GC.

Identification et caractérisation d’une souris mutante Skam26Jus comme un nouveau modèle des anomalies du tube neural

Les anomalies du tube neural (ATN) sont des malformations congénitales très fréquentes chez l’humain en touchant 1-2 nouveau-nés sur 1000 naissances. Elles résultent d’une fermeture incomplète du tube neural lors de l’embryogenèse. L’étiologie des ATN est complexe impliquant des facteurs environnementaux et des facteurs génétiques. La souris représente un outil puissant afin de mieux comprendre la génétique des ATN. Particulièrement, la souris modèle a impliqué fortement la voie de la polarité cellulaire planaire (PCP) dans ces malformations. Dans cette étude, nous avons identifié et caractérisé une nouvelle souris mutante, Skam26Jus dans le but d’identifier un nouveau gène causant les ATN. Skam26Jus a été générée par l’agent mutagène N-Ethyl-N-Nitrosuera. Cette souris est caractérisée par une queue en forme de boucle ou de crochet, soit un phénotype associé aux ATN. La complémentation génétique de la souris Skam26Jus avec une souris mutante d’un gène de la voie PCP Vangl2 (Looptail) a montré une interaction génétique entre le gène muté chez Skam26Jus et Vangl2, suggérant que ces deux gènes fonctionnent dans des voies de signalisation semblables ou parallèles. Un total de 50% des embryons doubles hétérozygotes avec un phénotype de la queue présentent un spina bifida. La cartographie par homozygotie du génome entier suivie par un clonage positionnel a permis d’identifier Lrp6 comme le gène muté chez Skam26Jus. Une mutation homozygote, p.Ile681Arg, a été identifiée dans Lrp6 chez les souris ayant une queue en boucle/crochet. Cette mutation était absente dans 30 souches génétiques pures indiquant que cette mutation est spécifique au phénotype observé. Une étude de phénotype-génotype évalue la pénétrance à 53 % de la mutation Ile681Arg. Lrp6 est connu pour activer la voie canonique Wnt/β-caténine et inhiber la voie non canonique Wnt/PCP. Le séquençage de la région codante et de la jonction exon-intron de LRP6 chez 268 patients a mené à l’identification de quatre nouvelles rares mutations faux sens absentes chez 272 contrôles et de toutes les bases de données publiques. Ces mutations sont p.Tyr306His ; p.Tyr373Cys ; p.Val1386Ile; p.Tyr1541Cys et leur pathogénicité prédite in silico indiquent que p.Val1386Ile est bénigne, et que p.Tyr306Hiset p.Tyr373Cys et p.Tyr1541Cys sont i possiblement dommageables. Les mutations p.Tyr306His, p.Tyr373Cys et p.Tyr1541Cys ont affecté l’habilité de LRP6 d’activer la voie Wnt/β-caténine en utilisant le système rapporteur luciférase de pTOPflash. Nos résultats suggèrent que LRP6 joue un rôle dans le développement des ATN chez une petite fraction de patients ayant une ATN. Cette étude présente aussi Skam26Jus comme un nouveau modèle pour étudier les ATN chez l’humain et fournit un outil important pour comprendre les mécanismes moléculaires à l’origine des A TN.

Functional Analysis of Nuclear beta-Adrenergic Receptors in the Myocardium

Récemment plusieurs récepteurs couplés aux protéines G (RCPGs) ont été caractérisés au niveau des membranes intracellulaires, dont la membrane nucléaire. Notre objectif était de déterminer si les sous-types de récepteurs β-adrénergiques (βAR) et leurs machineries de signalisation étaient fonctionnels et localisés à la membrane nucléaire des cardiomyocytes. Nous avons démontré la présence des β1AR et β3AR, mais pas du β2AR à la membrane nucléaire de myocytes ventriculaires adultes par immunobuvardage, par microscopie confocale, et par des essais fonctionnels. De plus, certains partenaires de signalisation comme les protéines GαS, Gαi, l’adénylate cyclase II, et V/VI y étaient également localisés. Les sous-types de βAR nucléaires étaient fonctionnels puisqu'ils pouvaient lier leurs ligands et activer leurs effecteurs. En utilisant des noyaux isolés, nous avons observé que l'agoniste non-sélectif isoprotérénol (ISO), et que le BRL37344, un ligand sélectif du β3AR, stimulaient l'initiation de la synthèse de l’ARN, contrairement à l'agoniste sélectif du β1AR, le xamotérol. Cette synthèse était abolie par la toxine pertussique (PTX). Cependant, la stimulation des récepteurs nucléaires de type B de l’endothéline (ETB) causaient une réduction de l'initiation de la synthèse d’ARN. Les voies de signalisations impliquées dans la régulation de la synthèse d’ARN par les RCPGs ont ensuite été étudiées en utilisant des noyaux isolés stimulés par des agonistes en présence ou absence de différents inhibiteurs des voies MAP Kinases (proteines kinases activées par mitogènes) et de la voie PI3K/PKB. Les protéines impliquées dans les voies de signalisation de p38, JNK, ERK MAP Kinase et PKB étaient présents dans les noyaux isolés. L'inhibition de PKB par la triciribine, inhibait la synthèse d’ARN. Nous avons ensuite pu mettre en évidence par qPCR que la stimulation par l’ISO entrainait une augmentation du niveau d'ARNr 18S ainsi qu’une diminution de l'expression d’ARNm de NFκB. En contraste, l’ET-1 n’avait aucun effet sur le niveau d’expression de l’ARNr 18S. Nous avons ensuite montré que la stimulation par l’ISO réduisait l’expression de plusieurs gènes impliqués dans l'activation de NFκB, tandis que l’inhibition de ERK1/2 et PKB renversait cet effet. Un microarray global nous a ensuite permis de démontrer que les βARs et les ETRs nucléaires régulaient un grand nombre de gènes distincts. Finalement, les βARs et ETRs nucléaires augmentaient aussi une production de NO de noyaux isolés, ce qui pouvait être inhibée par le LNAME. Ces résultats ont été confirmés dans des cardiomyocytes intacts en utilisant des analogues cagés et perméables d’ISO et de l'ET-1: l'augmentation de NO nucléaire détectée par DAF2-DA, causée par l'ET-1 et l'ISO, pouvait être prévenue par le LNAME. Finalement, l’augmentation de l’initiation de la transcription induite par l'ISO était aussi bloquée par le L-NAME ou par un inbitheur de PKG, le KT5823, suggérant que la voie NO-GC-PKG est impliquée dans la régulation de la transcription par les βAR. En conclusion, les βARs et les ETRs nucléaires utilisent des voies de signalisation différentes et exercent ainsi des effets distincts sur l’expression des gènes cardiaques. Ils représentent donc une avenue intéressante pour le développement de drogues pharmacologiques.

Étude des œstrogènes sur la repolarisation cardiaque et de la grossesse sur l’électrocardiographie chez la souris

Le tamoxifène, un modulateur sélectif des récepteurs oestrogéniques, est un médicament largement utilisé depuis plus de vingt ans pour le traitement et la prévention du cancer du sein. Plusieurs études ont rapporté que l’administration aiguë du tamoxifène pouvait réduire certains courants K+ cardiaques. Cette observation suggère que les femmes traitées de façon chronique avec le tamoxifène risquent d’avoir une prolongation de leur intervalle QT, favorisant ainsi le développement de torsades de pointes. Puisque in vivo, le tamoxifène est largement métabolisé et son effet est attribué à celui du 4hydroxy-tamoxifène (4OH-tamoxifène), nous avons d'abord vérifié si les effets du tamoxifène sur la repolarisation pouvaient être dus au 4OH-tamoxifène. À l'aide de la méthode de patch-clamp, nous avons étudié l’effet aigu du 4OH-tamoxifène sur les courants K+ présents au niveau ventriculaire chez la souris femelle. En premier lieu, nous avons démontré que les souris traitées avec le 4OH-tamoxifène présentaient une diminution des courants K+ comparativement aux souris intactes. Fait intéressant, le prétraitement des myocytes avec l’antagoniste des récepteurs oestrogéniques, le ICI 182,780, ou l’inhibiteur de la synthèse protéique, l'actinomycine D, n’a pas modifié les effets du 4OH-tamoxifène. Ces résultats suggéraient que les effets du 4OH-tamoxifène sur les courants potassiques ne soient pas liés à la transcription génomique et n’implique pas les récepteurs aux œstrogènes. Bien que l’administration aiguë du 4OH-tamoxifène diminue les courants K+ cardiaques, l’absence de troubles au niveau du rythme cardiaque chez les femmes traitées à long terme exclu la possibilité de conclure que le traitement chronique avec le tamoxifène augmente la durée de l’intervalle QT. L'accès à des souris femelles et des cobayes nous a permis de démontrer que contrairement au traitement en aigu, les courants et les canaux K+ cardiaques sont augmentés en chronique. Les oestrogènes associés à une diminution des courants K+ d’une part et nos résultats obtenus avec le tamoxifène d’autre part suggèrent qu’en bloquant les récepteurs oestrogéniques, le tamoxifène puisse prévenir les effets inhibiteurs des oestrogènes sur les courants K+. Cette association œstrogènes- tamoxifène- récepteurs oestrogéniques et courants K+ nous a encouragées à approfondir encore nos études et vérifier l’influence des hormones sexuelles féminines sur la repolarisation ventriculaire. Une troisième étude a été ainsi réalisée chez des souris femelles ovariectomisées et des souris déficientes en récepteurs oestrogéniques α ou β afin de vérifier le rôle des oestrogènes et des récepteurs oestrogéniques sur la repolarisation ventriculaire. Nos résultats ont révélé clairement que l’absence des oestrogènes entraîne une augmentation de la densité du courant K+ transitoire indépendant du Ca2+ (Ito) et de l’expression du canal Kv4.3 et ces effets sont médiés par les REα. Ces données soutiennent davantage notre conclusion que l’inhibition des récepteurs oestrogéniques est responsable de l’augmentation des courants/canaux K+ et suggèrent fortement qu’ils jouent un rôle dans la régulation de la repolarisation ventriculaire. Elles soulignent aussi l'importance de vérifier le statut hormonal des animaux utilisés pour des études touchant l'électrophysiologie cardiaque. Dans la dernière partie de cette thèse nous avons vérifié les effets de la grossesse et du système nerveux autonome sur les différents paramètres électrocardiographiques et plus particulièrement sur le rythme cardiaque chez la souris. Nos données ont montré que, comme chez la femme enceinte, la grossesse est associée à une augmentation du rythme cardiaque. De plus, l'augmentation des niveaux des hormones féminines pourrait affecter l’automatisme et l’activité électrique cardiaque. Ces différentes études ont augmenté les connaissances sur la régulation hormonale de l'électrophysiologie cardiaque et aideront aux avancements des recherches chez les femmes.

A study of the polycomb group complexes in the maintenance of heterochromatic genome stability and Alzheimer's disease.

La démence d'Alzheimer est une maladie neurodégénérative caractérisée par une perte progressive et irreversible des fonctions cognitives et des compétences intellectuelles. La maladie d’Alzheimer se présente sous deux formes: la forme familiale ou précoce (EOAD) qui représente 5% des cas et elle est liée à des mutations génétiques affectant le métabolisme des peptides amyloïde; et la forme tardive ou sporadique (LOAD) qui représente 95% des cas mais son étiologie est encore mal définie. Cependant, le vieillissement reste le principal facteur de risque pour développer LOAD. Les changements épigénétiques impliquant des modifications des histones jouent un rôle crucial dans les maladies neurodégénératives et le vieillissement lié à l'âge. Des données récentes ont décrit LOAD comme un désordre de l'épigénome et ont associé ce trouble à l'instabilité génomique. Les protéines Polycomb sont des modificateurs épigénétiques qui induisent le remodelage de la chromatine et la répression des gènes à l'hétérochromatine facultative. Nous rapportons que les souris hétérozygotes pour une protéine Polycomb développent avec l'âge un trouble neurologique ressemblant à LOAD caractérisé par l’altération des fonctions cognitives, la phosphorylation de la protéine tau, l'accumulation des peptides amyloïde, et le dysfonctionnement synaptique. Ce phénotype pathologique est précédé par la décondensation de l’hétérochromatine neuronale et l'activation de la réponse aux dommages à l'ADN. Parallèlement, une réduction d’expression de polycomb, malformations de l'hétérochromatine neuronale, et l'accumulation de dommages à l'ADN étaient également présents dans les cerveaux de patients LOAD. Remarquablement, les dommages de l'ADN ne sont pas distribués de façon aléatoire sur le génome mais sont enrichis au niveau des séquences répétitives. Les conclusions présentées dans cette thèse ont identifié des modifications épigénétiques spécifiques qui conduisent à une instabilité génomique aberrante menant à la formation de LOAD. Ces résultats vont aider au développement de nouveaux traitements qui peuvent potentiellement ralentir la neurodégénérescence.

Exploration du rôle du fragment LG3 sur les cellules souches mésenchymateuses dans le contexte du rejet vasculaire

La vasculopathie du greffon est une pathologie caractérisée par un rétrécissement progressif et oblitérant des vaisseaux sanguins menant à une ischémie et une perte de fonction du greffon. Le rétrécissement vasculaire est dû à une accumulation de matrice extracellulaire (MEC) et de cellules mononuclées positives pour l’actine musculaire lisse alpha (alphaSMA) dont les cellules souches mésenchymateuses, le tout formant une néointima oblitérante. Cette pathologie est la cause principale de la perte des greffons rénaux et cardiaques à long terme. Le rejet vasculaire aigu est un prédicteur de la vasculopathie du greffon. L’équipe du Dr Hébert a démontré que l’apoptose endothéliale, qui joue un rôle important dans le développement du rejet vasculaire, initie la libération de LG3, un fragment du protéoglycan perlécan. Les taux sanguins et urinaires de LG3 sont augmentés chez les receveurs d’allogreffe rénale avec rejet vasculaire et vasculopathie du greffon. Les résultats obtenus en laboratoire durant ma maîtrise ont permis de mieux caractériser l’impact du LG3 sur un type cellulaire important participant à la formation de néointima : les cellules souches mésenchymateuses. Mes travaux ont démontré que le LG3 induit à la fois la migration horizontale des MSC et la transmigration des MSC. Cette migration est dépendante de la voie de signalisation d’ERK1/2, précédemment identifiée comme voie centrale dans la formation de néointima. De plus, nos résultats démontrent que la kinase Src est activée en amont de l’activation de la voie MAPK. La migration horizontale et la transmigration induites par le LG3 sont aussi dépendantes des intégrines alpha2beta1, ainsi que l’activation de la voie MAPK. Dans un modèle de transplantation murin, nous avons également démontré que l’injection sérique de LG3 recombinant favorise l’accumulation de cellules positives pour alphaSMA dans la néointima. En outre, lorsque le receveur est déficient pour l’intégrine alpha2, mais que le greffon est sauvage, la formation de néointima induite par l’injection de LG3 est diminuée dans le greffon suggérant que les cellules du receveur jouent un rôle important dans la formation de la néointima. Enfin, nous avons démontré que l’injection de LG3 augmente aussi le nombre de cellules positives pour la forme phosphorylée d’ERK1/2 (p-ERK1/2) dans la néointima du greffon et que cette accumulation est dépendante de la présence des intégrines 2 1 chez les cellules du receveur.Lorsque le receveur est sauvage, il y a une augmentation du nombre de cellules positives pour p-ERK1/2. L’investigation de ces mécanismes dans le remodelage vasculaire expose de nouvelles opportunités pour inhiber la réponse cellulaire qui mène au remodelage inadapté lors d’un dommage vasculaire chronique et ainsi prolonger la survie du greffon.

Doppler vortography : detection and quantification of the vortices in the left ventricle

Nous proposons une nouvelle méthode pour quantifier la vorticité intracardiaque (vortographie Doppler), basée sur l’imagerie Doppler conventionnelle. Afin de caractériser les vortex, nous utilisons un indice dénommé « Blood Vortex Signature (BVS) » (Signature Tourbillonnaire Sanguine) obtenu par l’application d’un filtre par noyau basé sur la covariance. La validation de l’indice BVS mesuré par vortographie Doppler a été réalisée à partir de champs Doppler issus de simulations et d’expériences in vitro. Des résultats préliminaires obtenus chez des sujets sains et des patients atteints de complications cardiaques sont également présentés dans ce mémoire. Des corrélations significatives ont été observées entre la vorticité estimée par vortographie Doppler et la méthode de référence (in silico: r2 = 0.98, in vitro: r2 = 0.86). Nos résultats suggèrent que la vortographie Doppler est une technique d’échographie cardiaque prometteuse pour quantifier les vortex intracardiaques. Cet outil d’évaluation pourrait être aisément appliqué en routine clinique pour détecter la présence d’une insuffisance ventriculaire et évaluer la fonction diastolique par échocardiographie Doppler.

Cardiac cell fate control by the imidazoline I1 receptor/nischarin : application in cardiac pathology

La moxonidine, un médicament antihypertenseur sympatholytique de type imidazolinique, agit au niveau de la médulla du tronc cérébral pour diminuer la pression artérielle, suite à l’activation sélective du récepteur aux imidazolines I1 (récepteur I1, aussi nommé nischarine). Traitement avec de la moxonidine prévient le développement de l’hypertrophie du ventricule gauche chez des rats hypertendus (SHR), associé à une diminution de la synthèse et une élévation transitoire de la fragmentation d’ADN, des effets antiprolifératifs et apoptotiques. Ces effets se présentent probablement chez les fibroblastes, car l’apoptose des cardiomyocytes pourrait détériorer la fonction cardiaque. Ces effets apparaissent aussi avec des doses non hypotensives de moxonidine, suggérant l’existence d’effets cardiaques directes. Le récepteur I1 se trouvé aussi dans les tissus cardiaques; son activation ex vivo par la moxonidine stimule la libération de l’ANP, ce qui montre que les récepteurs I1 cardiaques sont fonctionnels malgré l’absence de stimulation centrale. Sur la base de ces informations, en plus du i) rôle des peptides natriurétiques comme inhibiteurs de l’apoptose cardiaque et ii) des études qui lient le récepteur I1 avec la maintenance de la matrix extracellulaire, on propose que, à part les effets sympatholytiques centrales, les récepteurs I1 cardiaques peuvent contrôler la croissance-mort cellulaire. L’activation du récepteur I1 peut retarder la progression des cardiopathies vers la défaillance cardiaque, en inhibant des signaux mal adaptatifs de prolifération et apoptose. Des études ont été effectuées pour : 1. Explorer les effets in vivo sur la structure et la fonction cardiaque suite au traitement avec moxonidine chez le SHR et le hamster cardiomyopathique. 2. Définir les voies de signalisation impliquées dans les changements secondaires au traitement avec moxonidine, spécifiquement sur les marqueurs inflammatoires et les voies de signalisation régulant la croissance et la survie cellulaire (MAPK et Akt). 3. Explorer les effets in vitro de la surexpression et l’activation du récepteur I1 sur la survie cellulaire dans des cellules HEK293. 4. Rechercher la localisation, régulation et implication dans la croissance-mort cellulaire du récepteur I1 in vitro (cardiomyocytes et fibroblastes), en réponse aux stimuli associés au remodelage cardiaque : norépinephrine, cytokines (IL-1β, TNF-α) et oxydants (H2O2). Nos études démontrent que la moxonidine, en doses hypotensives et non-hypotensives, améliore la structure et la performance cardiaque chez le SHR par des mécanismes impliquant l’inhibition des cytokines et des voies de signalisation p38 MAPK et Akt. Chez le hamster cardiomyopathique, la moxonidine améliore la fonction cardiaque, module la réponse inflammatoire/anti-inflammatoire et atténue la mort cellulaire et la fibrose cardiaque. Les cellules HEK293 surexprimant la nischarine survivent et prolifèrent plus en réponse à la moxonidine; cet effet est associé à l’inhibition des voies ERK, JNK et p38 MAPK. La surexpression de la nischarine protège aussi de la mort cellulaire induite par le TNF-α, l’IL-1β et le H2O2. En outre, le récepteur I1 s’exprime dans les cardiomyocytes et fibroblastes, son activation inhibe la mort des cardiomyocytes et la prolifération des fibroblastes induite par la norépinephrine, par des effets différentiels sur les MAPK et l’Akt. Dans des conditions inflammatoires, la moxonidine/récepteur aux imidazolines I1 protège les cardiomyocytes et facilite l’élimination des myofibroblastes par des effets contraires sur JNK, p38 MAPK et iNOS. Ces études démontrent le potentiel du récepteur I1/nischarine comme cible anti-hypertrophique et anti-fibrose à niveau cardiaque. L’identification des mécanismes cardioprotecteurs de la nischarine peut amener au développement des traitements basés sur la surexpression de la nischarine chez des patients avec hypertrophie ventriculaire. Finalement, même si l’effet antihypertenseur des agonistes du récepteur I1 centraux est salutaire, le développement de nouveaux agonistes cardiosélectifs du récepteur I1 pourrait donner des bénéfices additionnels chez des patients non hypertendus.