Implicaciones del uso de fuentes exógenas de fitasa sobre los rendimientos productivos y valor nutricional de las dietas en aves. Repercusiones medioambientales

En los últimos años, y debido a un aumento de las producciones intensivas de cerdos y aves en el marco de la UE, se han desarrollado muchos estudios intentando minimizar el impacto contaminante del exceso de nitrógeno y fósforo que las deyecciones de estos animales producen en el medio ambiente. La disminución del contenido de N procedente de las deyecciones se ha abordado con diferentes estrategias nutricionales (formulación con aminoácidos disponibles, mejora de la utilización de la proteína con diferentes enzimas, etc.). El fósforo es un mineral imprescindible para el crecimiento de los animales, debido a su influencia en el ciclo energético, en la formación de huesos y como regulador de la ingesta. El fósforo presente en los vegetales (base de la alimentación de las aves) se encuentra básicamente formando el ácido fítico, muy poco asimilable por los animales. Por tal motivo, se suplementan las dietas con fósforo inorgánico, a menudo en exceso, que en parte revierte al medio ambiente, dando lugar a problemas medioambientales en áreas de gran concentración de producciones intensivas de animales. En la ultima década se ha estudiado el efecto que la incorporación de la enzima fitasa produce en el aumento de la biodisponibilidad del fósforo fítico (Kornegay et al., 1996), con lo que se reduce la cantidad de fósforo inorgánico añadido a las dietas y, por tanto, la disminución del fósforo excretado. Se ha descrito que la incorporación de este enzima produce ademas mejoras de la disponibilidad de otros minerales (calcio, zinc, cobre, hierro, etc.) (Broz et al., 1994; Schoner et al., 1991; Roberson and Edwards, 1994; Yi et al., 1997; Sebastian et al., 1996), pero dependientes del nivel de calcio y de vitamina D3 (Qian et al., 1996; Qian et al., 1997; Edwards, 1993; Lei et al., 1994), y de la fuente de fibra (Ravindran et al. 1995). También se han descrito mejoras en la digestibilidad de la proteína y los aminoácidos (Yi et al., 1996a; Mroz et al., 1994) , aunque en este campo existe cierta controversia, ya que la respuesta depende de la cantidad y procedencia del ácido fitico de la dieta (O’Dell and Boland, 1976). Sin embargo, casi todos los ensayos se han realizado con dietas a base de maíz-soja, en tanto que a nivel de la UE cada vez más se utilizan otro tipo de ingredientes para las raciones (trigo, cebada, girasol, guisantes, subproductos, etc.). Algunos de estos ingredientes se caracterizan por tener una actividad fitasa endógena nada despreciable (Eeckout and De Paepe, 1994) que, en general, no se ha tenido en cuenta, pero que puede verse afectada en los procesos de granulación. Por otro lado, los efectos beneficiosos de la adición de fitasa a las dietas parecen ser, en ocasiones, más importantes en los aumentos de consumo y mejores índices de conversión que en los derivados de la propia liberación del fósforo, es decir, en los llamados “side effects”, (básicamente, mejora de parámetros productivos, del valor de energía de las dietas, de la utilización de diversos minerales, y de la proteína), aunque existe una gran controversia en algunos de estos efectos. Existen muy pocos estudios sobre el papel de la fibra y otros hidratos de carbono en la actuación de estos enzima (interacción positiva o negativa).

Padrão isoenzimático da cepa Y do Trypanosoma cruzi após quimioterapia específica

Foi estudado o perfil isoenzimático da cepa Y do Trypanosoma cruzi isolada de camundongos tratados e não curados com o Nufurtimox (Bay 2502) ou com o Benzonidazol (Ro 7.1051), submetida à passagens em camundongos recém-nascidos e a seguir inoculada nos seguintes grupos experimentais: I - camundongos inoculados com a cepa Y resistente ao Nifurtimox e tratados com esta mesma droga; II - camundongos inoculdado com a cepa Y resistente ao Nifurtimox e tratados com o Benzonidazol e III - camundognos resistentes ao tratamento com o Benzonidazol e tratados com esta mesma droga. Os inóculos foram de 15 x 10 [elevado a 4 ] tripomastigotas sanguícolas. Houve aumento de resistência em relação a cepa original com a mesma droga e resistência cruzada. A cepa Y isolada dos animais não curados foi passada em cultura em meio Warren e preparados os extratos enzimáticos para a eletroforese das seguintes enzimas: GPI, PGM, ALAT e ASAT. Como controle isoenzimático foram utilizadas as cepas Peruana (Tipo I), 21 SF (Tipo II) e Colombiana (Tipo III) e duas amostras da cepa Y mantidas por diferentes período em cultura e em criopreservação dos extraidos enzimáticos. Não houve modificações do perfil isoenzimático da cepa Y, que Tipo I (Peruana) e ao padrão das amostras da cepa Y com diferentes períodos de manutenção.

Estudio de diferentes estrategias de operación en la reacción entre dihidroxiacetona fosfato y Z-S-alaninal catalizada por Rhamnulosa-1-fosfato aldolasa

Proyecto de investigación realizado a partir de una estancia el grupo de Biotecnología e Ingeniería de Bioprocesos del Imperial College London entre abril y julio del 2007. La catálisis enzimática es una tecnología en continua expansión en el campo de la síntesis y producción de compuestos enantioméricamente puros con actividad biológica. Concretamente las aldolasas son enzimas de gran interés industrial como biocatalizadores en síntesis asimétrica de compuestos quirales ya que catalizan la formación de enlaces C-C mediante reacciones de adición aldólica con una alta regio y estereoespecíficidad. Uno de los compuestos es el precursor de iminociclitoles, que son moléculas de gran potencial terapéutico en el tratamiento de un amplio rango de enfermedades debido a su actividad como inhibidores de glicosidasas y glicosiltransferasas. Sin embargo, para conseguir esta reacción existen problemas de solubilidad de los reactivos y productos en medios homogéneos. Una posible solución es el empleo de medios bifásicos en biorreactores de membrana. Se ha estudiado el potencial de un Biorreactor de Membrana para Biotransformaciones desarrollado en dicha reacción y, a la vez, diferentes estrategias de operación que lleven al máximo rendimiento de producto y/o faciliten su purificación tras la reacción.

Desarrollo de biomarcadores del grado de exposición y activación para la evaluación de la neurotoxicidad de la MDMA en humanos

La 3,4-Metilendioximetanfetamina (MDMA, éxtasis) es un derivado anfetamínico sintético ampliamente usado como droga recreativa, que produce neurotoxicidad serotonérgica en animales y posiblemente también en humanos. El mecanismo subyacente de neurotoxicidad, incluye la formación de especies reactivas de oxigeno (ROS), pero la fuente de generación de estos es un punto de controversia. Se postula que la neurotoxicidad inducida por la MDMA es mediada por la formación de metabolitos bioreactivos. Específicamente, los metabolitos primarios de tipo catecol, la 3,4- dihidroximetanfetamina (HHMA) y la 3,4-dihidroxianfetamina (HHA), que luego dan lugar a la formación de conjugados con el glutatión y la N-acetilcisteína, y que conservan la capacidad de entrar en el ciclo redox y presentan neurotoxicidad serotonérgica en ratas. Aunque la presencia de dichos metabolitos se demostró recientemente en microdialisados de cerebros de ratas, su formación en humanos no se ha reportado aun. Este trabajo describe la detección de N-acetil-cisteína-HHMA (NAC-HHMA) y N-acetil-cisteína-HHA (NAC-HHA) en orina humana de 15 consumidores recreacionales de MDMA (1.5 mg/kg) en un entorno controlado. Los resultados revelan que en las primeras 4 horas después del consumo de MDMA aproximadamente el 0.002% de la dosis administrada es recuperada como aductos tioéter. Los polimorfismos genéticos en la expresión de las enzimas CYP2D6 y COMT, que en conjunto son las principales determinantes de los niveles estables de HHMA y HHA, posiblemente expliquen la variabilidad interindividual observada en la recuperación de la NAC-HHMA y la NAC-HHA en orina. Resumiendo, por primera vez se demuestra la formación de aductos tioéteres neurotóxicos de la MDMA en humanos. Estos resultados apoyan la hipótesis de que la bioactivación de la MDMA a metabolitos neurotóxicos es el mecanismo relevante para la generación de la neurotoxicidad en humanos.

Avaluació del creixement del fong ligninolític Trametes versicolor sobre diferents suports sòlids per a l'aplicació en tractaments de bioremediació

Els fongs de podridura blanca (WRF - de l'anglès: White-rot fungi) són de gran interès en l'àmbit de la bioremediació per la seva capacitat de degradar la lignina. La lacasa, un dels enzims extracel·lulars que aquests fongs excreten per degradar la lignina, pot ser utilitzada per degradar els contamiants presents en una matriu donada. Trametes versicolor ha estat estudiat per la seva capacitat de produïr aquest enzim en rersidus agrícoles com a substrats. Un primer triatge basat en la producció de CO2, la mesura de l'activitat lacasa i la quantificació de l'ergosterol han permés seleccionar els substrats on es donava un major poder oxidatiu dels cultius inoculats amb T. versicolor. Els posteriors experiments de colonització de sòls, on es monitoritzava l'activitat lacasa i l'ergosterol, han mostrat que T. vesicolor és capaç de colonitzar sòls i que té una major activitat lacasa en condicions no estèrils. També h'ha provat, mitjançant el test ND24, que T. versicolor és capaç de degradar un contaminant emergent, el naproxè, en sòls estèrils i no estèrils esmenats amb residus agrícoles.

Estudio de los mecanismos terapéuticos en la inducción de tolerancia immunológica en un modelo animal de esclerosis múltiple

En una serie de estudios previos demostramos que la infusión de células de médula ósea (MO) modificadas genéticamente para la expresión del autoantígeno MOG40-55 en ausencia de mieloablación inducía tolerancia antígenoespecífica en un modelo murino de esclerosis múltiple. También observamos que este efecto terapéutico no requería injerto hematopoyético. Nos propusimos estudiar si el efecto tolerogénico está inducido por una subpoblación de células generadas durante la transducción de la MO y el papel de las células T reguladoras en la inducción de la tolerancia. Las células de MO fueron cultivadas y transducidas usando medio complementado con 20% FCS y medios condicionados como fuente de stem cell factor (SCF) e IL-3 murinos. Las diferentes poblaciones celulares se separaron por citometría de flujo y se analizó la capacidad supresora de las poblaciones candidatas. Por otro lado se analizó la presencia de células T reguladoras en bazo y SNC de los ratones recuperados después de la infusión de células de MO transducidas. A los cinco días de cultivo, la mayoría de células presentaban fenotipo mieloide (Mac-1+Gr-1low/-:31,9+-10,2%; Mac-1+Gr-1high:26,0+-3,3%). Ambos fenotipos se corresponden con dos subpoblaciones de células mieloides supresoras (MDSC, tipo monocí¬tico y granulocítico respectivamente) descritas recientemente. Se estudió la capacidad de ambas poblaciones para suprimir la respuesta proliferativa específica de esplenocitos frente a MOG40-55 in vitro, observando una mayor capacidad de supresión de las MDSC monocíticas, que se correspondí¬a con niveles significativamente superiores de actividad de las enzimas arginasa-1 y sintasa de óxido nítrico (ambos mecanismos supresores característicos de las MDSC). A los 7 días del tratamiento no se observaron diferencias significativas en el porcentaje de células T reguladoras (Treg y Tr1) entre el grupo tratado (liM) y los grupos de control.

PGC-1α regula la respuesta celular frente a estrés oxidativo en el miocardio tras síndrome coronario agudo

PGC-1α es un factor de transcripción maestro en la regulación mitocondrial de genes de protección frente a estrés oxidativo. Decidimos analizar el papel de la molécula en la regulación celular miocárdica tras infarto agudo. Evaluamos 38 pacientes con diagnóstico de SCACEST sometidos a estrategia de reperfusión. Encontramos que los pacientes con nivel basal de expresión reducido y mayor inducción de PGC-1α tras el evento presentaban infartos más extensos estimados por resonancia cardiaca. Concluimos que PGC-1α participa en la regulación de la respuesta celular frente a isquemia, en base a la activación de enzimas de protección mitocondrial.

Aspectos metabólicos y multivitamínicos del maíz

La deficiencia de vitamina A causa 2.2 millones de muertes al año. Por tanto, investigadores intentan elevar el contenido de β-caroteno y otros carotenoides en cereales mediante la ingeniería genética. Mi trabajo consistió en analizar carotenoides en maíz y callos de arroz transgénico con el fin de indentificar y cuantificar estos pigmentos y además analizar la ruta metabólica de los mismos. Por tal motivo, desarrollaré una técnica analítica por HPLC y UHPLC que me permitió separar la mezcla de carotenoides. Estas moléculas se detectaton utilizando un detector de arreglo de diodos y masas. Con éste último se probaron distintas técnicas de ionización (ESI, APCI y APPI) para encontrar la mejor técnica que ionizara carotenos y xantófilas. Además se hallaron transiciones para identificar a cada uno de los carotenoides. Para mostrar la confiabilidad del método analítico, realicé la validación del mismo y determiné factores importantes que influyen en el análisis de carotenoides, como por ejemplo, su estabilidad química. Para analizar la ruta metabólica de los carotenoides, se realizaron distintos experimentos, entre ellos, introducir distintas combinaciones de genes en el maíz y arroz que permitieran entender cuáles eran las enzimas importantes que permitían la acumulación de carotenoides. También se analizó la biosíntesis de carotenoides a distintas etapas del desarrollo de la semilla de maíz, desde los 15 días después de la polinización (DAP) hasta los 60 DAP y su estabilidad química a lo largo de todo este período. Finalmente, se profundizó en la identificación de nuevos carotenoides encontrados en las muestras, como los oxo-carotenoides (utilizados en la industria como colorantes). Para llevar acabo su identificación, se realizaron pruebas químicas, se determinaron sus espectros visibles y sus fragmentos por masas.   

Estudios fármaco-genéticos de pacientes con infección por VIH-1 tratados con regimenes antirretrovirales basados en estavudina: asociación de los polimorfismos de la timidilato sintasa con los niveles intracelulares de estavudina trifosfato

L’activitat antiretroviral i la toxicitat de l’estavudina (d4T) depèn del seu metabòlit trifosfat (d4T-TP).Es varen determinar els nivells intracel•lulars de d4T-TP y els polimorfismes dels gens dels enzims la via del folat entre altres la timidilat sintasa (TS), la metilentetrahidrofolat reductasa (MTHFR), .... Els nivells intracel•lulars de d4T als malalts del estudi transversal amb un genotip d’alta expressió del TS van ser de 11.50 fmol/106 cels mentre que per aquells amb un genotip de baixa expressió, van ser de 20.65 (P = 0.0010). Els nivells intracel•lulars de d4T són determinats pels polimorfismes de timidilato sintasa.

Modelización de procesos de membranas aplicados a alimentos modelos y derivados

El presente grupo ha recorrido ya un largo camino trabajando en el estudio de sistemas enzimáticos, diseño y simulación de biorreactores con enzimas en soluble e inmovilizadas, comprobando la seria dificultad de separación y eliminación de las mismas en la etapa final del proceso, así como las problemáticas de preparación y uso de las enzimas inmovilizadas en los mas diversos tipos de soportes. En este estudio se investigo la aplicación de ultrafiltración y ósmosis inversa en soluciones modelo de zumos para su clarificación y concentración, también en la eliminación de melanoidinas en concentrados de zumos. A partir de esta investigación se elaboraron membranas con enzimas pectinoliticas inmovilizadas. Al igual que se determino las condiciones óptimas de aplicación en sistemas modelo a escala de laboratorio y planta piloto.

Prognostic impact of MGMT promoter methylation and MGMT and CD133 expression in colorectal adenocarcinoma.

BACKGROUND New biomarkers are needed for the prognosis of advanced colorectal cancer, which remains incurable by conventional treatments. O6-methylguanine DNA methyltransferase (MGMT) methylation and protein expression have been related to colorectal cancer treatment failure and tumor progression. Moreover, the presence in these tumors of cancer stem cells, which are characterized by CD133 expression, has been associated with chemoresistance, radioresistance, metastasis, and local recurrence. The objective of this study was to determine the prognostic value of CD133 and MGMT and their possible interaction in colorectal cancer patients. METHODS MGMT and CD133 expression was analyzed by immunohistochemistry in 123 paraffin-embedded colorectal adenocarcinoma samples, obtaining the percentage staining and intensity. MGMT promoter methylation status was obtained by using bisulfite modification and methylation-specific PCR (MSP). These values were correlated with clinical data, including overall survival (OS), disease-free survival (DFS), tumor stage, and differentiation grade. RESULTS Low MGMT expression intensity was significantly correlated with shorter OS and was a prognostic factor independently of treatment and histopathological variables. High percentage of CD133 expression was significantly correlated with shorter DFS but was not an independent factor. Patients with low-intensity MGMT expression and ≥50% CD133 expression had the poorest DFS and OS outcomes. CONCLUSIONS Our results support the hypothesis that MGMT expression may be an OS biomarker as useful as tumor stage or differentiation grade and that CD133 expression may be a predictive biomarker of DFS. Thus, MGMT and CD133 may both be useful for determining the prognosis of colorectal cancer patients and to identify those requiring more aggressive adjuvant therapies. Future studies will be necessary to determine its clinical utility.

Optimização da Produção de Frutooligossacáridos por Aspergillus

Este trabalho foi proposto no âmbito do Projecto BIOLIFE – Produção de ingredientes para alimentos funcionais, em curso na BIOTEMPO, Lda desde 2004. Com este trabalho, pretendeu-se avaliar o potencial da produção de frutooligossacáridos (FOS) por Aspergillus sp, recorrendo a um sistema de fermentação descontínuo. Frutooligossacáridos (FOS) são oligossacáridos que ocorrem naturalmente em produtos de origem vegetal, tais como o tomate, cevada, cebola, banana, centeio, espargos, alcachofras, entre outros. Para além de existirem naturalmente, os FOS podem ser produzidos a partir da sacarose usando enzimas ou recorrendo a microrganismos produtores. A tecnologia de fermentação tem como vantagem face à tecnologia enzimática, actualmente a mais utilizada no mercado, o facto de evitar o passo de produção e separação das enzimas, simplificando o processo e reduzindo os custos de operação. Os FOS são prebióticos que, para além de serem compostos indigeríveis, possuem um bom poder adoçante que, apesar de inferior ao dos açúcares comuns é bastante significativo. Esta característica permite a sua utilização como adoçantes não calóricos. Adicionalmente, os prebióticos apresentam outras propriedades benéficas tais como o aumento da absorção de cálcio e magnésio, o aumento da velocidade de metabolismo dos lípidos e efeitos anticancerígenos. A produção de FOS por Aspergillus sp foi estudada recorrendo a um desenho experimental para restringir o número de experiencias requeridas num processo de optimização. Inicialmente foram efectuadas sete fermentações com o intuito de encontrar o ponto óptimo de produção de FOS. Os parâmetros de optimização utilizados foram a temperatura e a agitação. Posteriormente, foram incluídas mais quatro fermentações no referido desenho. O tratamento estatístico dos resultados conduziu a um modelo cúbico que foi posteriormente validado comprovando o seu ajuste. Concluindo, o desenho experimental permitiu obter um modelo que descreve a produção de FOS por Aspergillus sp, bem como determinar as condições para os quais o rendimento de produção de FOS é máximo.

Efeito do sinergista butóxido de piperonila na resistência de Oryzaephilus surinamensis (L.) (Coleoptera, Silvanidae) a deltametrina e fenitrotiom

A utilização de sinergistas é uma importante ferramenta para determinar os mecanismos envolvidos na resistência de insetos. Nesta pesquisa, o sinergista butóxido de piperonila (PBO) foi usado, em diferentes proporções, para avaliar a contribuição relativa de enzimas oxidases no metabolismo do inseticida organofosforado fenitrotiom e do piretróide deltametrina, em quatro populações de Oryzaephilus surinamensis: OS1 (suscetível) e OS2, OS3 e OS4 (resistentes). O sinergista aumentou, significativamente, a toxicidade da deltametrina nas populações resistentes, indicando que as oxidases exercem uma importante função na resistência a este inseticida. Para o fenitrotiom, o PBO apresentou um efeito antagonista, diminuindo significativamente a toxicidade do inseticida em todas as populações, indicando que este sinergista não é o mais apropriado para a mistura com compostos organofosforados.

Efeito da Sequestração de Intermediários na Eficácia Funcional de Ciclos Metabólicos de Transferência de Grupos

Um Ciclo Metabólico de Transferência de Grupo, CMTG, é um conjunto de reacções químicas acopladas, catalisadas por enzimas, que transfere um grupo químico de um dador para um aceitante, via um intermediário recirculado. No caso minimalista - ciclo referência - o ciclo tem duas reacções. Uma reacção, catalisada por uma enzima de carga, onde o dador transfere o grupo químico para o intermediário, que passa de intermediário descarregado a intermediário carregado. Outra reacção catalisada por uma enzima de descarga, onde o intermediário carregado transfere o grupo para o aceitante. Os CMTG’s exibem diversidade a nível do design, sendo muito comum que o intermediário tanto na forma carregada como na descarregada seja sequestrado. Na primeira parte do trabalho, investiga-se os princípios de design dum CMTG e na segunda parte investiga-se as implicações funcionais da sequestração do intermediário carregado e do desacarregado. Quanto aos princípios de design dum CMTG, concluiu-se, utilizando novos métodos, que para um CMTG funcionar eficazmente, o intermediário deve estar predominantemente na forma carregada, a enzima de carga deve estar saturada com o dador enquanto que a enzima de descarga deve estar saturada com o intermediário carregado e insaturada com o aceitante. A comparação entre os diferentes design’s, mostrou que a sequestração do intermediário carregado tem as seguintes vantagens: • aumenta a tamponização do intermediário carregado com respeito à variações nas variáveis externas • diminui a sensibilidade da concentração do intermediário carregado às actividades enzimáticas • aumenta o acoplamento entre a demanda e o fluxo de fornecimento de grupos para o aceitante. No entanto, a sequestração desse intermediário tem a desvantagem de aumentar o tempo de resposta do ciclo à perturbações.

Efeito da sequestração de Intermediários na Eficácia Funcional de Ciclos Metabólicos de Transferência de Grupos

Um Ciclo Metabólico de Transferência de Grupo, CMTG, é um conjunto de reacções químicas acopladas, catalisadas por enzimas, que transfere um grupo químico de um dador para um aceitante, via um intermediário recirculado. No caso minimalista - ciclo referência - o ciclo tem duas reacções. Uma reacção, catalisada por uma enzima de carga, onde o dador transfere o grupo químico para o intermediário, que passa de intermediário descarregado a intermediário carregado. Outra reacção catalisada por uma enzima de descarga, onde o intermediário carregado transfere o grupo para o aceitante. Os CMTG’s exibem diversidade a nível do design, sendo muito comum que o intermediário tanto na forma carregada como na descarregada seja sequestrado.Na primeira parte do trabalho, investiga-se os princípios de design dum CMTG e na segunda parte investiga-se as implicações funcionais da sequestração do intermediário carregado e do desacarregado. Quanto aos princípios de design dum CMTG, concluiu-se, utilizando novos métodos, que para um CMTG funcionar eficazmente, o intermediário deve estar predominantemente na forma carregada, a enzima de carga deve estar saturada com o dador enquanto que a enzima de descarga deve estar saturada com o intermediário carregado e insaturada com o aceitante. A comparação entre os diferentes design’s, mostrou que a sequestração do intermediário carregado tem as seguintes vantagens: 1)aumenta a tamponização do intermediário carregado com respeito à variações nas variáveis externas 2) diminui a sensibilidade da concentração do intermediário carregado às actividades enzimáticas 3)aumenta o acoplamento entre a demanda e o fluxo de fornecimento de grupos para o aceitante. No entanto, a sequestração desse intermediário tem a desvantagem de aumentar o tempo de resposta do ciclo à perturbações.A sequestração do intermediário descarregado, por seu lado, piora as tamponizações, as sensibilidades e o acoplamento referidos acima. Quanto ao aspecto temporal não se obteve um resultado absoluto do efeito dessa sequestração, mas antes, mostrou-se que o resultado depende do ambiente, pois para certos ambientes melhora o tempo de resposta em relação ao ciclo referência e para outros piora. Concluiu-se que há uma relação de compromisso entre os diferentes aspectos da eficácia funcional. A sequestração do intermediário carregado melhora os aspectos relacionados com propriedades estacionárias, isto é , tamponizações, sensibilidades e outros, enquanto que piora os aspectos temporais. Já a sequestração do intermediário descarregado piora os aspectos relacionados com variações nas propriedades estacionárias.