Different degrees of malnutrition and immunological alterations according to the aetiology of cirrhosis: a prospective and sequential study

Abstract Objectives In this work we investigated how immunological dysfunction and malnutrition interact in alcoholic and viral aetiologies of cirrhosis. Methods To investigate the matter, 77 cirrhotic patients divided in three aetiologies [Alcohol, HCV and Alcohol + HCV) and 32 controls were prospectivelly and sequentially studied. Parameters of humoral immunity (Components 3 and 4 of seric complement and immunoglobulins A M, G and E) and of cellular immunity (total leukocytes and lymphocytes in peripheral blood, T lymphocytes subpopulations, CD4+ and CD8+, CD4+/CD8+ ratio and intradermic tests of delayed hypersensitivity), as well as nutrititional parameters: anthropometric measures, serum albumin and transferrin were evaluated. Results Multiple statistical comparisons showed that IgM was higher in HCV group; IgG was significantly elevated in both HCV and Alcohol + HCV, whereas for the Alcohol group, IgE was found at higher titles. The analysis of T- lymphocytes subpopulations showed no aetiologic differences, but intradermic tests of delayed hypersensitivity did show greater frequency of anergy in the Alcohol group. For anthropometric parameters, the Alcohol +HCV group displayed the lowest triceps skinfold whereas creatinine ��� height index evaluation was more preserved in the HCV group. Body mass index, arm muscle area and arm fat area showed that differently from alcohol group, the HCV group was similar to control. Conclusion Significant differences were found among the main aetiologies of cirrhosis concerning immunological alterations and nutritional status: better nutrition and worse immunology for HCV and vice-versa for alcohol.

A DNA vaccine against tuberculosis based on the 65 kDa heat-shock protein differentially activates human macrophages and dendritic cells

Abstract Background A number of reports have demonstrated that rodents immunized with DNA vaccines can produce antibodies and cellular immune responses presenting a long-lasting protective immunity. These findings have attracted considerable interest in the field of DNA vaccination. We have previously described the prophylactic and therapeutic effects of a DNA vaccine encoding the Mycobacterium leprae 65 kDa heat shock protein (DNA-HSP65) in a murine model of tuberculosis. As DNA vaccines are often less effective in humans, we aimed to find out how the DNA-HSP65 stimulates human immune responses. Methods To address this question, we analysed the activation of both human macrophages and dendritic cells (DCs) cultured with DNA-HSP65. Then, these cells stimulated with the DNA vaccine were evaluated regarding the expression of surface markers, cytokine production and microbicidal activity. Results It was observed that DCs and macrophages presented different ability to uptake DNA vaccine. Under DNA stimulation, macrophages, characterized as CD11b+/CD86+/HLA-DR+, produced high levels of TNF-alpha, IL-6 (pro-inflammatory cytokines), and IL-10 (anti-inflammatory cytokine). Besides, they also presented a microbicidal activity higher than that observed in DCs after infection with M. tuberculosis. On the other hand, DCs, characterized as CD11c+/CD86+/CD123-/BDCA-4+/IFN-alpha-, produced high levels of IL-12 and low levels of TNF-alpha, IL-6 and IL-10. Finally, the DNA-HSP65 vaccine was able to induce proliferation of peripheral blood lymphocytes. Conclusion Our data suggest that the immune response is differently activated by the DNA-HSP65 vaccine in humans. These findings provide important clues to the design of new strategies for using DNA vaccines in human immunotherapy.

Targeting the non-structural protein 1 from dengue virus to a dendritic cell population confers protective immunity to lethal virus challenge

Dengue is the most prevalent arboviral infection, affecting millions of people every year. Attempts to control such infection are being made, and the development of a vaccine is a World Health Organization priority. Among the proteins being tested as vaccine candidates in preclinical settings is the non-structural protein 1 (NS1). In the present study, we tested the immune responses generated by targeting the NS1 protein to two different dendritic cell populations. Dendritic cells (DCs) are important antigen presenting cells, and targeting proteins to maturing DCs has proved to be an efficient means of immunization. Antigen targeting is accomplished by the use of a monoclonal antibody (mAb) directed against a DC cell surface receptor fused to the protein of interest. We used two mAbs (��DEC205 and ��DCIR2) to target two distinct DC populations, expressing either DEC205 or DCIR2 endocytic receptors, respectively, in mice. The fusion mAbs were successfully produced, bound to their respective receptors, and were used to immunize BALB/c mice in the presence of polyriboinosinic: polyribocytidylic acid (poly (I:C)), as a DC maturation stimulus. We observed induction of strong anti-NS1 antibody responses and similar antigen binding affinity irrespectively of the DC population targeted. Nevertheless, the IgG1/IgG2a ratios were different between mouse groups immunized with ��DEC-NS1 and ��DCIR2-NS1 mAbs. When we tested the induction of cellular immune responses, the number of IFN-�� producing cells was higher in ��DEC-NS1 immunized animals. In addition, mice immunized with the ��DEC-NS1 mAb were significantly protected from a lethal intracranial challenge with the DENV2 NGC strain when compared to mice immunized with ��DCIR2-NS1 mAb. Protection was partially mediated by CD4(+) and CD8(+) T cells as depletion of these populations reduced both survival and morbidity signs. We conclude that targeting the NS1 protein to the DEC205(+) DC population with poly (I:C) opens perspectives for dengue vaccine development.

Phage display identification of CD100 in human atherosclerotic plaque macrophages and foam cells

Atherosclerosis is a complex disease in which vessels develop plaques comprising dysfunctional endothelium, monocyte derived lipid laden foam cells and activated lymphocytes. Considering that humans and animal models of the disease develop quite distinct plaques, we used human plaques to search for proteins that could be used as markers of human atheromas. Phage display peptide libraries were probed to fresh human carotid plaques, and a bound phage homologous to plexin B1, a high affinity receptor for CD100, was identified. CD100 is a member of the semaphorin family expressed by most hematopoietic cells and particularly by activated T cells. CD100 expression was analyzed in human plaques and normal samples. CD100 mRNA and protein were analyzed in cultured monocytes, macrophages and foam cells. The effects of CD100 in oxLDL-induced foam cell formation and in CD36 mRNA abundance were evaluated. Human atherosclerotic plaques showed strong labeling of CD100/SEMA4D. CD100 expression was further demonstrated in peripheral blood monocytes and in in vitro differentiated macrophages and foam cells, with diminished CD100 transcript along the differentiation of these cells. Incubation of macrophages with CD100 led to a reduction in oxLDL-induced foam cell formation probably through a decrease of CD36 expression, suggesting for the first time an atheroprotective role for CD100 in the human disease. Given its differential expression in the numerous foam cells and macrophages of the plaques and its capacity to decrease oxLDL engulfment by macrophages we propose that CD100 may have a role in atherosclerotic plaque development, and may possibly be employed in targeted treatments of these atheromas.

High Prevalence of Skin Disorders among HTLV-1 Infected Individuals Independent of Clinical Status

Background Human T-cell lymphotropic virus type 1 (HTLV-1) infection can increase the risk of developing skin disorders. This study evaluated the correlation between HTLV-1 proviral load and CD4+ and CD8+ T cells count among HTLV-1 infected individuals, with or without skin disorders (SD) associated with HTLV-1 infection [SD-HTLV-1: xerosis/ichthyosis, seborrheic dermatitis or infective dermatitis associated to HTLV-1 (IDH)]. Methods A total of 193 HTLV-1-infected subjects underwent an interview, dermatological examination, initial HTLV-1 proviral load assay, CD4+ and CD8+ T cells count, and lymphproliferation assay (LPA). Results A total of 147 patients had an abnormal skin condition; 116 (79%) of them also had SD-HTLV-1 and 21% had other dermatological diagnoses. The most prevalent SD-HTLV-1 was xerosis/acquired ichthyosis (48%), followed by seborrheic dermatitis (28%). Patients with SD-HTLV-1 were older (51 vs. 47 years), had a higher prevalence of myelopathy/tropical spastic paraparesis (HAM/TSP) (75%), and had an increased first HTLV-1 proviral load and basal LPA compared with patients without SD-HTLV-1. When excluding HAM/TSP patients, the first HTLV-1 proviral load of SD-HTLV-1 individuals remains higher than no SD-HTLV-1 patients. Conclusions There was a high prevalence of skin disorders (76%) among HTLV-1-infected individuals, regardless of clinical status, and 60% of these diseases are considered skin disease associated with HTLV-1 infection.

Transkriptionelle Regulation des humanen Interferon-gamma-Promotors in T-Lymphocyten

Interferon-gamma is mainly produced by activated T helper cells and cytotoxic T lymphocytes and sustains the immune-defense against viral and bacterial infections. For a better understanding of IFN-gamma promoter regulation in T cells, different DNA-binding motivs were examined. Hereby, a new motiv (-196 to -183) was identified, that binds to the transcription factor AP-1 in T helper cells and Jurkat T cells. This factor acts as an essential activator protein. Further investigation demonstrated that IL-12 and IL-18 induce different regulatory pathways. Both AP-1 and STAT-4 bindings at their cognate DNA elements (-196 to -183 and -224 to -215) are required for the IL-12 dependent activation whereas IL-18 causes direct activation via AP-1.Moreover, the TH2 cytokine IL-4 represses significantly the IFN-gamma promoter activity in CD4+ T cells. IL-4 induces GATA-3, that interacts with two DNA-motivs (-111 to -87) at the IFN-gamma promoter.Furthermore, transgenic mice were generated, yielding a human IFN-gamma promoter construct (410 bp) under the control of a luciferase reporter gene. The data demonstrated a specific IFN-gamma promoter activation by antiCD3 plus antiCD28 in CD4+ and CD8+ T cells. The luciferase activty in CD4+ T cells was reinforced by addition of IL-12 and IL-18 and repressed by IL-4.

Beeinflussung der menschlichen allergischen Immunantwort durch Allergen-DNA-transfizierte dendritische Zellen

Immunreaktionen gegen Antigene k��nnen eine zellul��re Immunantwort, eingeleitet durch TH1-Zellen induzieren oder aber eine antik��rpervermittelte humorale Immunantwort induzieren, die von Zellen des TH2-Typs bestimmt sind. Diese unterschiedlichen Immunreaktionen regulieren sich gegenseitig, indem sie sich wechselseitig unterdr��cken. Dadurch stellt sich ein Gleichgewicht zwischen den TH1- und TH2-Immunantworten ein. Die Allergie vom Soforttyp ist TH2-dominiert und wird ausgel��st durch die Produktion spezifischer IgE-Antik��rper gegen eigentlich harmlose Antigene. Durch die fr��he Aussch��ttung des Zytokins IL-4 von T-Zellen differenzieren naive allergenspezifische T-Zellen zu TH2-Zellen aus. Diese sezernieren dann ebenfalls IL-4 und auch IL-13, was die B-Zellen zu einer vermehrten Produktion von IgE-Molek��len stimuliert. IgE bindet an den hochaffinen IgE-Rezeptor auf Mastzellen, Basophilen und Eosinophilen. Bei weiterem Allergenkontakt kommt es durch Kreuzvernetzung der Fc���-Rezeptoren zur Aussch��ttung vo

RNA-basierte Impfstoffe zur Induktion optimaler Immunantworten

Antigen-kodierende RNA wird als eine sichere und effiziente Alternative zu traditionellen Impfstoff-Formulierungen, wie Peptid-, Protein-, rekombinanten viralen oder DNA basierten Impfstoffen betrachtet. Der endg��ltige klinische Nutzen RNA-basierter Impfstoffe wird von der Optimierung verschiedener Parameter abh��ngig sein, die zur Induktion und effizienten Expansion der humoralen und zellvermittelten Immunantwort beitragen. Vor diesem Hintergrund war die Zielsetzung der vorliegenden Arbeit, die Etablierung pharmakologischer und immunologischer Parameter f��r die Generierung effektiver Immunantworten durch RNA-Impfstoffe sowie deren Wirksamkeit in vitro und im Mausmodell unter Nutzung von Modellantigenen zu testen. Zur Untersuchung und Optimierung der RNA-Pharmakokinetik, als einem Schl��sselaspekt der klinischen Medikamentenentwicklung, wurde der Einfluss von strukturellen Modifikationen auf die Transkriptstabilit��t und Translationseffizienz von Reporter-Proteinen in einer zeitabh��ngigen Kinetik evaluiert. Es wurde gezeigt, dass ein poly(A) Schwanz von 120 Adenosinen, verglichen mit einem k��rzeren, ein freies 3�� poly(A) Ende, verglichen mit einem verdeckten und eine doppelte ��-globin 3�� UTR, unabh��ngig voneinander zu einer Erh��hung der IVT-RNA Stabilit��t und zu einer Verbesserung der Translationseffizienz beitrugen und dadurch insgesamt zu einer erh��hten Proteinexpression f��hrten. Antigen-kodierende IVT-RNA mit diesen molekularen Merkmalen in Kombination f��hrte, im Vergleich zur Standard IVT-RNA, zu einer erh��hten Dichte und Stabilit��t von Peptid/MHC-Komplexen auf der Zelloberfl��che transfizierter DCs und dadurch zu einer verbesserten Stimulation von CD4+ und CD8+ T-Zellen im murinen und humanen System. Mit dem Ziel, die RNA kodierte Antigenform f��r die Induktion einer verst��rkten Antik��rperantwort zu modifizieren, wurde im zweiten Teil der Arbeit ein Antigen-IgM Fusionskonstrukt hergestellt und hinsichtlich seiner Eignung als neues Impfstoff-Format untersucht. Die Ausgangshypothese, dass die RNA kodierten Antigen-IgM Fusionsproteine polymerisieren, von transfizierten Zellen sezerniert werden und aufgrund der repetitiven Antigenstruktur im Vergleich mit dem monomeren Antigen zu einer Verst��rkung der Antik��rperantwort f��hren, wurde in vitro und in vivo im Mausmodell best��tigt. Die Entwicklung und Evaluierung von Zytokinfusionsproteinen zur selektiven Verst��rkung der antigenspezifischen Immunantworten bildeten den dritten Schwerpunkt der vorliegenden Arbeit. Zur weiteren Verst��rkung der Antik��rperantwort wurde basierend auf den Resultaten aus dem zweiten Teil ein IL2-IgM Fusionskonstrukt hergestellt. Die Ko-Transfektion von Antigen-IgM und IL2-IgM kodierender IVT-RNA f��hrte zu einer signifikant st��rkeren Antik��rperantwort als die Ko-Transfektion von Antigen-IgM und IL2. F��r die Initiierung einer erfolgreichen anti-Tumor-Immunantwort ist das Priming antigenspezifischer T-Zellen essentiell. Um die Effizienz dieses Prozesses zu steigern, wurde ein bifunktionelles IL2-mCD40L Fusionskonstrukt hergestellt und sein Einfluss auf die Effektorfunktion von DCs in vitro und in vivo untersucht. Es wurde gezeigt, dass ein RNA kodiertes IL2-mCD40L Fusionsprotein als genetisches Adjuvanz zu einer Effizienzsteigerung des Priming zytotoxischer T-Zellen f��hrt. Somit wurden in dieser Arbeit durch die Optimierung der Pharmakokinetik, die Modifikation der Antigenform und die Herstellung und Evaluierung von Zytokinfusionskonstrukten als genetische Adjuvantien, RNA-basierte Impfstoffe f��r eine optimierte Induktion von antigenspezifischen Immunantworten weiter verbessert.

Induktion und Analyse spezifischer Immunantworten nach intranodaler Immunisierung mit RNA im murinen Modell

Die Wirksamkeit einer Vakzine ist von vielen Parametern abh��ngig. Dazu geh��ren unter anderen: das ausgew��hlte Antigen, die Formulation in der das Antigen benutzt wird sowie die Applikationsroute. Antigen-kodierende Ribonukleins��uren (RNA) gilt heutzutage als eine sichere und effiziente Alternative zu traditionellen Impfstoff-Formulierungen, wie Peptiden, rekombinanten Proteinen, viralen Systemen oder DNA basierten Impfstoffen. Bez��glich des Applikationsortes repr��sentiert der Lymphknoten ein optimales Milieu f��r die Interaktion zwischen antigenpr��sentierenden Zellen und T-Zellen. Vor diesem Hintergrund war die Zielsetzung dieser Arbeit, ein auf direktem in vivo Transfer von Antigen-kodierender in vitro transkribierter RNA (IVT-RNA) basierendes Impfverfahren zu entwickeln, zu charakterisieren und auf seine anti-tumorale Wirksamkeit zu testen. In der vorliegenden Arbeit konnte gezeigt werden, dass dendritische Zellen (DCs) in vitro hocheffizient mit IVT-RNA transfiziert werden k��nnen und eine hohe stimulatorische Kapazit��t besitzen. Durch Sequenzmodifikation der IVT-RNA konnten wir die Transkriptstabilit��t und Translationseffizienz erh��hen was zu einer Steigerung der stimulatorischen Kapazit��t in vivo f��hrte. Dar��ber hinaus untersuchten wir die Auswirkung der Insertion eines Signalpeptides 5��� sowie einer C-terminalen transmembran- und zytosolischen-Dom��ne eines MHC-Klasse-I-Molek��ls am 3��� der Antigen-kodierenden Sequenz auf die Effizienz der MHC-Klasse-I und -II Pr��sentation. Wir konnten in vitro und in vivo nachweisen, dass diese Modifikation zu einer gesteigerten, simultanen Stimulation von antigenspezifischen CD4+ und CD8+ T-Zellen f��hrt. Auf der Basis der optimierten Vektorkassetten etablierten wir die intranodale (i.n.) Transfektion von antigenpr��sentierenden Zellen in der Maus. Dazu nutzten wir verschiedene Reportersysteme (eGFP-RNA, fluoreszensmarkierte RNA) und konnten zeigen, dass die intranodale Applikation von IVT-RNA zu selektiven Transfektion und Maturation lymphknotenresidenter DCs f��hrt. Zur Untersuchung der immunologischen Effekte wurden in erster Linie auf Influenza-Hemagglutinin-A und Ovalbumin basierende Modellantigensysteme verwendet. Beide Antigene wurden als Antigen-MHC-Fusionskonstrukte genutzt. Als Responderzellen wurden TCR-transgene Lymphozyten verwendet, die MHC-Klasse-I oder -Klasse-II restringierte Epitope des Influenza-Hemagglutinin-A bzw. des Ovalbumin-Proteins erkennen. Wir konnten in vivo zeigen, dass die intranodale Immunisierung mit IVT-RNA zu einer effizienten Stimulation und Expansion von antigenspezifischen CD4+ und CD8+ T-Zellen in einer dosisabh��ngigen Weise f��hrt. Funktionell konnte gezeigt werden, dass diese T-Zellen Zytokine sezernieren und zur Zytolyse bef��higt sind. Wir waren in der Lage durch repetitive i.n. RNA Immunisierung ein ���Priming��� CD8+ T-Zellen in naiven M��usen sowohl gegen virale als auch gegen Tumor assoziierte Antigene zu erreichen. Die geprimten T-Zellen waren bef��higt eine zytolytische Aktivit��t gegen mit spezifischem Peptid beladene Targetzellen zu generieren. Dar��ber hinaus waren wir in der Lage Ged��chtnisszellen expandieren zu k��nnen. Abschlie��end konnten wir in Tumormodellen sowohl in prophylaktischen als auch in therapeutischen Experimenten zeigen dass die i.n. RNA Vakzination die Potenz zur Induktion einer anti-tumoralen Immunit��t besitzt.

The role of EBI-3 in a murine model of lung metastases of melanoma

In dieser Arbeit wurde die Rolle des Epstein-Barr Virus induzierten Gens 3 in einem Mausmodel des durch B16-F10 Zellen hervorgerufenen metastasierenden Melanoms untersucht. Das von aktivierten antigenpr��sentierenden Zellen exprimierte EBI-3 geh��rt zur Familie der l��slichen Typ 1 Zytokinrezeptoren, weist eine hohe Homologie zur p40 Untereinheit des IL-12 auf und bildet zusammen mit p28 das IL-27. Die intraven��se Injektion der B16-F10 Zelllinie f��hrte zu einer signifikanten Erniedrigung der Tumormetastasen in den EBI-3 defizienten Lungen sowie zu einer h��heren Lebenserwartung dieser M��use im Vergleich zu den B6 Wildtypen. Dar��ber hinaus habe ich in den EBI-3 defizienten M��usen eine verminderte VCAM-1 Expression auf den Endothelzellen der Lunge gefunden w��hrend ��nderungen in der VEGF Expression nicht detektiert wurden. Der immunologische Hintergrund, der diesen therapeutischen Effekt hervorrief, konnte durch die T-Zellaktivierung durch die k��rzlich neu beschriebene DC Population, welche Interferon-produzierende Killer Dendritische Zellen genannt werden (IK-DC), die zus��tzlich von aktivierten und maturierten klassischen DCs unterst��tzt wurden, erkl��rt werden. IK-DCs von EBI-3 defizienten M��usen produzierten h��here Mengen an IFN-g w��hrend die klassischen DCs MHC und co-stimulatorische Molek��le exprimierten, welche die Sekretion von IL-12 initiierten. Das Zusammenspiel der genannten Faktoren induzierte eine verst��rkte CD4 und CD8 T-Zellantwort in den Lungen dieser M��use. Dies wiederum resultierte im TNF-��� und TRAIL abh��ngigen programmierten Zelltod der B16-F10 Melanomzellen in den Lungen der EBI-3 defizienten M��use, wohingegen sowohl weitere anti-apoptotische Mechanismen als auch T regulatorische Zellen keinen Einfluss auf die in den EBI-3 defizienten M��usen beobachtete Tumorabwehr zu spielen scheint. Schlussendlich konnten EBI-3 defiziente CD8+ T-Zellen, welche zuvor mit Tumorantigen geprimed wurden, adoptiv in B6 Wildtypm��use transferiert werden, was zeigte, dass diese Zellen in der Lage sind, die Tumormasse in den Empf��ngerm��usen signifikant zu verringern. Zusammengefasst, demonstrieren diese Daten, dass das Blockieren von EBI-3 im metastasierenden Melanom ein vielversprechender Angriffspunkt in der Tumortherapie darstellt.

Host immune response in immunodeficient mice against infection with Cryptosporidium parvum

Immunantwort von immundefizienten M��usen gegen��ber Infektionen mit Cryptosporidium parvum. Cryptosporidium parvum ist ein intrazellul��rer, protozoischer Krankheitserreger, der im immunkompromittierten Wirt zu lebensbedrohender Enteritis f��hren kann. CD4+ T-Zellen und Interferon (IFN)-�� spielen wesentliche Rollen bei der Wirtsimmunantwort gegen die Infektion. Dennoch sind die Effektormechanismen, die zur Resistenz f��hren nur wenig verstanden. In dieser Studie wurde die Immunantwort von IFN-��- und Interleukin (IL)-12-Defektm��usen parallel zu Wildtypm��usen analysiert. Die Ergebnisse identifizierten IFN-�� als Schl��sselzytokin bei der nat��rlichen und erworbenen Immunit��t w��hrend der Erst- und Folgeinfektion mit C. parvum. Tumornekrosefaktor (TNF)-�� ist m��glicherweise ein Induktor der fr��hen IFN-��-Antwort in IL-12 Knockout-M��usen. Weiterhin tragen offenbar sowohl Th1- als auch Th2-Zytokine zur ��berwindung der Prim��rinfektion bei, die ersten mehr als die letztgenannten. Zytokingene waren am Ort der Infektion (Ileum) dramatisch ver��ndert, nicht aber in den lokalen Lymphknoten und der Milz. Nach Folgeinfektion ergab sich in Abwesenheit von IFN-�� eine signifikante Erh��hung der Th2-Zytokine IL-5 and IL-13. Die Ergebnisse zeigten weiterhin, dass das Th1-Zytokin IL-18 zur Resistenz gegen��ber C. parvum beitr��gt, m��glicherweise durch verschiedene Immunfunktionen, wie der Regulation von Serum-IFN-�� w��hrend der Infektion und/oder der Erhaltung der Homeostase der Th1/Th2-Zytokine durch Regulation der Th2-Zytokine. Weiterhin zeigten diese Untersuchungen den Transfer von Resistenz gegen��ber C. parvum von infizierten auf na��ve M��use mittels stimulierter intraepithelialer Lymphozyten und CD4+ T-Zellen. Diese Ergebnisse weisen auf die Gegenwart von C. parvum-spezifischen CD4+ T-Zellen in anderen lymphatischen Geweben neben der Darmmukosa hin. Eine Stimulation der Spendertiere durch Infektion war notwendig f��r eine ��bertragbare sch��tzende Immunit��t. Dennoch konnte die ��bertragene Immunit��t nicht die Infektion der Empf��ngertiere vollst��ndig verhindern; eine Verdopplung der Spenderzellen f��hrte zu keinem besseren Ergebnis. Weiterhin ergab der Transfer von CD4+ und CD8+ T-Zellen (Pan-T-Zellen) keinen erh��hten Schutz der naiven Empf��ngertiere als der alleinige Transfer von CD4+ T-Zellen. Dies weist auf die fehlende Bedeutung der CD8+ T-Zellen beim Schutz vor C. parvum-Infektion hin.

Therapeutic vaccination for chronic hepatitis B in the Trimera mouse model

Therapeutic vaccination for chronic hepatitis B in the Trimera mouse modelrnRaja Vuyyuru and Wulf O. B��cherrnHepatitis B is a liver disease caused by Hepatitis B virus (HBV). It ranges in severity from a mild illness, lasting a few weeks (acute), to a serious long-term (chronic) illness that can lead either to liver disease or liver cancer. Acute infection is self limiting in most adults, resulting in clearance of virus from blood and liver and the development of lasting immunity. However 5% of acutely infected patients do not resolve primary HBV infection, leading to chronic infection with persistent viral replication in the liver. The strength of the initial antiviral immune response elicited to Hepatitis B determines the subsequent clinical outcome. A strong and broad T cell response leads to spontaneous resolution. Conversely, a weak T cell response favours viral persistence and establishment of chronic disease. While treatments using interferon-alpha or nucleos(t)ide analogues can reduce disease progression, they rarely lead to complete recovery. The lack of a suitable small animal model hampered efforts to understand the mechanisms responsible for immune failure in these chronic patients.rnIn current study we used Trimera mice to study the efficacy of potential vaccine candidates using HBV loaded dendritic cells in HBV chronic infection in vivo. The Trimera mouse model is based on Balb/c mice implanted with SCID mouse bone marrow and human peripheral blood mononuclear cells (PBMC) from HBV patients, and thus contains the immune system of the donor including their HBV associated T cell defect.rnIn our present study, strong HBV specific CD4+ and CD8+ T cell responses were enhanced by therapeutic vaccination in chronic HBV patients. These T cell responses occurred independently of either the course of the disease or the strength of their underlying HBV specific T cell failure. These findings indicate that the Trimera mouse model represents a novel experimental tool for evaluating potential anti-HBV immunotherapeutic agents. This in vivo data indicated that both the HBV specific CD4+ cell and CD8+ responses were elicited in the periphery. These HBV specific T cells proliferated and secreted cytokines upon restimulation in Trimera mice. The observation that these HBV specific T cells are not detectable directly ex vivo indicates that they must be immune tolerant or present at a very low frequency in situ. HBV specific T cell responses were suppressed in Trimera mice under viremic conditions, suggesting that viral factors might be directly involved in tolerizing or silencing antiviral T cell responses. Thus, combination of an effective vaccine with antiviral treatment to reduce viremia might be a more effective therapeutic strategy for the future. Such approaches should be tested in Trimera mice generated in HBV or HBs expressing transgenic mice before conducting clinical trials.rn

Die Rolle der Ubiquitin-Ligase Smurf2 in T-Lymphozyten bei der Entwicklung von chronisch entz��ndlichen Darmerkrankungen

TGF-beta ist ein Schl��sselmolek��l zellvermittelter Immuntoleranz. So spielt es neben seiner pleiotropen Rolle in Immunzellen auch bei der Tumorentwicklung eine gro��e Rolle. Das TGF-beta hat bei der Tumorentwicklung eine duale Rolle. So dient es in fr��hen Phasen als Tumorsuppressor, w��hrenddessen es in sp��ten Phasen der Entwicklung als Tumorpromotor wirkt. Eine strikte Regulation des TGF-beta Signalweges ist daher f��r ein funktionierendes Immunsystem von essentieller Bedeutung. Die Ubiquitin Ligase Smurf2 ist dabei ein wichtiger negativ Regulator des TGF-beta Signalweges.In der vorliegenden Arbeit konnte eine neue Splei��form des Smurf2 (dE2Smurf2) aus murinen CD4+ T-Zellen isoliert werden, deren Funktion in vitro und in vivo in T-Lymphozyten untersucht worden ist. F��r diese Splei��form konnte zudem eine humane Relevanz nachgewiesen werden. Mit Hilfe von ��berexpressionen in Cos7 Zellen konnte eine ver��nderte Lokalisation der Smurf2 Splei��formen (WT und dE2) festgestellt werden. Dabei konnten lysosomale und endosomale Kompartimente bei der Kolokalisation mit dem dE2Smurf2 Konstrukt beobachtet werden. Das Splei��en des Exons2 f��hrte dabei zu ��nderungen der Topologie der N-terminalen C2-Dom��ne, wodurch sich eine ver��nderte Lokalisation in der Zelle beschreiben lie��. Mit der ver��nderten intrazellul��ren Verteilung erfuhr auch die Funktion der dE2Smurf2 Ubiquitin Ligase eine ��nderung. So konnte ��berraschenderweise eine positive Signalinduktion des TGF-beta Signalweges beobachtet werden, was im Gegensatz zum beschriebenen WTSmurf2 stand. Durch eine ��berexpression des dE2Smurf2 Proteins in T-Lymphozyten wurde der TGF-beta Signalweg in CD4+ und CD8+ Zellen positiv reguliert, dabei wurde der TGFbetaRII vermehrt exprimiert und gleichzeitig fand eine verst��rkte Phosphorylierung der Transkriptionsfaktoren Smad2 und Smad3 nach TGF-beta Stimulation statt. Die transgenen T-Lymphozyten waren somit sensitiver gegen��ber TGF-beta. Dies f��hrte zur Hypothese, die durch Western Blot Analyse best��tigt werden konnte, da�� das dE2Smurf2 nach ��berexpression seine WT-Form bindet und dadurch degradiert. Die Degradation der Ubiquitin Ligase war dabei Smad7 abh��ngig. Zur Analyse des Einflusses der Ubiquitin Ligase dE2Smurf2 auf die Differenzierung von CD4+ T-Zellen, sowie ihre Rolle bei der T-Zell Proliferation, konnte gezeigt werden, da�� durch die h��here Sensitivit��t gegen��ber TGF-beta naive T-Zellen unter Einflu�� von TGF-beta und IL6 vermehrt in TH17 Zellen differenzierten. Zudem konnte gezeigt werden, da�� die Proliferationsrate transgener naiver CD4+ T-Zellen bei geringen Mengen von TGF-beta starkt vermindert war. Weiterhin konnte gezeigt werden, da�� bei einer Differenzierung der naiven CD4+ T-Zellen in TH1 Zellen, diese signifkant weniger das proinflammatorische Zytokin INF�� produzierten.So zeigten in vivo Versuche, da�� die transgenen Tiere in der Entwicklung von Kolorektalen Karzinomen protektiert waren. Sowohl im kolitisassiziierten Tumor Modell als auch bei der spontanen Entwicklung von Tumoren im APCmin Modell. Dies konnte zum einen auf eine deutlich verminderte Entz��ndung (geringere Produktion an Zytokinen durch verminderte Proliferation) des Darms und zum anderen durch eine st��rkere Produktion an zytotoxischen Genen, wie Perforin, INF�� und Granzym B erkl��rt werden. Interessanterweise konnte jedoch im Transfer Kolitis Modell eher eine proinflammatorische Wirkung des dE2Smurf2 Proteins nachgewiesen werden. So wiesen die immundefizienten M��use, in denen die transgenen T-Zellen injiziert wurden, eine signifikant st��rkere Kolitis auf als die Kontrollen. Dies konnte mit einer ��berproduktion an IL17 sezernierenden T-Zellen erkl��rt werden. Klonierungsexperimente f��hrten zudem zur Identifikation einer bisher nicht beschriebenen nicht kodierenden RNA. Diese zeigte in Kombination mit dem dE2Smurf2 Protein in einer Reportergen Analyse eine Hyperaktivierung des Smad3 Promotors. Diese Daten liefern zum einen ein genaueres Modell ��ber die Regulation des TGF-beta Signalweges sowie wichtige Erkenntnisse zur Pathophysiologie chronisch entz��ndlicher Darmerkrankung und daraus resultierende Tumorerkrankungen. So entwickelt sich das dE2Smurf2, Teil des TGF-beta Signalweges, als attraktives Zielprotein f��r die Modulation von chronisch entz��ndlichen Darmerkrankungen und (kolitisassoziierte) Kolonkarzinomen.

Identifizierung und ��berexpression immunregulatorischer Molek��le in dendritischen Zellen zur gezielten Modulation ihrer T-Zell-stimulierenden Eigenschaften

Die Modifizierung von dendritischen Zellen (DCs) in vitro erfolgt meist durch eine Behandlung mit Mediatoren, die den Aktivierungszustand sowie die T-Zell-polarisierenden DC-Eigenschaften ver��ndern. In dieser Doktorarbeit sollten zun��chst mediatorinduzierte tolerogene Schl��sselmolek��le identifiziert werden. Als Modell wurden murine Knochenmarkszellen unter DC-differenzierenden Bedingungen mit dem Glucocorticoid Dexamethason (DEX) behandelt. Die generierten DEX-APCs (antigenpr��sentierende Zellen) zeigten einen protolerogenen, weitgehend maturierungsresistenten Ph��notyp und eine gesteigerte Expression toleranzassoziierter Molek��le. DEX-APCs induzierten in vitro aus CD25+ depletierten allogenen T-Zellen de novo CD4+ und CD8+ regulatorische T-Zellen (Tregs). Basierend auf diesen Ergebnissen und Literaturstudien wurden protolerogene Molek��le f��r eine ��berexpression in DCs selektiert. Da DCs non-viral kaum transfizierbar sind, wurde die lentivirale Transduktion von DCs optimiert, wodurch Effizienzen bis zu 95% erreicht werden konnten. Der mit der Transduktion assoziierte physikalische Stress resultierte in einer partiellen DC-Aktivierung. Trotzdessen zeigten DCs, die die Zytokine IL-10 oder IL-21 ��berexprimierten, einen protolerogenen Ph��notyp und induzierten in vitro Tregs. Beide DC-Populationen reduzierten im therapeutischen Ansatz im murinen Krankheitsmodell der Kontaktallergie haptenspezifisch die Ohrschwellungsreaktion. Auch DCs, die andere Zytokine, intrazellul��re Proteine oder Oberfl��chenrezeptoren mit protolerogenen Eigenschaften ��berexprimierten, wiesen eine jeweils spezifische Genexpressionssignatur auf. Diese DC-Populationen waren zumeist durch eine verminderte allogene T-Zell-Aktivierungskapazit��t gekennzeichnet und ver��nderten die Th1-/Th2-Zytokinmuster in kokultivierten T-Zellen.

Mechanismen zur Suppression der experimentellen akuten Graft-versus-Host-Disease

Die Transplantation von allogenen h��matopoetischen Stammzellen stellt f��r viele Patienten mit h��matologischen Erkrankungen, wie beispielsweise akuter Leuk��mie, oftmals die einzige kurative Therapieoption dar. Die Erkennung von Empf��ngerantigenen durch immunkompetente Zellen des Spenders bietet dabei die Basis f��r erw��nschte Graft-versus-Tumor-Effekte, verursacht jedoch h��ufig au��erdem die unerw��nschte Graft-versus-Host Disease (GvHD), eine mitunter schwerwiegende Komplikation. In der vorliegenden Arbeit wurden potentielle Mechanismen zur Hemmung alloreaktiver CD4+ und CD8+ T-Zellen (TZ) und folglich zur Hemmung der akuten GvHD in einem experimentellen GvHD-Modell untersucht, welches auf dem Transfer von allogenen Zellen zwischen MHC-inkompatiblen Mausst��mmen basiert. Die vorliegende Arbeit weist zum Einen darauf hin, dass das Fehlen MyD88- und TRIF-vermittelter Toll-like-Rezeptor-Signale zumindest im Rahmen des hier verwendeten Transplantationsmodells nicht zwingend zu einer Hemmung der akuten GvHD f��hrt. Zum Anderen konnte belegt werden, dass CD4+ CD25+ regulatorische T-Zellen (Tregs) kompetente Suppressoren der durch alloreaktive CD4+ und CD8+ TZ ausgel��sten akuten GvHD darstellen. In weiterf��hrenden Experimenten ist gezeigt worden, dass die Tregs sich verschiedener Mechanismen bedienen, um ihre Zielzellen zu inhibieren. Das suppressive Zytokin Interleukin-10 kann als l��slicher Mediator zumindest in vitro offenbar eine Rolle bei der Treg-vermittelten Suppression alloreaktiver TZ spielen. Da jedoch auch Tregs aus Interleukin-10-defizienten Spendern die GvHD-Entstehung in den Empf��ngern abschw��chen konnten, m��ssen noch weitere Mechanismen involviert sein. Es konnte in einer gemischten Leukozyten Reaktion in vitro eine zellkontaktabh��ngige Kommunikation mittels gap junctions haupts��chlich zwischen den Tregs und den allogenen Dendritischen Zellen (DCs) nachgewiesen werden, welche prinzipiell den Transfer von cAMP m��glich macht. Die Kommunikation zwischen Tregs und DCs resultierte in einem supprimierten Ph��notyp der DCs, gekennzeichnet durch eine verminderte Expression kostimulatorischer Molek��le auf ihrer Oberfl��che. Solche supprimierten DCs k��nnen als Folge die alloreaktiven Spender-TZ vermutlich nicht aktivieren. Das cAMP-erh��hende Rolipram konnte in einer gemischten Leukozyten Reaktion in vitro die Proliferation alloreaktiver CD4+ und CD8+ TZ hemmen. Daneben konnte die Treg-vermittelte Suppression alloreaktiver TZ und der GvHD in vivo durch die zus��tzliche Verabreichung von Rolipram noch gesteigert werden. Im letzten Kapitel dieser Arbeit wurde beschrieben, dass die alleinige Aktivierung alloreaktiver CD8+ TZ ausreichend ist, um eine akute GvHD auszul��sen. In diesem Zusammenhang konnte nachgewiesen werden, dass CD4+ CD25+ Tregs die akute GvHD auch in einer scheinbar MHC-II-unabh��ngigen Weise hemmen k��nnen. Zusammenfassend belegt die vorliegende Arbeit, dass Tregs in einem MHC-inkompatiblen Transplantationsmodell alloreaktive CD4+ und CD8+ TZ und folglich die Entstehung einer GvHD effizient hemmen k��nnen. Bei der Hemmung der GvHD kommen wahrscheinlich verschiedene Mechanismen zum Tragen. Zumindest in vivo scheint von Tregs produziertes Interleukin-10 eine untergeordnete Rolle bei der Suppression alloreaktiver TZ und der GvHD zu spielen, hierbei steht vermutlich vielmehr der cAMP-abh��ngige Suppressionsmechanismus im Vordergrund.