Post-transkriptionelle Regulation der Expression der humanen induzierbaren NO-Synthase

Die Expression der humanen induzierbaren NO-Synthase (iNOS) wird sowohl über transkriptionelle als auch über post-transkriptionelle Mechanismen reguliert. Dabei spielt die Modulation der iNOS-mRNA-Stabilität durch RNA-bindende Proteine eine bedeutende Rolle. In dieser Arbeit konnte eine Beteiligung des p38-MAPK-Signaltransduktionsweges sowie der RNA-bindenden Proteine TTP, KSRP, HuR und PTB an der Regulation der iNOS-Expression dargestellt werden. Hemmung der p38-MAPK führte zu einer Reduktion der iNOS-mRNA-Expression, hatte aber keinen Effekt auf die iNOS-Promotoraktivität. Das RNA-bindende Protein Tristetraprolin (TTP) erhöhte die Stabilität der iNOS-mRNA nach Zytokin-Stimulation, ohne jedoch mit ihr zu interagieren. Die Proteinexpression von TTP war unter dem Einfluss von Zytokinen erhöht; Inhibition der p38-MAPK verursachte eine Verminderung der Zytokin-stimulierten TTP-Expression. Das „KH-type splicing regulatory protein" (KSRP) übte einen destabilisierenden Effekt auf die iNOS-mRNA aus. Der Abbau der mRNA wird dabei wahrscheinlich durch eine Zytokin-unabhängige Interaktion von KSRP mit dem Exosom vermittelt. Ebenso konnte zwischen KSRP und TTP eine Wechselwirkung beobachtet werden, die nach Induktion der iNOS-Expression mit Zytokinen verstärkt und durch p38-MAPK-Inhibitoren hemmbar war. Des Weiteren konnte gezeigt werden, dass die Bindung von KSRP an die iNOS-mRNA-3’-UTR für die Vermittlung des destabilisierenden Effekts essentiell ist. Eine genaue Lokalisierung der KSRP-Bindungsstelle ergab, dass KSRP ebenso wie HuR mit dem AU-reichen Element am 3’-Ende der 3’-UTR interagiert. KSRP und HuR sind in der Lage, um diese Bindungsstelle zu konkurrieren. Nach Zytokin-Stimulation war dementsprechend die endogene Bindung von KSRP an die iNOS-mRNA vermindert, während die endogene Bindung von HuR an die iNOS-mRNA verstärkt war. Die Stabilisierung der iNOS-mRNA nach Zytokin-Stimulation ergibt sich demnach aus einer Verminderung der Bindung des KSRP-Exosom-Komplexes an die iNOS-mRNA als Folge der verstärkten Interaktion von TTP und KSRP. Dies ermöglicht parallel eine vermehrte Bindung von HuR an die iNOS-3’-UTR und führt damit zu einer Stabilisierung der iNOS-mRNA und so letztendlich auch zu einer Erhöhung der iNOS-Expression. Außerdem konnte eine Beteiligung des Polypyrimidin-Trakt-bindenden Proteins (PTB) an der Regulation der humanen iNOS-Expression gezeigt werden. PTB erhöhte die Expression der iNOS und interagierte Zytokin-unabhängig mit KSRP. Zusammenfassend lässt sich schließen, dass ein Zusammenspiel verschiedener Proteine in einem komplexen Netzwerk für die fein abgestimmte Regulation der humanen iNOS-Expression auf post-transkriptioneller Ebene verantwortlich.

Die Bedeutung von NFAT-Transkriptionsfaktoren für die Expression von Mastzell-Cytokinen

Zusammenfassung Die Rolle verschiedener Mitglieder der NFAT- Familie in der Entwicklung von T- Zellen und deren Funktion wird intensiv untersucht, wohingegen vergleichbare Untersuchungen in Mastzellen rar sind. Mastzellen exprimieren eine Vielzahl biologisch hochaktiver Mediatoren und sind auf diese Weise sowohl in angeborenen als auch adaptiven Immunantworten beteiligt. Die von Mastzellen produzierten Th2-Cytokine verstärken lokal Th2- Reaktionen und TNF-alpha ist ein wichtiger Initiator antimikrobieller Antworten. In dieser Arbeit wird gezeigt, dass die Transkriptionsfaktoren NFATc1 und NFATc2 eine bedeutende Rolle in der Regulation der Expression von TNF-alpha und IL-13 einnehmen, wohingegen NFATc3 hierbei keine Funktion zukommt. Murine „Bone marrow derived mast cells“ (BMMC) aus NFATc2- defizienten Mäusen, aktiviert entweder durch Kreuzvernetzung des IgE- Rezeptors oder Ionomycin, zeigen eine drastisch reduzierte Expression dieser Cytokine verglichen mit Mastzellen aus Wildtyp- Mäusen. Genauere Untersuchungen zeigen, dass sowohl NFATc2 als auch NFATc1 an der Expression von IL-13 und TNF-alpha beteiligt sind, wohingegen sie auf die Degranulation und die Expression von IL-6 keinen Einfluss nehmen. Zusammenfassend scheint eine hohe Aktivität von NFAT- Faktoren für die Induktion des IL-13 und TNF-alpha Promoters in Mastzellen erforderlich zu sein, unabhängig davon, ob diese durch NFATc2 oder NFATc1 oder eine Kombination beider Transkriptionsfaktoren bewerkstelligt wird.

Immunoconiugati contenenti tossine vegetali o siRNA per la deplezione selettiva di cellule leucemiche. Preparazione, citotossicità e studi di mutagenesi sito-specifica.

CD33 is a myeloid cell surface marker absent on normal hematopoietic stem cells and normal tissues but present on leukemic blasts in 90% of adult and paediatric acute myeloid leukaemia (AML) cases. By virtue of its expression pattern and its ability to be rapidly internalized after antibody binding, CD33 has become an attractive target for new immunotherapeutic approaches to treat AML. In this study two immunoconjugates were constructed to contain a humanised single-chain fragment variable antibody (scFv) against CD33 in order to create new antibody-derived therapeutics for AML. The first immunoconjugate was developed to provide targeted delivery of siRNAs as death effectors into leukemic cells. To this purpose, a CD33-specific scFv, modified to include a Cys residue at its C-terminal end (scFvCD33-Cys), was coupled through a disulphide bridge to a nona-d-arginine (9R) peptide carrying a free Cys to the N-terminal. The scFvCD33-9R was able to completely bind siRNAs at a protein to nucleic acid ratio of about 10:1, as confirmed by electrophoretic gel mobility-shift assay. The conjugate was unable to efficiently transduce cytotoxic siRNA (siTox) into the human myeloid cell line U937. We observed slight reductions in cell viability, with a reduction of 25% in comparison to the control group only at high concentration of siTox (300 nM). The second immunoconjugate was constructed by coupling the scFvCD33-Cys to the type 1 ribosome inactivating protein Dianthin 30 (DIA30) through a chemical linking The resulting immunotoxin scFvCD33-DIA30 caused the rapid arrest of protein synthesis, inducing apoptosis and leading ultimately to cell death. In vitro dose-dependent cytotoxicity assays demonstrated that scFvCD33-DIA30 was specifically toxic to CD33-positive cell U937. The concentration needed to reach 50 % of maximum killing efficiency (EC50) was approximately 0.3 nM. The pronounced antigen-restricted cytotoxicity of this novel agent makes it a candidate for further evaluation of its therapeutic potential.

Der Einfluss der regulierten Expression der onkogenen Kinase PKB,Akt auf die T-Zell-vermittelte Tumorabstoßung

Eine wesentliche Voraussetzung für die maligne Transformation von Zellen ist die Inaktivierung des programmierten Zelltodes (Apoptose). Die dabei erworbenen Defekte der Apoptose-Signalwege führen häufig zu Resistenzen gegenüber Radio- und Chemotherapien. Immuntherapeutische Ansätze haben zum Ziel, solche resistenten Tumorzellen spezifisch zu entfernen. Resistenzen gegenüber Immuntherapien können wiederum in einer gestörten Immunerkennung der Tumorzellen oder deren Resistenz gegenüber Immuneffektormechanismen begründet sein. Ziel der vorliegenden Arbeit war, zu überprüfen, ob durch Proteinkinase B (PKB)/Akt Immunresistenz vermittelt werden kann. Hierbei zeigte sich, dass die Aktivierung des PKB/Akt-Signalweges in Tumorzellen einen deutlichen Schutz gegenüber verschiedenen Apoptosestimuli in vitro vermittelt. Die konditionale Aktivierung von PKB/Akt hemmte sowohl die pharmakologisch, als auch die durch ZTL induzierte Apoptose-Signalkaskade über eine posttranskriptionelle Stabilisierung des anti-apoptotischen Proteins MCL-1. Diese Beobachtung konnte auch in einem murinen Tumorimmuntherapiemodell in vivo bestätigt werden. Unstimulierte Splenozyten von C57Bl/6-Mäusen wurden adoptiv in NOD/SCID-Mäuse mit etablierten, PKB/Akt-exprimierenden, murinen Fibrosarkomen transferiert. Die konditionale Aktivierung von PKB/Akt inhibierte den tumorsuppressiven Effekt dieser transplantierten Splenozyten signifikant. Des Weiteren konnte gezeigt werden, dass die PKB/Akt-abhängige Immunresistenz auch in vivo durch anti-apoptotisches MCL-1 vermittelt wird. PKB/Akt-exprimierende Fibrosarkome mit supprimierter endogener MCL-1-Expression verloren ihre Resistenz gegenüber der durch adoptiven Splenozytentransfer vermittelten Tumorsuppression. Dies bestätigte endogenes MCL-1 als entscheidenden Faktor der PKB/Akt-vermittelten Immunresistenz. Ferner konnte gezeigt werden, dass eine Hemmung der PKB/Akt-induzierten Signaltransduktion auf der Ebene der nachgeschalteten Kinase mTOR etablierte Fibrosarkome gegenüber adoptiver Lymphozytentherapie sensitiviert. Der mTOR-Inhibitor Rapamycin verhinderte die PKB/Akt-induzierte Aufregulation von MCL-1 und die damit einhergehende Resistenzentwicklung in vivo. Zusammengefasst wurde erstmalig gezeigt, dass eine Deregulation des PKB/Akt-Signalweges Resistenz gegenüber immunologischer Tumorsuppression vermitteln kann. PKB/Akt stellt somit ein entscheidendes Zielmolekül für die Verbesserung von Krebsimmuntherapien dar.

Analysis of the influence of epitope flanking regions on MHC class I restricted antigen presentation

Peptides presented by MHC class I molecules for CTL recognition are derived mainly from cytosolic proteins. For antigen presentation on the cell surface, epitopes require correct processing by cytosolic and ER proteases, efficient TAP transport and MHC class I binding affinity. The efficiency of epitope generation depends not only on the epitope itself, but also on its flanking regions. In this project, the influence of the C-terminal region of the model epitope SIINFEKL (S8L) from chicken ovalbumin (aa 257-264) on antigen processing has been investigated. S8L is a well characterized epitope presented on the murine MHC class I molecule, H-2Kb. The Flp-In 293Kb cell line was transfected with different constructs each enabling the expression of the S8L sequence with different defined C-terminal flanking regions. The constructs differed at the two first C-terminal positions after the S8L epitope, so called P1’ and P2’. At these sites, all 20 amino acids were exchanged consecutively and tested for their influence on H-2Kb/S8L presentation on the cell surface of the Flp-In 293Kb cells. The detection of this complex was performed by immunostaining and flow cytometry. The prevailing assumption is that proteasomal cleavages are exclusively responsible for the generation of the final C-termini of CTL epitopes. Nevertheless, recent publications showed that TPPII (tripeptidyl peptidase II) is required for the generation of the correct C-terminus of the HLA-A3-restricted HIV epitope Nef(73-82). With this background, the dependence of the S8L generation on proteasomal cleavage of the designed constructs was characterized using proteasomal inhibitors. The results obtained indicate that it is crucial for proteasomal cleavage, which amino acid is flanking the C-terminus of an epitope. Furthermore, partially proteasome independent S8L generation from specific S8L-precursor peptides was observed. Hence, the possibility of other existing endo- or carboxy-peptidases in the cytosol that could be involved in the correct trimming of the C-terminus of antigenic peptides for MHC class I presentation was investigated, performing specific knockdowns and using inhibitors against the target peptidases. In parallel, a purification strategy to identify the novel peptidase was established. The purified peaks showing an endopeptidase activity were further analyzed by mass spectrometry and some potential peptidases (like e.g. Lon) were identified, which have to be further characterized.

Immunmodulatorische Konsequenzen einer Eph-Rezeptorspaltung durch MMP-7

Tumore haben die Fähigkeit ihr Mikromilieu zu modulieren, um so ihre Entwicklung und ihre Ausbreitung zu fördern oder sich vor Angriffen des Immunsystems zu schützen. Die Expression der Matrix Metalloproteinasen 7 (MMP-7) wurde in vielen verschiedenen Tumoren analysiert. Neben prometastatischen und wachstumsfördernden Funktionen wurden auch antiapoptotische Wirkungen von MMP-7 auf die Tumorzellen belegt (Strand et al., 2004). Doch noch sind nicht alle immunmodulatorischen Eigenschaften von MMP-7 aufgeklärt worden. Ziel der vorliegenden Arbeit war es, die immunologischen Konsequenzen einer MMP-7 Expression durch Tumorzellen zu untersuchen.rnIm Rahmen dieser Arbeit konnte gezeigt werden, dass MMP-7 über die Spaltung der Rezeptortyrosinkinase EphB2 die Aktinpolymerisation und dadurch auch die Endozytose in Zellen verändern kann. EphB2 wurde als Target einer MMP-7 vermittelten Spaltung identifiziert. Die Untersuchungen mit MMP-7 überexprimierenden Hek 293 EcR Zellen und MMP-7 behandelten DCs zeigten unter dem Einfluss von MMP-7 eine wesentlich geringere EphB2 Expression auf deren Zelloberflächen. Zudem konnte durch in vitro Spaltversuche und anschließende Sequenzierung die Schnittstelle der MMP-7 induzierten Spaltung von EphB2 bestimmt werden. Anschließende Analysen belegten, dass durch die MMP-7 vermittelte Spaltung von EphB2 die Aktivierung der kleinen GTPasen Rac1 und Cdc42 stark reduziert wurden. Die Funktion von Cdc42 und Rac1 während der Aktinpolymerisation, als auch innerhalb der EphB2- Signalkaskade wurde bereits beschrieben (Irie and Yamaguchi, 2002). In der vorliegenden Arbeit wurde gezeigt, dass MMP-7 die Aktinpolymerisation in Zellen reduzierte, was warscheinlich eine direkte Auswirkung der EphB2 Spaltung war. rnWeitere Versuche ließen einen Zusammenhang zwischen der reduzierten Aktinpolymerisation und der verminderten Endozytose in MMP-7 behandelten Zellen erkennen. Unter dem Einfluss von MMP-7 konnte sowohl in Hek 293 EcR MMP7 Zellen als auch in unreifen DCs eine Reduktion der endozytotischen Aktivität ermittelt werden.rnUntersuchungen mit humanen T-Zellen zeigten auch hier einen verminderten Nachweis von EphB2 auf den Zellen, wenn diese vorher mit MMP-7 inkubiert wurden. Zudem führte die Anwesenheit von MMP-7 in T-Zellen ebenfalls zu einer verminderten Aktinpolymerisation. Die mit der Aktinpolymerisation verbundene Restrukturierung des Zytoskeletts gilt als essentieller Prozess für die T-Zellaktivität (Tskvitaria-Fuller et al., 2003; Krummel et al., 2000). Anschließende Versuche konnte daher nicht nur eine Beeinträchtigung von MMP-7 auf die zytotoxische Aktivität von T-Zellen belegen, sondern deuteten auch auf eine verminderten Proliferation nach Antigenstimulation unter dem Einfluss von MMP-7 hin.rnDie Rolle von MMP-7 aber auch die von EphB2 in der Tumorimmunologie wurde bereits untersucht. So konnte eine induzierte Überexpression von EphB2 das Krebszellwachstum, die Adhäsion und die Migration inhibieren, während der Verlust der EphB2 Expression zu einer verstärkten Invasion und Metastisierung von Tumorzellen führte (Guo et al., 2006). Zudem konnte gezeigt werde, dass Tumorzellen die Funktion von DCs beeinflussen können. DCs aus tumortragenden Mäusen zeigten im Vergleich zu Kontrollzellen eine reduzierte Aktivierung von Cdc42 und Rac1 und zudem eine verminderte Endozytoseaktivität (Tourkova et al., 2007). Die in der vorliegenden Arbeit gezeigten MMP-7 bedingten Veränderungen der Aktinpolymerisation stellen womöglich eine Verbindung zwischen den genannten Untersuchungen her und offenbaren weitere immunologische Konsequenzen einer MMP-7 Expression im Tumor. rnrn

Analysen zur Expression proinflammatorischer Mediatoren in humanen Zellkulturmodellen und murinen Tiermodellen chronisch-inflammatorischer Erkrankungen

Die humane induzierbare NO-Synthase (iNOS) spielt bei zahlreichen Erkrankungen wie Asthma, Krebs und der rheumatoiden Arthritis eine entscheidende Rolle. Durch Fehlregulation der iNOS-Expression kommt es häufig zu massiven Gewebeschädigungen. Aus diesem Grund ist es wichtig die Mechanismen der Genregulation der iNOS-Expression zu verstehen. Bei Affinitätschromatographie-Analysen wurde das zytosolische PolyA-bindende Protein (PABP) als direkter Interaktionspartner der 3´UTR der humanen iNOS identifiziert. Weitere Bindungsanalysen konnten eine spezifische Bindestelle für PABP in der 5´UTR und zwei Bindestellen im AU-reichen Bereich der 3´UTR der humanen iNOS nachweisen. Eine siRNA-mediierte Herabregulation von PABP mit Hilfe der stabilen Expression spezifischer siRNAs in DLD-1 Zellen (siPABP Zellen) zeigte eine signifikant verringerte Expression der humanen iNOS und damit einhergehend eine verringerte NO-Produktion nach Zytokinstimulation. Promotoranalysen zeigten keine Veränderung der Induzierbarkeit des humanen 16 kb iNOS-Promotors in siPABP Zellen. RNA-Stabilitätsanalysen zeigten einen verstärkten Abbau der iNOS-mRNA in diesen Zellen, so dass davon auszugehen ist, dass die Regulation der humanen iNOS über die mRNA-Stabilität erfolgt. Reportergen-Analysen mit Plasmiden, welche die 5’ und/oder 3’UTR Sequenzen der humanen iNOS mit den identifizierten PABP-Bindestellen oder Mutationen in diesen Bindestellen enthielten, zeigten, dass PABP die iNOS-mRNA über die 5´UTR stabilisiert und anscheinend über die 3´UTR einen destabilisierenden Effekt auf die mRNA ausübt. Ebenfalls scheint PABP über die 3’UTR dieTranslation der iNOS mRNA zu hemmen. Die Ergebnisse dieser Arbeit zeigen, dass PABP, über seine allgemeinen Funktionen hinaus, eine spezifische Rolle in der Regulation der Expression der humanen iNOS einnimmt.rnDie rheumatoide Arthritis (RA) ist eine chronisch entzündliche Autoimmunerkrankung, welche überwiegend die peripheren Gelenke der Hände und Füße betrifft. Die aktuellen Therapiemöglichkeiten sind immer noch mit einer Vielzahl von Nebenwirkungen behaftet und führen nicht zur vollständigen Remission der Erkrankung, so dass die Entwicklung neuer Medikamente unerlässlich ist. In dieser Arbeit wurden die antiinflammatorischen Substanzen Gallielalacton (Gal) und Oxacyclododecindion (Oxa) im Mausmodell der kollagen-induzierten Arthritis (CIA) getestet. Leider waren beide Substanzen nicht in der Lage die Symptome der CIA zu vermindern, obwohl beide im Modell der LPS-induzierten akuten Entzündung die Expression proinflammatorischer Mediatoren senken konnten. Die Substanz S-Curvularin (SC) hat sich im CIA-Modell bereits bewährt und wurde in dieser Arbeit weiter untersucht. SC war in der Lage die Expression knorpel- und knochendestruktiver Markergene signifikant zu verrindern. rnIn der vorliegenden Arbeit wurden neue microRNAs identifiziert, die in der Pathogenese der CIA eine Dysregulation zeigen. Die Expression dieser microRNAs wurde von SC wieder auf das Normalniveau gebracht, so dass SC eine vielversprechende Substanz in der Therapie chronisch inflammatorische Erkrangungen sein könnte. Die neu identifizierten CIA-relevanten microRNAs könnten als neueRA-Marker oder als Zielstrukturen für neue Medikamente dienen.rn

Improving adoptive T cell therapies of cancer by ectopic expression of miR181a to repress inhibitory phosphatases

Adoptive T cell therapy using antigen-specific T lymphocytes is a powerful immunotherapeutic approach against cancer. Nevertheless, many T cells against tumor-antigens exhibit only weak anti-tumoral response. To overcome this barrier it is necessary to improve the potency and anti-tumoral efficacy of these T cells. Activation and activity of T cells are tightly controlled to inhibit unwanted T cell responses and to reduce the risk of autoimmunity. Both are regulated by extrinsic signals and intrinsic mechanisms which suppress T cell activation. The intrinsic mechanisms include the expression of phosphatases that counteract the activation-inducing kinases. Modifying the expression of these phosphatases allows the targeted modulation of T cell reactivity. MicroRNAs (miRNAs) are regulatory small noncoding RNA molecules that control gene expression by targeting messenger RNAs in a sequence specific manner. Gene-specific silencing plays a key role in diverse biological processes, such as development, differentiation, and functionality. miR181a has been shown to be highly expressed in immature T cells that recognize low-affinity antigens.rnThe present study successfully shows that ectopic expression of miR181a is able to enhance the sensitivity of both murine and human T cells. In CD4+ T helper cells as well as in CD8+ cytotoxic T cells the overexpression of miR181a leads to downregulation of multiple phosphatases involved in the T cell receptor signaling pathway. Overexpression of miR181a in human T cells achieves a co-stimulatory independent activation and has an anti-apoptotic effect on CD4+ T helper cells. Additionally, increasing the amount of miR181a enhances the cytolytic activity of murine CD8+ TCRtg T cells in an antigen-specific manner.rnTo test miR181a overexpressing T cells in vivo, a mouse tumor model using a B cell lymphoma cell line (A20-HA) expressing the Influenza hemagglutinin (Infl.-HA) antigen was established. The expression of model antigens in tumor cell lines enables targeted elimination of tumors using TCRtg T cells. The transfer of miR181a overexpressing Infl.-HA TCRtg CD8+ T cells alone has no positive effect neither on tumor control nor on survival of A20-HA tumor-bearing mice. In contrast, the co-transfer of miR181a overexpressing Infl.-HA TCRtg CD8+ and CD4+ T cells leads to improved tumor control and prolongs survival of A20-HA tumor-bearing mice. This effect is characterized by higher amounts of effector T cells and the expansion of Infl.-HA TCRtg CD8+ T cells.rnAll effects were achieved by changes in expression of several genes including molecules involved in T cell differentiation, activation, and regulation, cytotoxic effector molecules, and receptors important for the homing process of T cells in miR181a overexpressing T cells. The present study demonstrates that miR181a is able to enhance the anti-tumoral response of antigen-specific T cells and is a promising candidate for improving adoptive cell therapy.

Gene expression responses to acute and chronic heat stress in the common reef-building coral Pocillopora verrucosa

Global climate change is impacting coral reefs worldwide, with approximately 19% of reefs being permanently degraded, 15% showing symptoms of imminent collapse, and 20% at risk of becoming critically affected in the next few decades. This alarming level of reef degradation is mainly due to an increase in frequency and intensity of natural and anthropogenic disturbances. Recent evidence has called into question whether corals have the capacity to acclimatize or adapt to climate changes and some groups of corals showed inherent physiological tolerance to environmental stressors. The aim of the present study was to evaluate mRNA expression patterns underlying differences in thermal tolerance in specimen of the common reef-building coral Pocillopora verrucosa collected at different locations in Bangka Island waters (North Sulawesi, Indonesia). Part of the experimental work was carried out at the CoralEye Reef Research Outpost (Bangka Island). This includes sampling of corals at selected sites and at different depths (3 and 12 m) as well as their experimental exposure to an increased water temperature under controlled conditions for 3 and 7 days. Levels of mRNAs encoding ATP synthase (ATPs) NADH dehydrogenase (NDH) and a 70kDa Heat Shock Protein (HSP70) were evaluated by quantitative real time PCR. Transcriptional profiles evaluated under field conditions suggested an adaptation to peculiar local environmental conditions in corals collected at different sites and at the low depth. Nevertheless, high–depth collected corals showed a less pronounced site-to-site separation suggesting more homogenous environmental conditions. Exposure to an elevated temperature under controlled conditions pointed out that corals adapted to the high depth are more sensitive to the effects of thermal stress, so that reacted to thermal challenge by significantly over-expressing the selected gene products. Being continuously exposed to fluctuating environmental conditions, low-depth adapted corals are more resilient to the stress stimulus, and indeed showed unaffected or down-regulated mRNA expression profiles. Overall these results highlight that transcriptional profiles of selected genes involved in cellular stress response are modulated by natural seasonal temperature changes in P. verrucosa. Moreover, specimens living in more variable habitats (low-depth) exhibit higher basal HSP70 mRNA levels, possibly enhancing physiological tolerance to environmental stressors.

PU.1 is regulated by NF-kappaB through a novel binding site in a 17 kb upstream enhancer element

The majority of patients with acute myeloid leukemia (AML) still die of their disease, and novel therapeutic concepts are needed. Timely expression of the hematopoietic master regulator PU.1 is crucial for normal development of myeloid and lymphoid cells. Targeted disruption of an upstream regulatory element (URE) located several kb upstream in the PU.1 promoter decreases PU.1 expression thereby inducing AML in mice. In addition, suppression of PU.1 has been observed in specific subtypes of human AML. Here, we identified nuclear factor-kappaB (NF-kappaB) to activate PU.1 expression through a novel site within the URE. We found sequence variations of this particular NF-kappaB site in 4 of 120 AML patients. These variant NF-kappaB sequences failed to mediate activation of PU.1. Moreover, the synergistic activation of PU.1 together with CEBPB through these variant sequences was also lost. Finally, AML patients with such variant sequences had suppressed PU.1 mRNA expression. This study suggests that changes of a single base pair in a distal element critically affect the regulation of the tumor suppressor gene PU.1 thereby contributing to the development of AML.

Lysosomal degradation of RhoH protein upon antigen receptor activation in T but not B cells

RhoH is a member of the Rho (ras homologous) GTPase family, yet it lacks GTPase activity and thus remains in its active conformation. Unlike other Rho GTPases, the RhoH gene transcript is restricted to hematopoietic cells and RhoH was shown to be required for adequate T-cell activation through the TCR. Here, we demonstrate that both blood T and B cells, but not neutrophils or monocytes, express RhoH protein under physiological conditions. Upon TCR complex activation, RhoH was degraded in lysosomes of primary and Jurkat T cells. Pharmacologic activation of T cells distal to the TCR complex had no effect on RhoH protein levels suggesting that early events during T-cell activation are required for RhoH protein degradation. In contrast to T cells, activation of the BCR in blood B cells was not associated with changes in RhoH levels. These data suggest that RhoH function might be regulated by lysosomal degradation of RhoH protein following TCR complex but not BCR activation. This newly discovered regulatory pathway of RhoH expression might limit TCR signaling and subsequent T-cell activation upon Ag contact.

Drug antigenicity, immunogenicity, and costimulatory signaling: evidence for formation of a functional antigen through immune cell metabolism

Recognition of drugs by immune cells is usually explained by the hapten model, which states that endogenous metabolites bind irreversibly to protein to stimulate immune cells. Synthetic metabolites interact directly with protein-generating antigenic determinants for T cells; however, experimental evidence relating intracellular metabolism in immune cells and the generation of physiologically relevant Ags to functional immune responses is lacking. The aim of this study was to develop an integrated approach using animal and human experimental systems to characterize sulfamethoxazole (SMX) metabolism-derived antigenic protein adduct formation in immune cells and define the relationship among adduct formation, cell death, costimulatory signaling, and stimulation of a T cell response. Formation of SMX-derived adducts in APCs was dose and time dependent, detectable at nontoxic concentrations, and dependent on drug-metabolizing enzyme activity. Adduct formation above a threshold induced necrotic cell death, dendritic cell costimulatory molecule expression, and cytokine secretion. APCs cultured with SMX for 16 h, the time needed for drug metabolism, stimulated T cells from sensitized mice and lymphocytes and T cell clones from allergic patients. Enzyme inhibition decreased SMX-derived protein adduct formation and the T cell response. Dendritic cells cultured with SMX and adoptively transferred to recipient mice initiated an immune response; however, T cells were stimulated with adducts derived from SMX metabolism in APCs, not the parent drug. This study shows that APCs metabolize SMX; subsequent protein binding generates a functional T cell Ag. Adduct formation above a threshold stimulates cell death, which provides a maturation signal for dendritic cells.

Effect of electroporation-mediated diphtheria toxin A expression on PSA positive human prostate xenograft tumors in SCID mice

Current therapies to treat prostate cancer are often limited. Since it has been shown that very low concentrations of diphtheria toxin A (DT-A) result in abrogation of protein synthesis and apoptosis of cells, DT-A might serve as an efficient killer in cancer gene therapy. For this purpose we investigated in a quantitative manner using a stereological approach the apoptotic effect of DT-A in androgen receptor (AR) and prostate specific antigen (PSA) expressing cells after tumor formation in both flanks of SCID mice.

DARPins recognizing the tumor-associated antigen EpCAM selected by phage and ribosome display and engineered for multivalency

Designed Ankyrin Repeat Proteins (DARPins) represent a novel class of binding molecules. Their favorable biophysical properties such as high affinity, stability and expression yields make them ideal candidates for tumor targeting. Here, we describe the selection of DARPins specific for the tumor-associated antigen epithelial cell adhesion molecule (EpCAM), an approved therapeutic target on solid tumors. We selected DARPins from combinatorial libraries by both phage display and ribosome display and compared their binding on tumor cells. By further rounds of random mutagenesis and ribosome display selection, binders with picomolar affinity were obtained that were entirely monomeric and could be expressed at high yields in the cytoplasm of Escherichia coli. One of the binders, denoted Ec1, bound to EpCAM with picomolar affinity (K(d)=68 pM), and another selected DARPin (Ac2) recognized a different epitope on EpCAM. Through the use of a variety of bivalent and tetravalent arrangements with these DARPins, the off-rate on cells was further improved by up to 47-fold. All EpCAM-specific DARPins were efficiently internalized by receptor-mediated endocytosis, which is essential for intracellular delivery of anticancer agents to tumor cells. Thus, using EpCAM as a target, we provide evidence that DARPins can be conveniently selected and rationally engineered to high-affinity binders of various formats for tumor targeting.

Expression of ADAMTS1 in endothelial cells is induced by shear stress and suppressed in sprouting capillaries

ADAMTS1 inhibits capillary sprouting, and since capillary sprouts do not experience the shear stress caused by blood flow, this study undertook to clarify the relationship between shear stress and ADAMTS1. It was found that endothelial cells exposed to shear stress displayed a strong upregulation of ADAMTS1, dependent upon both the magnitude and duration of their exposure. Investigation of the underlying pathways demonstrated involvement of phospholipase C, phosphoinositide 3-kinase, and nitric oxide. Forkhead box protein O1 was identified as a likely inhibitor of the system, as its knockdown was followed by a slight increase in ADAMTS1 expression. In silico prediction displayed a transcriptional binding site for Forkhead box protein O1 in the promotor region of the ADAMTS1 gene, as well as sites for nuclear factor 1, SP1, and AP-1. The anti-angiogenic effects of ADAMTS1 were attributed to its cleavage of thrombospondin 1 into a 70-kDa fragment, and a significant enhancement of this fragment was indeed demonstrated by immunoblotting shear stress-treated cells. Accordingly, scratch wound closure displayed a slowdown in conditioned medium from shear stress-treated endothelial cells, an effect that could be completely blocked by a knockdown of thrombospondin 1 and partially blocked by a knockdown of ADAMTS1. Non-perfused capillary sprouts in rat mesenteries stained negative for ADAMTS1, while vessels in the microcirculation that had already experienced blood flow yielded the opposite results. The shear stress-dependent expression of ADAMTS1 in vitro was therefore also demonstrated in vivo and thereby confirmed as a mechanism connecting blood flow with the regulation of angiogenesis.