Pseudoxanthoma elasticum : evaluation of diagnostic criteria based on molecular data

RÉSUMÉ EN FRANCAIS : Introduction: Le pseudoxanthome élastique (PXE) est une maladie génétique. Les mutations responsables ont été localisées au niveau du gène codant le transporteur transmembranaire ABC-C6. Des calcifications pathologiques des fibres élastiques de la peau, des yeux et du système cardiovasculaire en sont la conséquence. Buts: Evaluer les critères diagnostiques actuels du PXE en se basant sur les données moléculaires. Méthodes: 142 sujets provenant de 10 familles avec une anamnèse familiale positive pour le PXE ont été investiguées sur le plan clinique, histopathologique et génétique. Résultats: 25 sujets se sont avérés être homozygotes pour le gène PXE muté. 23 d'entre eux ont présenté les manifestations cliniques et histopathologique typiques. Les deux autres souffraient d'une élastose et d'une dégénérescence maculaire si importante qu'un diagnostic de PXE ne pouvait pas être confirmé cliniquement. 67 sujets se sont révélés être des porteurs hétérozygotes et 50 ne présentaient pas de mutation. De ces 117 sujets, 116 n'ont montré aucune lésion cutanée ou ophtalmique pouvant correspondre au PXE. Un seul des sujets sans mutation a présenté une importante élastose solaire ainsi qu'une cicatrisation de la rétine, imitant les lésions typiques du PXE. Quatre des 67 sujets hétérozygotes ont eu une biopsie de peau, dont les analyses histopathologique se sont avérées normales. Conclusion: Dans notre cohorte de patients, le PXE était transmis exclusivement de façoh autosomique récessive. La corrélation retrouvée entre le génotype et le phénotype a permis de confirmer les critères diagnostiques majeurs actuels. Le diagnostic clinique peut être difficile, voir impossible, chez des patients atteints d'une élastose solaire importante et/ou d'une dégénérescence maculaire étendue. Dans ces cas, un test moléculaire est nécessaire afin de confirmer le diagnostic de PXE. A notre connaissance, notre étude présentée ici est le premier travail comparant des données cliniques à des données moléculaires dans le domaine du PXE. ABSTRACT : Background: Pseudoxanthoma elasticum (PXE) is a genetic disorder due to mutations in the gene encoding the transmembrane transporter protein adenosine triphosphate binding cassette (ABC)-C6, resulting in calcifications of elastic fibers in the skin, eyes and cardiovascular system. Objectives: To evaluate the diagnostic criteria for PXE based on molecular data. Methods: Of 10 families with a positive history of PXE 142 subjects were investigated for clinical symptoms, histological findings and genetic haplotype analysis. Results: Of these, 25 subjects were haplotypic homozygous for PXE and 23 had typical clinical and histopathological manifestations. Two of the 25 patients showed such marked solar elastosis and macular degeneration that PXE could not be confirmed clinically. Sixty-seven subject were haplotypic heterozygous carriers and 50 haplotypic homozygous unaffected. Of these 117 subjects, 116 showed no cutaneous or ophthalmologic signs of PXE. In one of the 50 haplotypic homozygous unaffected patients important solar elastosis and scaring of the retina mimicked PXE lesions. Only four of the 67 haplotypic heterozygous carriers had biopsies of nonlesional skin; all were histopathologically normal. Conclusions: In our patients, PXE presents as an autosomal recessive genodermatosis. Correlation of haplotype and phenotype confirmed actual major diagnostic criteria. In patients with marked solar elastosis and/ or severe macular degeneration clinical diagnosis can be impossible and molecular testing is needed to confirm the presence of PXE. To the best of our knowledge our large study compares for the first time clinical findings with molecular data.

Defining molecular components of symbiotic phosphate uptake in rice

Phosphate (Pi) acquisition of crops via arbuscular mycorrhizal (AM) symbiosis acquires increasing importance due to the limited rock Pi reserves and the demand for environmentally sustainable agriculture. However, the symbiotic Pi uptake machinery has not been characterized in any monocotyledonous plant species. Among these, rice is the primary staple food for more than half of the human population and thus central for future food security. However, the relevance of the AM symbiosis for rice Pi nutrition is presently unclear. Here, we show that 70% of the overall Pi acquired by rice is delivered via the symbiotic route. To better understand this pathway we combined genetic, molecular and physiological approaches to determine the specific functions of the two rice Pi transporters, PT11 and PT13, which are expressed only during AM symbiosis. The PT11 lineage of proteins is present in mono- and dicotyledons whereas PT13, while found across the Poaceae, is absent from dicotyledons. Surprisingly, mutations in either PT11 or PT13 affected fungal colonization and arbuscule formation demonstrating that both genes are essential for AM symbiosis between rice and Glomus intra.rad.ices. Importantly, for symbiotic Pi uptake, only PT11 is necessary and sufficient. We found that mycorrhizal rice, remarkably, received almost all Pi via the symbiotic route. Such dominating mycorrhizal Pi uptake was found in plants grown under controlled conditions as well as in field soils, suggesting that the AM symbiosis is relevant for the Pi nutrition of field grown rice. Development of smaller arbuscules in PT11 mutants suggested that symbiotic Pi signaling is required for fungal nourishment by the plant. However, co-culture of mutant with wild type nurse plants did not restore normal arbuscule size in mutant roots, indicating that other factors than malnutrition accounted for the altered arbuscule phenotype. Surprisingly, the loss of PT13 did not affect symbiotic Pi uptake although it impacted arbuscule morphology, suggesting that PT13 is involved in signaling during arbuscule development. However, induction of PT13 was not only monitored in arbusculated cells but also in inner cortex cells of non-inoculated roots of plants grown under high Pi fertilization conditions. According to preliminary observations, PT13 localized at the tonoplast in arbusculated and non-arbusculated cells, suggesting that it might be involved in transporting Pi into the vacuole, possibly for maintaining cellular Pi homeostasis. The further investigation showed that fungal colonization level was significantly affected in the crown roots of two ptlS mutant alleles, but not in large lateral roots, implying the possible role of PT13 for maintaining Pi homeostasis in the crown roots. - L'acquisition de phosphate (Pi) par les plantes cultivées s'effectue grâce à une symbiose mycorhizienne arbasculaire (AM). L'étude de cette symbiose devient fondamentale puisque d'une part, les réserves en phosphate minéral sont limitées, et, d'autre part, la demande pour une agriculture écologiquement soutenable se renforce. La machinerie d'absorption symbiotique du phosphate n'est cependant pas encore élucidée chez les plantes monocotylédones. Parmi celles-ci, le riz occupe une place primordiale. Aliment de base pour plus de la moitié de la population mondiale, il revêt de ce fait une dimension essentielle en termes de sécurité alimentaire. Pourtant, l'importance de la symbiose AM chez le riz dans le processus d'acquisition du phosphate n'est, encore de nos jours, que peu comprise. Dans cette étude, nous montrons que 70% du phosphate acquis par le riz est mis à disposition de la plante grâce à la symbiose AM. Afin de mieux comprendre ce mécanisme, nous avons employé des approches physiologiques et génétiques nous permettant de déterminer les fonctions spécifiques de deux transporteurs de Pi, PT11 et PT13, présents chez le riz et exprimés uniquement durant la symbiose AM. La famille de gènes à laquelle appartient PT11 est présente chez les monocotylédones ainsi que chez les dicotylédones tandis que PT13, bien que retrouvé au sein des Poaceae, est absent chez les dicotylédones. Etonnamment, des versions mutées de PT11 ou de PT13 affectent la colonisation par le champignon endo-mycorhizien ainsi que la formation d'arbuscules, démontrant l'importance de ces deux gènes dans la symbiose AM entre le riz et Glomus intraradices. Il est à noter que seul PT11 se révèle nécessaire et suffisant pour l'apport de Pi grâce à la symbiose. Nous avons observé que la presque totalité du phosphate dont dispose le riz lors d'une symbiose AM provient du champignon. De telles proportions ont été observées tant chez des plantes cultivées en conditions contrôlées que chez des plantes cultivées dans les champs. Cela suggère l'importance de la symbiose AM dans le processus d'acquisition du Pi chez le riz cultivé à l'extérieur. Le développement d'arbuscules plus petits chez le mutant PT11 tend à montrer qu'une voie signalétique impliquant le Pi symbiotique est nécessaire pour l'entretien du champignon par la plante. Toutefois, une co-culture du mutant avec des plantes sauvages ne permet pas de restaurer des arbuscules de taille normale dans les racines du mutant. Ce résultat indique le rôle de facteurs autres que la malnutrition aboutissant à la formation d'arbuscules altérés. Si la perte de PT13 n'affecte pas l'acquisition de phosphate symbiotique, la morphologie de l'arbuscule est, quant à elle, modifiée. Ceci suggère un rôle de PT13 durant le développement de l'arbuscule. Or, l'induction de PT13 est non seulement détectée dans des cellules contenant des arbuscules mais également dans des cellules du cortex, ceci chez des plantes cultivées sans champignon mais dans des conditions de fortes concentrations en engrais phosphaté. En accord avec des observations précédentes, PT13 est localisé au niveau du tonoplaste des cellules contenant ou non des arbuscules. Ceci suggère que PT13 pourrait être impliqué dans le transport du Pi vers la vacuole, éventuellement pour maintenir une certaine homéostasie du phosphate. Dans cette étude, nous démontrons également que le niveau de colonisation par le champignon est affecté de manière significative dans les racines principales des deux allèles du mutants ptl3, mais pas dans les grosses racines latérales. Cela impliquerait un rôle possible de PT13 dans le maintien de l'homéostasie du phosphate dans les racines principales. RESUME POUR UN LARGE PUBLIC Le phosphate (Pi), l'un des éléments minéraux essentiel au développement des plantes, se trouve généralement en faible quantité dans le sol, limitant ainsi la croissance des plantes. Le rendement de la production agricole dépend dès lors de l'addition d'engrais contenant du phosphate inorganique (Pi), obtenu à partir de ressources minières riches en phosphate. Or, ces ressources devraient être épuisées d'ici la fin du siècle. Les racines des plantes possèdent des transporteurs de phosphate efficaces leur permettant d'acquérir rapidement le Pi présent dans le sol. Comme le Pi s'avère immobile dans le sol, l'absorption rapide par les racines crée des zones pauvres en Pi autour des systèmes racinaires. Pour surmonter cet obstacle, les plantes ont développé une symbiose avec des champignons endomycorhiziens, la symbiose mycorhizienne arbusculaire (AM). Cette association leur donne accès à d'autres ressources en phosphate puisque le mycélium de ces champignons se développe sur une surface 100 fois supérieure à celle des racines. Cela augmente considérablement la surface de nutrition, dépassant ainsi la zone appauvrie en Pi. Le phosphate, transporté grâce au champignon jusqu'à l'intérieur des racines, est fourni à la plante par le biais de structures établies à l'intérieur des cellules végétales, appelées arbuscules. De leur côté, les plantes possèdent des transporteurs spécifiques afin de recevoir le Pi fourni par les champignons. A l'heure actuelle, la machinerie nécessaire à cette absorption a été uniquement décrite chez des plantes dicotylédones. Or, comprendre l'apport de phosphate par les champignons mycorhiziens s'avère particulièrement pertinent dans le cas des espèces monocotylédones cultivées telles que les céréales. Ces dernières constituent en effet la majeure partie de l'alimentation humaine. Parmi les céréales, le riz demeure l'aliment de base de la population mondiale, d'où son importance en terme de sécurité alimentaire. Durant mon travail de thèse, j'ai identifié et caractérisé le transporteur du riz impliqué dans l'apport de phosphate par ce type de symbiose AM. J'ai également démontré que le riz, lorsqu'il vit en symbiose, bénéficie de la presque totalité du Pi transporté par le champignon. Environ 40% de la production globale de riz est cultivée dans des conditions permettant la symbiose avec des mycorhizes arbusculaires. Les variétés de riz adaptées à ces conditions aérobiques deviennent des alternatives favorables aux cultivars actuels nécessitant une forte irrigation. Elles se révèlent en effet plus tolérantes aux pénuries d'eau et permettent l'utilisation de pratiques agricoles moins intensives. Les données présentées dans cette étude enrichissent nos connaissances concernant l'absorption du phosphate chez le riz grâce à la symbiose AM. Ces connaissances peuvent s'avérer décisives pour le développement de cultivars du riz plus adaptés à une agriculture écologiquement soutenable.

Mécanismes moléculaires de l'homodimérisation de la protéine Scaffold IB1 et son implication dans la sécrétion d'insuline

RÉSUMÉ Les kinases activées par des mitogènes (MAPKs) constituent une importante famille d'enzymes conservée dans l'évolution. Elles forment un réseau de signalisation qui permet à la cellule de réguler spécifiquement divers processus impliqués dans la différenciation, la survie ou l'apoptose. Les kinases formant le module MAPK sont typiquement disposées en cascades de trois partenaires qui s'activent séquentiellement par phosphorylation. Le module minimum est constitué d'une MAPK kinase kinase (MAPKKK), d'une MAPK kinase (MAPKK) et d'une MAPK. Une fois activée, la MAPK phosphoryle différents substrats tels que des facteurs de transcription ou d'autres protéines. Chez les mammifères, trois groupes principaux de MAPKs ont été identifiés. Il s'agit du groupe des kinases régulées par des signaux extracellulaires du type «mitogènes » (ERK), ainsi que des groupes p38 et cJun NH2-terminal kinase (JNK), ou SAPK pour stress activated protein kinase, plutôt activées par des stimuli de type «stress ». De nombreuses études ont impliqué JNK dans la régulation de différents processus physiologiques et pathologiques, comme le diabète, les arthrites rhumatoïdes, l'athérosclérose, l'attaque cérébrale, les maladies de Parkinson et d'Alzheimer. JNK, en particulier joue un rôle dans la mort des cellules sécrétrices d'insuline induite par l'interleukine (IL)-1 β, lors du développement du diabète de type 1. IB1 est une protéine scaffold (échafaud) qui participe à l'organisation du module de JNK. IB1 est fortement exprimée dans les neurones et les cellules β du pancréas. Elle a été impliquée dans la survie des cellules, la régulation de l'expression du transporteur du glucose de type 2 (Glut-2) et dans le processus de sécrétion d'insuline glucose-dépendante. IBl est caractérisée par plusieurs domaines d'interaction protéine-protéine : un domaine de liaison à JNK (JBD), un domaine homologue au domaine 3 de Src (SH3) et un domaine d'interaction avec des tyrosines phosphorylées (PID). Des partenaires d'IB1, incluant les membres de la familles des kinases de lignée mélangée (MLKs), la MAPKK MKK7, la phosphatase 7 des MAPKs (MKP-7) ainsi que la chaîne légère de la kinésine, ont été isolés. Tous ces facteurs, sauf les MLKs et MKK7 interagissent avec le domaine PID ou l'extrême partie C-terminale d'IBl (la chaîne légère de la kinésine). Comme d'autres protéines scaffolds déjà décrites, IBl et un autre membre de la famille, IB2, sont capables d'homo- et d'hétérodimériser. L'interaction a lieu par l'intermédiaire de leur région C-terminale, contenant les domaines SH3 et PID. Mais ni le mécanisme moléculaire, ni la fonction de la dimérisation n'ont été caractérisés. Le domaine SH3 joue un rôle central lors de l'assemblage de complexes de macromolécules impliquées dans la signalisation intracellulaire. Il reconnaît de préférence des ligands contenant un motif riche en proline de type PxxP et s'y lie. Jusqu'à maintenant, tous les ligands isolés se liant à un domaine SH3 sont linéaires. Bien que le domaine SH3 soit un domaine important de la transmission des signaux, aucun partenaire interagissant spécifiquement avec le domaine SH3 d'IB1 n'a été identifié. Nous avons démontré qu'IBl homodimérisait par un nouveau set unique d'interaction domaine SH3 - domaine SH3. Les études de cristallisation ont démontré que l'interface recouvrait une région généralement impliquée dans la reconnaissance classique d'un motif riche en proline de type PxxP, bien que le domaine SH3 d'IB1 ne contienne aucun motif PxxP. L'homodimère d'IB1 semble extrêmement stable. Il peut cependant être déstabilisé par trois mutations ponctuelles dirigées contre des résidus clés impliqués dans la dimérisation. Chaque mutation réduit l'activation basale de JNK dépendante d'IB 1 dans des cellules 293T. La déstabilisation de la dimérisation induite par la sur-expression du domaine SH3, provoque une diminution de la sécrétion d'insuline glucose dépendant. SUMMARY Mitogen activated kinases (MAPK) are an important and conserved enzyme family. They form a signaling network required to specifically regulate process involved in cell differentiation, proliferation or death. A MAPK module is typically organized in a threekinase cascade which are activated by sequential phosphorylation. The MAPK kinase kinase (MAPKKK), the MAPK kinase (MAPKK) and the MAPK constitute the minimal module. Once activated, the MAPK phosphorylates its targets like transcription factors or other proteins. In mammals, three major groups of MAPKs have been identified : the group of extra-cellular regulated kinase (ERK) which is activated by mitogens and the group of p38 and cJun NH2-terminal kinase (JNK) or SAPK for stress activated protein kinase, which are activated by stresses. Many studies implicated JNK in many physiological or pathological process regulations, like diabetes, rheumatoid arthritis, arteriosclerosis, strokes or Parkinson and Alzheimer disease. In particular, JNK plays a crucial role in pancreatic β cell death induced by Interleukin (IL)-1 β in type 1 diabetes. Islet-brain 1 (IB 1) is a scaffold protein that interacts with components of the JNK signal-transduction pathway. IB 1 is expressed at high levels in neurons and in pancreatic β-cells, where it has been implicated in cell survival, in regulating expression of the glucose transporter type 2 (Glut-2) and in glucose-induced insulin secretion. It contains several protein-protein interaction domains, including a JNK-binding domain (JBD), a Src homology 3 domain (SH3) and a phosphotyrosine interaction domain (PID). Proteins that have been shown to associate with IB 1 include members of the Mixed lineage kinase family (MLKs), the MAPKK MKK7, the MAPK phosphatase-7 MKP7, as well as several other ligands including kinesin light chain, LDL receptor related family members and the amyloid precursor protein APP. All these factors, except MLK3 and MKK7 have been shown to interact with the PID domain or the extreme C-terminal part (Kinesin light chain) of IB 1. As some scaffold already described, IB 1 and another member of the family, IB2, have previously been shown to engage in oligomerization through their respective C-terminal regions that include the SH3 and PID domains. But neither the molecular mechanisms nor the function of dimerization have yet been characterized. SH3 domains are central in the assembly of macromolecular complexes involved in many intracellular signaling pathways. SH3 domains are usually characterized by their preferred recognition of and association with canonical PxxP motif. In all these cases, a single linear sequence is sufficient for binding to the SH3 domain. However, although SH3 domains are important elements of signal transduction, no protein that interacts specifically with the SH3 domain of IB 1 has been identified so far. Here, we show that IB 1 homodimerizes through a navel and unique set of SH3-SH3 interactions. X-ray crystallography studies indicate that the dieter interface covers a region usually engaged in PxxP-mediated ligand recognition, even though the IB 1 SH3 domain lacks this motif. The highly stable IB 1 homodimer can be significantly destabilized in vitro by individual point-mutations directed against key residues involved in dimerization. Each mutation reduces IB 1-dependent basal JNK activity in 293T cells. Impaired dimerization induced by over-expression of the SH3 domain also results in a significant reduction in glucose-dependent insulin secretion in pancreatic β-cells.

The neuronal monocarboxylate transporter MCT2: its regulation by BDNF and its role in learning and memory

Glucose has been considered the major, if not the exclusive, energy substrate for the brain. But under certain physiological and pathological conditions other substrates, namely monocarboxylates (lactate, pyruvate and ketone bodies), can contribute significantly to satisfy brain energy demands. These monocarboxylates need to be transported across the blood-brain barrier or out of astrocytes into the extracellular space and taken up into neurons. It has been shown that monocarboxylates are transported by a family of proton-linked transporters called monocarboxylate transporters (MCTs). In the central nervous system, MCT2 is the predominant neuronal isoform and little is known about the regulation of its expression. Noradrenaline (NA), insulin and IGF-1 were previously shown to enhance the expression of MCT2 in cultured cortical neurons via a translational mechanism. Here we demonstrate that the well known brain neurotrophic factor BDNF enhances MCT2 protein expression in cultured cortical neurons and in synaptoneurosome preparations in a time- and concentrationdependent manner without affecting MCT2 mRNA levels. We observed that BDNF induced MCT2 expression by activation of MAPK as well as PI3K/Akt/mTOR signaling pathways. Furthermore, we investigated the possible post-transcriptional regulation of MCT2 expression by a neuronal miRNA. Then, we demonstrated that BDNF enhanced MCT2 expression in the hippocampus in vivo, in parallel with some post-synaptic proteins such as PSD95 and AMPA receptor GluR2/3 subunits, and two immediate early genes Arc and Zif268 known to be expressed in conditions related to synaptic plasticity. In the last part, we demonstrated in vivo that a downregulation of hippocampal MCT2 via silencing with an appropriate lentiviral vector in mice caused an impairment of working memory without reference memory deficit. In conclusion, these results suggest that regulation of neuronal monocarboxylate transporter MCT2 expression could be a key event in the context of synaptic plasticity, allowing an adequate energy substrate supply in situations of altered synaptic efficacy. - Le glucose représente le substrat énergétique majeur pour le cerveau. Cependant, dans certaines conditions physiologiques ou pathologiques, le cerveau a la capacité d'utiliser des substrats énergéiques appartenant à la classe des monocarboxylates (lactate, pyruvate et corps cétoniques) afin de satisfaire ses besoins énergétiques. Ces monocarboxylates doivent être transportés à travers la barrière hématoencéphalique mais aussi hors des astrocytes vers l'espace extracellulaire puis re-captés par les neurones. Leur transport est assuré par une famillle de transporteurs aux monocarboxylates (MCTs). Dans le système nerveux central, les neurones expriment principalement l'isoforme MCT2 mais peu d'informations sont disponibles concernant la régulation de son expression. Il a été montré que la noradrénaline, l'insuline et l'IGF-1 induisent l'expression de MCT2 dans des cultures de neurones corticaux par un mécanisme traductionnel. Dans cette étude nous démontrons dans un premier temps que le facteur neurotrophique BDNF augmente l'expression de MCT2 à la fois dans des cultures de neurones corticaux et dans les préparations synaptoneurosomales selon un décours temporel et une gamme de concentrations propre. Aucun changement n'a été observé concernant les niveaux d'ARNm de MCT2. Nous avons observé que le BDNF induisait l'expression de MCT2 par l'activation simultanée des voies de signalisation MAPK et PI3K/Akt/mTOR. De plus, nous nous sommes intéressés à une potentielle régulation par les micro-ARNs de la synthèse de MCT2. Ensuite, nous avons démontré que le BDNF induit aussi l'expression de MCT2 dans l'hippocampe de la souris en parallèle avec d'autres protéines post-synaptiques telles que PSD95 et GluR2/3 et avec deux « immediate early genes » tels que Arc et Zif268 connus pour être exprimés dans des conditions de plasticité synaptique. Dans un dernier temps, nous avons démontré qu'une diminution d'expression de MCT2 induite par le biais d'un siRNA exprimé via un vecteur lentiviral dans l'hippocampe de souris générait des déficits de mémoire de travail sans affecter la mémoire de référence. En conclusion, ces résultats nous suggèrent que le transporteur aux monocarboxylates neuronal MCT2 serait essentiel pour l'apport énergétique du lactate pour les neurones dans des conditions de haute activité neuronale comme c'est le cas pendant les processus de plasticité synaptique.

Les savants et les livres : autour d'Albrecht von Haller (1708-1777) et Samuel Auguste Tissot (1728-1797)

Cette thèse décrit de quelle manière les hommes travaillant dans les sciences de la vie durant la seconde moitié du XVIIIe siècle s'insèrent et jonglent au quotidien dans l'univers de la librairie d'Ancien Régime. Plus précisément dans celui que l'historien du livre Robert Damton a défini le circuit de la communication. Un circuit complexe qui va de l'auteur à l'éditeur, en passant par l'imprimeur, le transporteur, le libraire, le lecteur ou encore par le relieur et le copiste.Marchander le prix d'une page manuscrite avec un éditeur, s'assurer de rester au courant des nouveautés de la librairie, prendre des notes, trouver un bon copiste, juger de la qualité d'un ouvrage ou d'une traduction, se protéger des contrefaçons, se créer un fonds de bibliothèque: voici le quotidien du savant au travail abordé dans cette thèse dont le but est de comprendre de quelle manière fonctionnent les mécanismes d'acquisition, de mise en forme et de mise en circulation du savoir - bref, les coulisses de la communication scientifique. Cela à une période où les hommes de science sont de plus en plus confrontés à un "déluge" de nouvelles publications en toutes langues. La seconde moitié du XVIIIe siècle, correspond en fait à celui qu'a été défini par les historiens du livre un "apogée" de l'imprimé scientifique. Caractérisée par un changement dans le milieu de la production imprimée, cette seconde partie du siècle marque une césure, une situation nouvelle à laquelle le savant doit s'adapter afin de ne pas être dépassé par les événements et afin de pouvoir tirer le plus large bénéfice de toutes les formes d'expression et d'intervention qui sont mises à sa disposition. Afin d'analyser les stratégies mises en place par les savants pour gérer la masse de l'information et afin de reconstruire les pratiques ordinaires du travail savant, pratiques qui accompagnent le savoir dans son devenir et sont susceptible de l'influencer, cette thèse s'appuie sur la riche correspondance que le médecin lausannois Samuel Auguste Tissot et son collègue bernois Albrecht von Haller, deux savants et écrivains de renom parmi les plus célèbres des Lumières helvétiques, échangent pendant plus de vingt ans. Ce couple pourrait être défini comme antinomique. Le représentant d'une culture humaniste, formé à l'école iatromécanique de Leyde et insatiable lecteur qu'est Haller et un partisan de la vulgarisation, formé au vitalisme à Montpellier tel que Tissot, d'une génération plus jeune, se sont démontrés avoir une conception parfois différente de ce qu'est un livre de science, en particulier un livre de médecine, de la forme qu'il doit avoir, du prix auquel il doit être vendu ou encore de la langue dans laquelle il doit être écrit. L'un, Haller, médecin de cabinet et professeur à Gôttingen pendant dix-sept ans, l'autre, Tissot, praticien et médecin des pauvres ayant enseigné seulement quatre semestres à Pavie, pratiquent et conçoivent en partie différemment la communication du savoir scientifique et le public de celle-ci. L'étude prend également en compte les lettres échangées avec un réseau d'amis communs, surtout le médecin argovien Johann Georg Zimmermann et le naturaliste genevois Charles Bonnet. Les correspondances des professionnels du livre représentent un autre pan incontournable du corpus documentaire de la thèse. C'est grâce à ces hommes que le texte du savant sort du cabinet et prend sa forme matérielle, voire il acquiert du sens. Des documents tels des essais ou des notes de lecture et les pièces liminaires des livres (préfaces, dédicaces, avis aux lecteurs, notes) se sont aussi révélées être des documents précieux: ils témoignent des pratiques de travail des savants et ils renseignent aussi bien sur les intentions poursuivies par l'auteur que sur les pratiques d'édition, contrefaçon et traduction.Basée sur une démarche micro-historique qui croise l'histoire sociale des sciences et l'histoire sociale du livre à la française, cette thèse s'articule autour de 5 chapitres et un intermède. La disposition des parties suit en quelques sortes les étapes du travail savant: lecture, écriture, mise sous presse, mise en circulation, réception.

Pharmacogenetic Study on Antidementia Drugs

Differences in efficacy and safety of drugs among patients are a recognized problem in pharmacotherapy. The reasons are multifactorial and, therefore, the choice of a drug and its dosage for a particular patient based on different clinical and genetic factors is suggested to improve the clinical outcome. Four drugs are currently used for the treatment of Alzheimer's disease: three acetylcholinesterase inhibitors (donepezil, galantamine, rivastigmine) and the N-methyl-D-aspartate-antagonist memantine. For these drugs, a high interindividual variability in plasma levels was observed, which might influence the response to treatment. The main objective of this thesis was to provide a better understanding of clinical and genetic factors affecting the plasma levels of antidementia drugs. Furthermore, the relationship between plasma levels, genetic variations and side effects was assessed. For this purpose, a pharmacogenetic study was conducted including 300 patients from a naturalistic clinical setting. Analytical methods for the simultaneous measurement of antidementia drugs in plasma have been developed and validated using liquid chromatography methods coupled with mass spectrometry detection. Presently, these methods are used in the therapeutic drug monitoring service of our laboratory. The routine use of therapeutic drug monitoring for antidementia drugs cannot yet be recommended with the available data, but it may be beneficial for some patients in special clinical cases such as insufficient treatment response, side effects or drug interactions. Donepezil and galantamine are extensively metabolized by the liver enzymes cytochromes P450 (CYP) 2D6 and 3A and are substrates of the drug transporter P-glycoprotein. The relationship of variations in genes affecting the activity of these metabolic enzymes and drug transporter (CYP2D6, CYP3A, POR, NR1I2, ABCB1) with donepezil and galantamine plasma levels was investigated. The CYP2D6 genotype appeared to be the major genetic factor involved in the pharmacokinetics of these two drugs. Thus, CYP2D6 poor metabolizers demonstrated significantly higher drug plasma levels than extensive metabolizers. Additionally, in the donepezil study population, the frequency of side effects was significantly increased in poor metabolizers. Lower donepezil plasma levels were observed in ultra rapid metabolizers, which might expose those patients to the risk of non-response. Memantine is mainly eliminated unchanged by the kidney, with implication of tubular secretion by renal transporters. A population pharmacokinetic model was developed to quantify the effects of clinical factors and genetic variations in renal cation transporters (SLC22A1/2/5, SLC47A1, ABCB1), and nuclear receptors (NR1I2, NR1I3, PPARG) involved in transporter expression, on memantine plasma levels. In addition to the renal function and gender, a genetic variation in the nuclear receptor Pregnane-X-Receptor (NR1I2) significantly affected memantine elimination. These findings suggest that an individualized therapy approach for antidementia drugs, taking into account clinical characteristics and genetic background of a patient, might increase efficacy and safety of the treatment. - Les différences interindividuelles dans l'efficacité et la tolérance des médicaments sont un problème connu en pharmacothérapie. Les raisons sont multiples, et le choix du médicament et de la dose, basé sur des facteurs cliniques et génétiques spécifiques au patient, peut contribuer à améliorer la réponse clinique. Quatre médicaments sont couramment utilisés dans le traitement de la maladie d'Alzheimer : trois inhibiteurs de l'acétylcholinestérase (donépézil, galantamine, rivastigmine) et un antagoniste du récepteur N-méthyl-D-aspartate, la mémantine. Une forte variabilité interindividuelle dans les taux plasmatiques de ces quatre composés a été observée, ce qui pourrait influencer la réponse au traitement. L'objectif principal de ce travail de thèse est de mieux comprendre les facteurs cliniques et génétiques influençant les taux des médicaments pro-cognitifs. En outre, des associations entre les taux, la variabilité génétique et les effets secondaires ont été recherchées. Dans ce but, 300 patients sous traitement avec un médicament pro-cognitif ont été recrutés pour une étude pharmacogénétique. Des méthodes de dosage simultané de médicaments pro-cognitifs par chromatographie liquide couplée à la spectrométrie de masse ont été développées et validées. Ces méthodes sont actuellement utilisées dans le service de suivi thérapeutique de notre unité. Malgré le fait qu'un suivi des taux sanguins des pro-cognitifs ne puisse pas encore être recommandé en routine, un dosage peut être utile dans des cas cliniques spécifiques, comme une réponse insuffisante, une intolérance ou une interaction médicamenteuse. Le donépézil et la galantamine sont fortement métabolisés par les cytochromes P450 (CYP) 2D6 et 3A, et sont également substrats du transporteur P-glycoprotéine. Les associations entre les polymorphismes génétiques de ces enzymes, cofacteur, récepteur nucléaire et transporteur (CYP2D6, CYP3A, POR, NR1I2, ABCB1) et les taux de donépézil et de galantamine ont été étudiées. Le génotype du CYP2D6 a été montré comme le facteur génétique majeur impliqué dans la pharmacocinétique de ces deux médicaments. Ainsi, les métaboliseurs déficients du CYP2D6 ont démontré des taux plasmatiques significativement plus élevés comparé aux bons métaboliseurs. De plus, dans la population traitée avec le donépézil, la fréquence des effets secondaires était plus élevée chez les métaboliseurs déficients. Des taux plasmatiques bas ont été mesurés chez les métaboliseurs ultra-rapides traités avec le donépézil, ce qui pourrait être un facteur de risque à une non-réponse au traitement. La mémantine est principalement éliminée sous forme inchangée par les reins, et partiellement par sécrétion tubulaire grâce à des transporteurs rénaux. Un modèle de cinétique de population a été développé pour quantifier les effets des différents facteurs cliniques et de la variabilité génétique des transporteurs rénaux (SLC22A1/2/5, SLC47A1, ABCB1) et des récepteurs nucléaires (NR1I2, NR1I3, PPARG, impliqués dans l'expression des transporteurs) sur les taux plasmatiques de mémantine. En plus de la fonction rénale et du genre, une variation génétique dans le récepteur nucléaire Pregnane-X-Receptor (NR1I2) a montré une influence significative sur l'élimination de la mémantine. Ces résultats suggèrent qu'une approche thérapeutique individualisée, prenant en compte des facteurs cliniques et génétiques du patient, pourrait améliorer l'efficacité et la sécurité du traitement pro-cognitif.

Characterization of GLUT8 and GLUT9, two novel glucose transporter isoforms

Summary Prevalence of type 2 diabetes is increasing worldwide at alarming rates, probably secondarily to that of obesity. As type 2 diabetes is characterized by blood hyperglycemia, controlling glucose entry into tissues from the bloodstream is key to maintain glycemia within acceptable ranges. In this context, several glucose transporter isoforms have been cloned recently and some of them have appeared to play important regulatory roles. Better characterizing two of them (GLUT8 and GLUT9) was the purpose of my work. The first part of my work was focused on GLUT8, which is mainly expressed in the brain and is able to transport glucose with high affinity. GLUT8 is retained intracellularly at basal state depending on an N-terminal dileucine motif, thus implying that cell surface expression may be induced by extracellular triggers. In this regard, I was interested in better defining GLUT8 subcellular localization at basal state and in finding signals promoting its translocation, using an adenoviral vector expressing a myc epitope-tagged version of the transporter, thus allowing expression and detection of cell-surface GLUT8 in primary hippocampal neurons and PC 12 cells. This tool enabled me to found out that GLUT8 resides in a unique compartment different from lysosomes, endoplasmic reticulum, endosomes and the Golgi. In addition, absence of GLUT8 translocation following pharmacological activation of several signalling pathways suggests that GLUT8 does not ever translocate to the cell surface, but would rather fulfill its role in its unique intracellular compartment. The second part of my work was focused on GLUT9, which -contrarily to GLUT8 - is unable to transport glucose, but retains the ability to bind glucose-derived cross-linker molecules, thereby suggesting that it may be a glucose sensor rather than a true glucose transporter. The aim of the project was thus to define if GLUT9 triggers intracellular signals when activated. Therefore, adenoviral vectors expressing GLUTS were used to infect both ßpancreatic and liver-derived cell lines, as GLUTS is endogenously expressed in the liver. Comparison of gene expression between cells infected with the GLUTS-expressing adenovirus and cells infected with a GFP-expressing control adenovirus ended up in the identification of the transcription factor HNF4α as being upregulated in aGLUT9-dependent manner. Résumé La prévalence du diabète de type 2 augmente de façon alarmante dans le monde entier, probablement secondairement à celle de l'obésité. Le diabète de type 2 étant caractérisé par une glycémie sanguine élevée, l'entrée du glucose dans les tissus depuis la circulation sanguine constitue un point de contrôle important pour maintenir la glycémie à des valeurs acceptables. Dans ce contexte, plusieurs isoformes de transporteurs au glucose ont été clonées récemment et certaines d'entre elles sont apparues comme jouant d'importants rôles régulateurs. Mieux caractériser deux d'entre elles (GLUT8 et GLUT9) était le but de mon travail. La première partie de mon travail a été centrée sur GLUT8, qui est exprimé principalement dans le cerveau et qui peut transporter le glucose avec une haute affinité. GLUT8 est retenu intracellulairement à l'état basal de façon dépendante d'un motif dileucine N-terminal, ce qui implique que son expression à la surface cellulaire pourrait être induite par des stimuli extracellulaires. Dans cette optique, je me suis intéressé à mieux définir la localisation subcellulaire de GLUT8 à l'état basal et à trouver des signaux activant sa translocation, en utilisant comme outil un vecteur adénoviral exprimant une version marquée (tag myc) du transporteur, me permettant ainsi d'exprimer et de détecter GLUT8 à la surface cellulaire dans des neurones hippocampiques primaires et des cellules PC12. Cet outil m'a permis de montrer que GLUT8 réside dans un compartiment unique différent des lysosomes, du réticulum endoplasmique, des endosomes, ainsi que du Golgi. De plus, l'absence de translocation de GLUT8 à la suite de l'activation pharmacologique de plusieurs voies de signalisation suggère que GLUT8 ne transloque jamais à la membrane plasmique, mais jouerait plutôt un rôle au sein même de son compartiment intracellulaire unique. La seconde partie de mon travail a été centrée sur GLUT9, lequel -contrairement à GLUT8 -est incapable de transporter le glucose, mais conserve la capacité de se lier à des molécules dérivées du glucose, suggérant que ce pourrait être un senseur de glucose plutôt qu'un vrai transporteur. Le but du projet a donc été de définir si GLUT9 active des signaux intracellulaires quand il est lui-même activé. Pour ce faire, des vecteurs adénoviraux exprimant GLUT9 ont été utilisés pour infecter des lignées cellulaires dérivées de cellules ßpancréatiques et d'hépatocytes, GLUT9 étant exprimé de façon endogène dans le foie. La comparaison de l'expression des gènes entre des cellules infectées avec l'adénovirus exprimant GLUT9 et un adénovirus contrôle exprimant la GFP a permis d'identifier le facteur de transcription HNF4α comme étant régulé de façon GLUT9-dépendante. Résumé tout public Il existe deux types bien distincts de diabète. Le diabète de type 1 constitue environ 10 des cas de diabète et se déclare généralement à l'enfance. Il est caractérisé par une incapacité du pancréas à sécréter une hormone, l'insuline, qui régule la concentration sanguine du glucose (glycémie). Il en résulte une hyperglycémie sévère qui, si le patient n'est pas traité à l'insuline, conduit à de graves dommages à divers organes, ce qui peut mener à la cécité, à la perte des membres inférieurs, ainsi qu'à l'insuffisance rénale. Le diabète de type 2 se déclare plus tard dans la vie. Il n'est pas causé par une déficience en insuline, mais plutôt par une incapacité de l'insuline à agir sur ses tissus cibles. Le nombre de cas de diabète de type 2 augmente de façon dramatique, probablement à la suite de l'augmentation des cas d'obésité, le surpoids chronique étant le principal facteur de risque de diabète. Chez l'individu sain, le glucose sanguin est transporté dans différents organes (foie, muscles, tissu adipeux,...) où il est utilisé comme source d'énergie. Chez le patient diabétique, le captage de glucose est altéré, expliquant ainsi l'hyperglycémie. Il est ainsi crucial d'étudier les mécanismes permettant ce captage. Ainsi, des protéines permettant l'entrée de glucose dans la cellule depuis le milieu extracellulaire ont été découvertes depuis une vingtaine d'années. La plupart d'entre elles appartiennent à une sous-famille de protéines nommée GLUT (pour "GLUcose Transporters") dont cinq membres ont été caractérisés et nommés selon l'ordre de leur découverte (GLUT1-5). Néanmoins, la suppression de ces protéines chez la souris par des techniques moléculaires n'affecte pas totalement le captage de glucose, suggérant ainsi que des transporteurs de glucose encore inconnus pourraient exister. De telles protéines ont été isolées ces dernières années et nommées selon l'ordre de leur découverte (GLUT6-14). Durant mon travail de thèse, je me suis intéressé à deux d'entre elles, GLUT8 et GLUT9, qui ont été découvertes précédemment dans le laboratoire. GLUT8 est exprimé principalement dans le cerveau. La protéine n'est pas exprimée à la surface de la cellule, mais est retenue à l'intérieur. Des mécanismes complexes doivent donc exister pour déplacer le transporteur à la surface cellulaire, afin qu'il puisse permettre l'entrée du glucose dans la cellule. Mon travail a consisté d'une part à définir où se trouve le transporteur à l'intérieur de la cellule, et d'autre part à comprendre les mécanismes capables de déplacer GLUT8 vers la surface cellulaire, en utilisant des neurones exprimant une version marquée du transporteur, permettant ainsi sa détection par des méthodes biochimiques. Cela m'a permis de montrer que GLUT8 est localisé dans une partie de la cellule encore non décrite à ce jour et qu'il n'est jamais déplacé à la surface cellulaire, ce qui suggère que le transporteur doit jouer un rôle à l'intérieur de la cellule et non à sa surface. GLUT9 est exprimé dans le foie et dans les reins. Il ressemble beaucoup à GLUT8, mais ne transporte pas le glucose, ce qui suggère que ce pourrait être un récepteur au glucose plutôt qu'un transporteur à proprement parler. Le but de mon travail a été de tester cette hypothèse, en comparant des cellules du foie exprimant GLUT9 avec d'autres n'exprimant pas la protéine. Par des méthodes d'analyses moléculaires, j'ai pu montrer que la présence de GLUT9 dans les cellules du foie augmente l'expression de HNF4α, une protéine connue pour réguler la sécrétion d'insuline dans le pancréas ainsi que la production de glucose dans le foie. Des expériences complémentaires seront nécessaires afin de mieux comprendre par quels mécanismes GLUT9 influence l'expression de HNF4α dans le foie, ainsi que de définir l'importance de GLUT9 dans la régulation de la glycémie chez l'animal entier.

A role for the transcriptional repressor ICER in the molecular pathogenesis of type 2 diabetes

AbstractType 2 diabetes (T2D) is a metabolic disease which affects more than 200 millions people worldwide. The progression of this affection reaches nowadays epidemic proportions, owing to the constant augmentation in the frequency of overweight, obesity and sedentary. The pathogenesis of T2D is characterized by reduction in the action of insulin on its target tissues - an alteration referred as insulin resistance - and pancreatic β-cell dysfunction. This latter deterioration is defined by impairment in insulin biosynthesis and secretion, and a loss of β-cell mass by apoptosis. Environmental factors related to T2D, such as chronic elevation in glucose and free fatty acids levels, inflammatory cytokines and pro-atherogenic oxidized low- density lipoproteins (LDL), contribute to the loss of pancreatic β-cell function.In this study, we have demonstrated that the transcription factor Inducible Cyclic AMP Early Repressor (ICER) participates to the progression of both β-cell dysfunction and insulin resistance. The expression of this factor is driven by an alternative promoter and ICER protein represents therefore a truncated product of the Cyclic AMP Response Element Modulator (CREM) family which lacks transactivation domain. Consequently, the transcription factor ICER acts as a passive repressor which reduces expression of genes controlled by the cyclic AMP and Cyclic AMP Response Element Binding protein (CREB) pathway.In insulin-secreting cells, the accumulation of reactive oxygen species caused by environmental factors and notably oxidized LDL - a process known as oxidative stress - induces the transcription factor ICER. This transcriptional repressor hampers the secretory capacity of β-cells by silencing key genes of the exocytotic machinery. In addition, the factor ICER reduces the expression of the scaffold protein Islet Brain 1 (IB 1 ), thereby favouring the activation of the c-Jun N-terminal Kinase (JNK) pathway. This triggering alters in turn insulin biosynthesis and survival capacities of pancreatic β-cells.In the adipose tissue of mice and human subjects suffering from obesity, the transcription factor ICER contributes to the alteration in insulin action. The loss in ICER protein in these tissues induces a constant activation of the CREB pathway and the subsequent expression of the Activating Transcription Factor 3 (ATF3). In turn, this repressor reduces the transcript levels of the glucose transporter GLUT4 and the insulin-sensitizer peptide adiponectin, thereby contributing to the diminution in insulin action.In conclusion, these data shed light on the important role of the transcriptional repressor ICER in the pathogenesis of T2D, which contributes to both alteration in β-cell function and aggravation of insulin resistance. Consequently, a better understanding of the molecular mechanisms responsible for the alterations in ICER levels is required and could lead to develop new therapeutic strategies for the treatment of T2D.RésuméLe diabète de type 2 (DT2) est une maladie métabolique qui affecte plus de 200 millions de personnes dans le monde. La progression de cette affection atteint aujourd'hui des proportions épidémiques imputables à l'augmentation rapide dans les fréquences du surpoids, de l'obésité et de la sédentarité. La pathogenèse du DT2 se caractérise par une diminution de l'action de l'insuline sur ses tissus cibles - un processus nommé insulino-résistance - ainsi qu'une dysfonction des cellules β pancréatiques sécrétrices d'insuline. Cette dernière détérioration se définit par une réduction de la capacité de synthèse et de sécrétion de l'insuline et mène finalement à une perte de la masse de cellules β par apoptose. Des facteurs environnementaux fréquemment associés au DT2, tels l'élévation chronique des taux plasmatiques de glucose et d'acides gras libres, les cytokines pro-inflammatoires et les lipoprotéines de faible densité (LDL) oxydées, contribuent à la perte de fonction des cellules β pancréatiques.Dans cette étude, nous avons démontré que le facteur de transcription « Inducible Cyclic AMP Early Repressor » (ICER) participe à la progression de la dysfonction des cellules β pancréatiques et au développement de Pinsulino-résistance. Son expression étant gouvernée par un promoteur alternatif, la protéine d'ICER représente un produit tronqué de la famille des «Cyclic AMP Response Element Modulator » (CREM), sans domaine de transactivation. Par conséquent, le facteur ICER agit comme un répresseur passif qui réduit l'expression des gènes contrôlés par la voie de l'AMP cyclique et des « Cyclic AMP Response Element Binding protein » (CREB).Dans les cellules sécrétrices d'insuline, l'accumulation de radicaux d'oxygène libres, soutenue par les facteurs environnementaux et notamment les LDL oxydées - un processus appelé stress oxydatif- induit de manière ininterrompue le facteur de transcription ICER. Ainsi activé, ce répresseur transcriptionnel altère la capacité sécrétoire des cellules β en bloquant l'expression de gènes clés de la machinerie d'exocytose. En outre, le facteur ICER favorise l'activation de la cascade de signalisation « c-Jun N- terminal Kinase » (JNK) en réduisant l'expression de la protéine « Islet Brain 1 » (IB1), altérant ainsi les fonctions de biosynthèse de l'insuline et de survie des cellules β pancréatiques.Dans le tissu adipeux des souris et des sujets humains souffrant d'obésité, le facteur de transcription ICER contribue à l'altération de la réponse à l'insuline. La disparition de la protéine ICER dans ces tissus entraîne une activation persistante de la voie de signalisation des CREB et une induction du facteur de transcription « Activating Transcription Factor 3 » (ATF3). A son tour, le répresseur ATF3 inhibe l'expression du transporteur de glucose GLUT4 et du peptide adipocytaire insulino-sensibilisateur adiponectine, contribuant ainsi à la diminution de l'action de l'insuline en conditions d'obésité.En conclusion, à la lumière de ces résultats, le répresseur transcriptionnel ICER apparaît comme un facteur important dans la pathogenèse du DT2, en participant à la perte de fonction des cellules β pancréatiques et à l'aggravation de l'insulino-résistance. Par conséquent, l'étude des mécanismes moléculaires responsables de l'altération des niveaux du facteur ICER pourrait permettre le développement de nouvelles stratégies de traitement du DT2.Résumé didactiqueL'énergie nécessaire au bon fonctionnement de l'organisme est fournie par l'alimentation, notamment sous forme de sucres (glucides). Ceux-ci sont dégradés en glucose, lequel sera distribué aux différents organes par la circulation sanguine. Après un repas, le niveau de glucose sanguin, nommé glycémie, s'élève et favorise la sécrétion d'une hormone appelée insuline par les cellules β du pancréas. L'insuline permet, à son tour, aux organes, tels le foie, les muscles et le tissu adipeux de capter et d'utiliser le glucose ; la glycémie retrouve ainsi son niveau basai.Le diabète de type 2 (DT2) est une maladie métabolique qui affecte plus de 200 millions de personnes dans le monde. Le développement de cette affection est causée par deux processus pathologiques. D'une part, les quantités d'insuline secrétée par les cellules β pancréatiques, ainsi que la survie de ces cellules sont réduites, un phénomène connu sous le nom de dysfonction des cellules β. D'autre part, la sensibilité des tissus à l'insuline se trouve diminuée. Cette dernière altération, l'insulino-résistance, empêche le transport et l'utilisation du glucose par les tissus et mène à une accumulation de ce sucre dans le sang. Cette stagnation de glucose dans le compartiment sanguin est appelée hyperglycémie et favorise l'apparition des complications secondaires du diabète, telles que les maladies cardiovasculaires, l'insuffisance rénale, la cécité et la perte de sensibilité des extrémités.Dans cette étude, nous avons démontré que le facteur ICER qui contrôle spécifiquement l'expression de certains gènes, contribue non seulement à la dysfonction des cellules β, mais aussi au développement de l'insulino-résistance. En effet, dans les cellules β pancréatiques en conditions diabétiques, l'activation du facteur ICER altère la capacité de synthèse et de sécrétion d'insuline et réduit la survie ces cellules.Dans le tissu adipeux des souris et des sujets humains souffrant d'obésité, le facteur ICER contribue à la perte de sensibilité à l'insuline. La disparition d'ICER altère l'expression de la protéine qui capte le glucose, le transoprteur GLUT4, et l'hormone adipocytaire favorisant la sensibilité à l'insuline, nommée adiponectine. Ainsi, la perte d'ICER participe à la réduction de la captation de glucose par le tissue adipeux et au développement de l'insulino-résistance au cours de l'obésité.En conclusion, à la lumière de ces résultats, le facteur ICER apparaît comme un contributeur important à la progression du DT2, en soutenant la dysfonction des cellules β pancréatiques et l'aggravation de l'insulino-résistance. Par conséquent, l'étude des mécanismes responsables de la dérégulation du facteur ICER pourrait permettre le développement de nouvelles stratégies de traitement du DT2.

Imatinib plasma concentrations variability in hemato-oncologic patients

Abstract Imatinib (Glivec~ has transformed the treatment and prognosis of chronic myeloid leukaemia (CML) and of gastrointestinal stromal tumor (GIST). However, the treatment must be taken indefinitely and is not devoid of inconvenience and toxicity. Moreover, resistance or escape from disease control occurs. Considering the large interindividual differences in the function of the enzymatic and transport systems involved in imatinib disposition, exposure to this drug can be expected to vary widely among patients. Among those known systems is a cytochrome P450 (CYI'3A4) that metabolizes imatinib, the multidrug transporter P-glycoprotein (P-gp; product of the MDR1 gene) that expels imatinib out of cells, and al-acid glycoprotein (AGP), a circulating protein binding imatinib in the plasma. The aim of this observational study was to explore the influence of these covariates on imatinib pharmacokinetics (PK), to assess the interindividual variability of the PK parameters of the drug, and to evaluate whether imatinib use would benefit from a therapeutic drug monitoring (TDM) program. A total of 321 plasma concentrations were measured in 59 patients receiving imatinib, using a validated chromatographic method developed for this study (HPLC-LTV). The results were analyzed by non-linear mixed effect modeling (NONMEM). A one-compartment pharmacokinetic model with first-order absorption appropriately described the data, and a large interindividual variability was observed. The MDK> polymorphism 3435C>T and the CYP3A4 activity appeared to modulate the disposition of imatinib, albeit not significantly. A hyperbolic relationship between plasma AGP levels and oral clearance, as well as volume of distribution, was observed. A mechanistic approach was built up, postulating that only the unbound imatinib concentration was able to undergo first-order elimination. This approach allowed determining an average free clearance (CL,~ of 13101/h and a volume of distribution (Vd) of 301 1. By comparison, the total clearance determined was 141/h (i.e. 233 ml/min). Free clearance was affected by body weight and pathology diagnosis. The estimated variability of imatinib disposition (17% for CLu and 66% for Vd) decreased globally about one half with the model incorporating the AGP impact. Moreover, some associations were observed between PK parameters of the free imatinib concentration and its efficacy and toxicity. Finally, the functional influence of P-gp activity has been demonstrated in vitro in cell cultures. These elements are arguments to further investigate the possible usefulness of a TDM program for imatinib. It may help in individualizing the dosing regimen before overt disease progression or development of treatment toxicity, thus improving both the long-term therapeutic effectiveness and tolerability of this drug. Résumé L'imatinib (Glivec ®) a révolutionné le traitement et le pronostic de la leucémie myéloïde chronique (LMC) et des tumeurs stromales d'origine digestive (GIST). Il s'agit toutefois d'un traitement non dénué d'inconvénients et de toxicité, et qui doit être pris indéfiniment. Par ailleurs, une résistance, ou des échappements au traitement, sont également rencontrés. Le devenir de ce médicament dans l'organisme dépend de systèmes enzymatiques et de transport connus pour présenter de grandes différences interindividuelles, et l'on peut s'attendre à ce que l'exposition à ce médicament varie largement d'un patient à l'autre. Parmi ces systèmes, on note un cytochrome P450 (le CYP3A4) métabolisant l'imatinib, la P-glycoprotéine (P-gp ;codée par le gène MDR1), un transporteur d'efflux expulsant le médicament hors des cellules, et l'atglycoprotéine acide (AAG), une protéine circulante sur laquelle se fixe l'imatinib dans le plasma. L'objectif de la présente étude clinique a été de déterminer l'influence de ces covariats sur la pharmacocinétique (PK) de l'imatinib, d'établir la variabilité interindividuelle des paramètres PK du médicament, et d'évaluer dans quelle mesure l'imatinib pouvait bénéficier d'un programme de suivi thérapeutique (TDM). En utilisant une méthode chromatographique développée et validée à cet effet (HPLC-UV), un total de 321 concentrations plasmatiques a été dosé chez 59 patients recevant de l'imatinib. Les résultats ont été analysés par modélisation non linéaire à effets mixtes (NONMEM). Un modèle pharmacocinétique à un compartiment avec absorption de premier ordre a permis de décrire les données, et une grande variabilité interindividuelle a été observée. Le polymorphisme du gène MDK1 3435C>T et l'activité du CYP3A4 ont montré une influence, toutefois non significative, sur le devenir de l'imatinib. Une relation hyperbolique entre les taux plasmatiques d'AAG et la clairance, comme le volume de distribution, a été observée. Une approche mécanistique a donc été élaborée, postulant que seule la concentration libre subissait une élimination du premier ordre. Cette approche a permis de déterminer une clairance libre moyenne (CLlibre) de 13101/h et un volume de distribution (Vd) de 301 l. Par comparaison, la clairance totale était de 141/h (c.à.d. 233 ml/min). La CLlibre est affectée par le poids corporel et le type de pathologie. La variabilité interindividuelle estimée pour le devenir de l'imatinib (17% sur CLlibre et 66% sur Vd) diminuait globalement de moitié avec le modèle incorporant l'impact de l'AAG. De plus, une certaine association entre les paramètres PK de la concentration d'imatinib libre et l'efficacité et la toxicité a été observée. Finalement, l'influence fonctionnelle de l'activité de la P-gp a été démontrée in nitro dans des cultures cellulaires. Ces divers éléments constituent des arguments pour étudier davantage l'utilité potentielle d'un programme de TDM appliqué à l'imatinib. Un tel suivi pourrait aider à l'individualisation des régimes posologiques avant la progression manifeste de la maladie ou l'apparition de toxicité, améliorant tant l'efficacité que la tolérabilité de ce médicament. Résumé large public L'imatinib (un médicament commercialisé sous le nom de Glivec ®) a révolutionné le traitement et le pronostic de deux types de cancers, l'un d'origine sanguine (leucémie) et l'autre d'origine digestive. Il s'agit toutefois d'un traitement non dénué d'inconvénients et de toxicité, et qui doit être pris indéfiniment. De plus, des résistances ou des échappements au traitement sont également rencontrés. Le devenir de ce médicament dans le corps humain (dont l'étude relève de la discipline appelée pharmacocinétique) dépend de systèmes connus pour présenter de grandes différences entre les individus, et l'on peut s'attendre à ce que l'exposition à ce médicament varie largement d'un patient à l'autre. Parmi ces systèmes, l'un est responsable de la dégradation du médicament dans le foie (métabolisme), l'autre de l'expulsion du médicament hors des cellules cibles, alors que le dernier consiste en une protéine (dénommée AAG) qui transporte l'imatinib dans le sang. L'objectif de notre étude a été de déterminer l'influence de ces différents systèmes sur le comportement pharmacocinétique de l'imatinib chez les patients, et d'étudier dans quelle mesure le devenir de ce médicament dans l'organisme variait d'un patient à l'autre. Enfin, cette étude avait pour but d'évaluer à quel point la surveillance des concentrations d'imatinib présentes dans le sang pourrait améliorer le traitement des patients cancéreux. Une telle surveillance permet en fait de connaître l'exposition effective de l'organisme au médicament (concept abrégé par le terme anglais TDM, pour Therapeutic Drag Monitoring. Ce projet de recherche a d'abord nécessité la mise au point d'une méthode d'analyse pour la mesure des quantités (ou concentrations) d'imatinib présentes dans le sang. Cela nous a permis d'effectuer régulièrement des mesures chez 59 patients. Il nous a ainsi été possible de décrire le devenir du médicament dans le corps à l'aide de modèles mathématiques. Nous avons notamment pu déterminer chez ces patients la vitesse à laquelle l'imatinib est éliminé du sang et l'étendue de sa distribution dans l'organisme. Nous avons également observé chez les patients que les concentrations sanguines d'imatinib étaient très variables d'un individu à l'autre pour une même dose de médicament ingérée. Nous avons pu aussi mettre en évidence que les concentrations de la protéine AAG, sur laquelle l'imatinib se lie dans le sang, avait une grande influence sur la vitesse à laquelle le médicament est éliminé de l'organisme. Ensuite, en tenant compte des concentrations sanguines d'imatinib et de cette protéine, nous avons également pu calculer les quantités de médicament non liées à cette protéine (= libres), qui sont seules susceptibles d'avoir une activité anticancéreuse. Enfin, il a été possible d'établir qu'il existait une certaine relation entre ces concentrations, l'effet thérapeutique et la toxicité du traitement. Tous ces éléments constituent des arguments pour approfondir encore l'étude de l'utilité d'un programme de TDM appliqué à l'imatinib. Comme chaque patient est différent, un tel suivi pourrait aider à l'ajustement des doses du médicament avant la progression manifeste de la maladie ou l'apparition de toxicité, améliorant ainsi tant son efficacité que son innocuité.

From pathogen defence to food allergy; The multiple facets of the mucosal immune system

Résumé destiné à un large public Le système immunitaire associé aux muqueuses gastro-intestinales doit être capable de protéger notre organisme contre l'invasion de pathogènes. Parallèlement, il doit identifier en Cant que tels, des composés inoffensifs comme la nourriture ou les milliards de bactéries qui résident dans notre intestin. Le travail présenté ici aborde ces deux aspects essentiels au bon fonctionnement de notre muqueuse intestinale. Dans une première partie, la protéine nommée pièce sécrétoire a été étudiée pour ses propriétés protectrices contre le pathogène viral rotavirus. Le rôle de la pièce sécrétoire est de transporter les anticorps que nous produisons vers la surface des muqueuses. En dehors de cette fonction bien connue, il se peut que cette protéine soit également capable de protéger notre organisme contre certains virus. L'hypothèse de travail était donc que la pièce sécrétoire se lie directement au virus, l'empêchant ainsi d'infecter des cellules épithéliales de l'intestin. En utilisant différentes techniques biochimiques, cette hypothèse s'est révélée fausse car aucune interaction entre la pièce sécrétoire et le virus n'a pu être observée, et logiquement, aucune protection n'a pu prendre place. En revanche, la pièce sécrétoire se lie à d'autres structures pathogéniques et permet ainsi de neutraliser leurs effets néfastes. La pièce sécrétoire participe donc activement à la protection de nos muqueuses, en plus de son rôle de transporteur. La deuxième partie de ce travail avait pour sujet les réactions inappropriées que le système immunitaire induit parfois contre un aliment, ou, autrement dit, les allergies alimentaires. Un modèle d'allergie alimentaire à donc été développé chez la souris et a permis de mesurer plusieurs symptômes et facteurs liés à l'allergie. Puis, ce modèle a été utilisé afin de tester les effets bénéfiques d'une bactérie lactique, dite probiotique, sur le développement de l'allergie. Il a été observé que, sous certaines circonstances, l'administration de la bactérie lactique protégeait entièrement les souris contre les réactions allergiques. L'effet bénéfique dépend donc du probiotique mais également d'autres facteurs encore inconnus â ce jour. Cette étude ouvre la voie sur la compréhension des mécanismes liés aux allergies alimentaires et sur l'impact que peuvent avoir les bactéries probiotiques sur cette maladie. Résumé Le système immunitaire associé aux muqueuses intestinales doit être capable de différencier les antigènes inoffensifs tels que 1a nourriture ou les bactéries commensales des microorganismes potentiellement dangereux. Cet aspect est essentiel pour le maintien de l'homéostase intestinale et fait l'objet du travail présenté ici. Dans un premier projet, les propriétés protectrices de la protéine appelée pièce sécrétoire (SC) ont été étudiées. SC est une protéine connue pour le transport des immunoglobulines à la surface des muqueuses. Cette protéine est fortement glycosylée paz des sucres complexes, ce qui nous a mené à postuler que SC puisse interagir avec le pathogène rotavirus. Cette hypothèse était soutenue par le fait que ce virus adhère aux cellules épithéliales par des résidus glycosylés. Des analyses biochimiques et biologiques ont démontré qu'aucune interaction entre SC et le virus ne prenait place, et que par conséquent SC n'offrait aucune protection contre ce pathogène. En revanche, SC interagit avec d'autres structures pathogéniques, comme la toxine A de Clostridium difficile, et la molécule d'adhésion intimine de la bactérie entéropathogène Escherichia coli. La liaison se fait par l'intermédiaire des sucres et confère ainsi une protection contre ces pathogènes. Ainsi, SC a été identifié comme agent neutralisant au niveau de l'intestin. La deuxième partie de ce travail abordait le sujet des allergies alimentaires, et avait pour but de tester les effets bénéfiques potentiels d'une bactérie probiotique, Lactobacillus paracasei NCC2461, contre les réactions allergiques. Un modèle marin d'allergie alimentaire a été mis au point, permettant de mesurer des immunoglobulines E, des symptômes allergiques, et la dégranulation de mastocytes. Lorsque le probiotique a été administré aux souris, celles-ci ont été complètement protégées des réactions allergiques dans une première expérience. Cependant, cette protection n'a pas été reproduite et suggère que des facteurs environnementaux encore inconnus sont critiques pour que le probiotique agisse positivement. Ce travail a permis de mettre en évidence la complexité de l'approche des traitements liés aux probiotiques et ouvre la voie sur la compréhension des mécanismes liés à l'allergie. Abstract The mucosal immune system associated to the gastrointestinal mucosa must efficiently distinguish between innocuous antigens, such as food proteins and commensal bacteria and potentially infectious agents. The work presented here deals with these two essential aspects guaranteeing intestinal homeostasis. In the first part of this work, the protective properties of secretory component (SC) toward the pathogen rotavirus were investigated. SC, which allows the transport of polymeric immunoglobulins (Ig) to mucosal surfaces, is highly glycosylated with complex glycan structures. The abundance and the nature of these carbohydrates led us to speculate that SC might interact with rotavirus, which is known to bind target cells with glycan receptors. Using various biological and biochemical techniques, we demonstrated that SC did not interact with rotaviruses, nor protected epithelial cells from infection. However, SC was shown to bind to Clostridium difficile toxin A and to the enteropathogenic Echerischia coli adhesion molecule intimin in a glycan-dependent fashion. These interactions allow in vitro protection of epithelial cells using physiological concentrations of SC. These data identify SC as a microbial scavenger at mucosal surfaces, and in the context of secretory IgA, further enhance the neutralising properties of the complex. The second project was inscribed in the domain of food allergy and aimed to test the modulatory functions of a probiotic strain of Lactobacillus paracasei toward allergic reactions. A model of food-mediated allergy was developed in the mouse using mucosal sensitisation. Several parameters associated to allergy were quantified after allergen challenge, and included allergen-specific IgE, allergic signs like diarrhea and temperature drop, and degranulation of mast cells. Administration of the probiotic strain was shown to completely protect mice from allergic reactions. However, these data were not reproduced, suggesting that unknown environmental factors are required so that protection mediated by the probiotic strain occurs. This study paves the way to the understanding of the mechanisms associated to allergy, and highlights the tremendous complexity that probiotic treatments will have to face.

The monocarboxylate transporter MCT4 : mechanism of regulation in astrocytes and its putative role in cerebral ischemia

Despite its small fraction of the total body weight (2%), the brain contributes for 20% and 25% respectively of the total oxygen and glucose consumption of the whole body. Indeed, glucose has been considered the energy substrate par excellence for the brain. However, evidence accumulated over the last half century revealed an important role for the monocarboxylate lactate in fulfilling the energy needs of neurons. This is particularly true during physiological neuronal activation and in pathological conditions. Lactate transport into and out of the cell is mediated by a family of proton-linked transporters called monocarboxylate transporters (MCTs). In the central nervous system, only three of them have been well characterized: MCT2 is the predominant neuronal isoform, while the other non¬neuronal cell types of the brain express the ubiquitous isoform MCT1. Quite recently, the MCT4 isoform has been described in astrocytes. Due to its high transport capacity compared to the other two isoforms, MCT4 is particularly adapted for glycolytic cells. Because of its recent discovery in the brain, nothing was known about its regulation in the central nervous system. Here we show that MCT4 is regulated by oxygen levels in primary cultures of astrocytes in a time- and concentration-dependent manner via the hypoxia inducible factor-la (HIF-la). Moreover, we showed that MCT4 expression is essential for astrocyte survival under low oxygen conditions. In parallel, we investigated the possible implication of the pyruvate kinase isoform Pkm2, a strong enhancer of glycolysis, in its regulation. Then we showed that MCT4 expression, as well as the expression of the other two MCT isoforms, is altered in a murine model of stroke. Surprisingly, neurons started to express MCT4, as well as MCT1, under such conditions. Altogether, these data suggest that MCT4, due to its high transport capacity for lactate, may be the isoform that enables cells to operate a major metabolic adaptation in response to pathological situations that alter metabolic homeostasis of the brain. -- Le cerveau représente 2% du poids corporel total, mais il contribue pour 20% de la consommation totale d'oxygène et 25% de celle de glucose au repos. Le glucose est considéré comme le substrat énergétique par excellence pour le cerveau. Néanmoins, depuis un demi- siècle maintenant, de plus en plus de travaux ont démontré que le lactate joue un rôle majeur dans le métabolisme cérébral et est capable du subvenir aux besoins énergétiques des neurones. Le lactate est tout particulièrement nécessaire pendant l'activation neuronale ainsi qu'en situation pathologique. Le transport du lactate à travers la barrière hématoencéphalique ainsi qu'à travers les membranes cellulaires est assuré par la famille des transporteurs aux monocarboxylates (MCTs). Dans le système nerveux central, uniquement trois d'entre eux ont été décrits: MCT2 est considéré comme le transporteur neuronal, alors que les autres types cellulaires qui constituent le cerveau expriment l'isoforme ubiquitaire MCT1. Récemment, l'isoforme MCT4 a été rapportée sur les astrocytes. Dû à sa grande capacité de transport pour le lactate, MCT4 est tout particulièrement adapté pour soutenir le métabolisme des cellules hautement glycolytiques, comme les astrocytes. En raison de sa toute récente découverte, les aspects comprenant sa régulation et son rôle dans le cerveau sont pour l'instant méconnus. Les résultats exposés dans ce travail démontrent dans un premier temps que l'expression de MCT4 est régulée par les niveaux d'oxygène dans les cultures d'astrocytes corticaux par le biais du facteur de transcription HIF-la. De plus, nous avons démontré que l'expression de MCT4 est essentielle à la survie des astrocytes quand le niveau d'oxygénation baisse. En parallèle, des résultats préliminaires suggèrent que l'isoforme 2 de la pyruvate kinase, un puissant régulateur de la glycolyse, pourrait jouer un rôle dans la régulation de MCT4. Dans la deuxième partie du travail nous avons démontré que l'expression de MCT4, ainsi que celle de MCT1 et MCT2, est altérée dans un modèle murin d'ischémie cérébrale. De façon surprenante, les neurones expriment MCT4 dans cette condition, alors que ce n'est pas le cas en condition physiologique. En tenant compte de ces résultats, nous suggérons que MCT4, dû à sa particulièrement grande capacité de transport pour le lactate, représente le MCT qui permet aux cellules du système nerveux central, notamment les astrocytes et les neurones, de s'adapter à de très fortes perturbations de l'homéostasie métabolique du cerveau qui surviennent en condition pathologique.

Role of basic calcium phosphate crystals in osteoarthritis

L'arthrose est une maladie dégénérative des articulations due à une dégradation progressive du cartilage. La calcification de l'articulation (essentiellement due à des dépôts de cristaux de phosphate de calcium basique -cristaux BCP-) est une caractéristique de cette maladie. Cependant, le rôle des cristaux BCP reste à déterminer. Nous avons tout d'abord déterminé en utilisant des cultures primaires de chondrocytes que les cristaux de BCP induisaient la production de la cytokine IL-6, via une signalisation intracellulaire implicant les kinase Syk, PI3 et Jak et Stat3. Les cristaux de BCP induisent également la perte de protéoglycanes et l'expression de IL-6 dans des explants de cartlage humain et ces deux effets peuvent être bloqués par un inhibiteur de IL-6, le Tocilizumab. Par ailleurs, nous avons trouvé que l'IL-6 ajouté à des chondrocytes, favorisait la formation de cristax de BCP et augmentait l'expression de gènes impliqués dans le processus de minéralisation : Ank (codant pour un transporteur de pyrophooshate), Annexin5 (codant pour un canal calcique) et Pit-1 (codant pour un transporteur de phoshate). In vivo, les cristaux de BCP injectés dans l'articulation de souris induisent une érosion du cartilage. Dans un modèle murin d'arthrose du genou induit par ménisectomie, nous avons observé la formation progressive de cristaux de BCP. Fait intéressant, la présence de ces cristaux dans l'articulation précédait la destruction du cartilage. Un agent susceptible de bloquer les calcifications tel que le sodium thiosulfate (STS), administré à des souris ménisectomisées, inhibait le dépôt intra-articulaire de ces cristaux ainsi que l'érosion du cartilage. Nous avons identifié ainsi un cercle vicieux dans l'arthrose, les cristaux induisant l'interleukine-6 et l'interleukine-6 induisant la formation de ces cristaux. Nous avons étudié si on pouvait bloquer cette boucle cristaux de BCP-IL6 soit par des agents décalcifiants, soit par des inhibiteurs d'IL-6. In vitro, des anticorps anti IL- 6 ou des inhibiteurs de signalisation, inhibaient significativement IL-6 et la minéralisation induite par IL-6. De même le STS inhibait la formation de ces cristaux et la production de l'IL-6. Tout récemment, nous avons trouvé que des inhibiteurs de la xanthine oxidoréductase étaient aussi capables d'inhiber à la fois la production d'IL-6 et la minéralization des chondrocytes. Finalement, nous avons pu exclure un rôle du système IL-1 dans le modèle d'arthrose induite par ménisectomie, les souris déficientes pour IL-1a/ß, MyD88 et l'inflammasome NLRP3 n'étant pas protégées dans ce modèle d'arthrose. L'ensemble de nos résultats montre que les cristaux BCP sont pathogéniques dans l'arthrose et qu'un inhibiteur de minéralisation tel que le STS ou un inhibiteur de l'interleukine-6 constitueraient des nouvelles thérapies pour l'arthrose. -- Osteoarthritis (OA), the most common degenerative disorder of the joints, results from an imbalance between the breakdown and repair of the cartilage and surrounding articular structures. Joint calcification (essentially due to basic calcium phosphate (BCP) crystal deposition) is a characteristic feature of OA. However, the role of BCP crystal deposition in the pathogenesis of OA remains unclear[1][1]. We first demonstrated that in primary murine chondrocytes exogenous BCP crystals led to IL-6 up-modulation and that BCP crystal signaling pathways involved Syk and PI3 kinases, and also gp130 associated molecules, Jak2 and Stat3. BCP crystals also induced proteoglycan loss and IL-6 expression in human cartilage expiants, (which were significantly reduced by an IL-6 inhibitor). In addition, we found that in chondrocytes exogenous IL-6 promoted calcium-containing crystal formation and up- regulation of genes codifying for proteins involved in the calcification process: the inorganic pyrophosphate transport channel Ank, the calcium channel Annexinö and the sodium/phosphate cotransporter Piti. In vivo, BCP crystals injected into murine knee joints induced cartilage erosion. In the menisectomy model, increasing deposits, identified as BCP crystals, were progressively observed around the joint before cartilage erosion. These deposits strongly correlated with cartilage degradation and IL-6 expression. These results demonstrated that BCP crystals deposition and IL-6 production are mutually reinforcing in the osteoarthritic pathogenic process. We then investigated if we could block the BCP-IL6 loop by either targeting IL-6 production or BCP crystal deposits. Treatment of chondrocytes with anti-IL-6 antibodies or inhibitors of IL-6- signaling pathway significantly inhibited IL-6-induced crystal formation. Similarly, sodium thiosulfate (STS), a well-known systemic calcification inhibitor, decreased crystal deposition as well as HA-induced IL-6 secretion in chondrocytes and, in vivo, it decreased crystal deposits size and cartilage erosion in menisectomized knees. Interestingly, we also found that xanthine-oxidoreductase (XO) inhibitors inhibited both IL-6 production and calcium crystal depositis in chondrocytes. We began to unravel the mechanisms involved in this coordinate modulation of IL-6 and mineralization. STS inhibited Reactive Oxygen Species (ROS) generation and we are currently investigating whether XO represents a major source of ROS in chondrocyte mineralization. Finally, we ruled out that IL-1 activation/signaling plays a role in the murine model of OA induced by menisectomy, as IL-1a/ß, the IL-1 R associated molecule MyD88 and NLRP3 inflammasome deficient mice were not protected in this model of OA. Moreover TLR-1, -2, -4,-6 deficient mice had a phenotype similar to that of wild-type mice. Altogether our results demonstrated a self-amplification loop between BCP crystals deposition and IL-6 production, which represents an aggravating process in OA pathogenesis. As currently prescribed OA drugs are addressing OA symptoms,our results highlight a potential novel treatment strategy whereby inhibitors of calcium- containing crystal formation and IL-6 could be combined to form the basis of a disease modifying treatment and alter the course of OA.

Creatine deficiency syndomes : a new model of partial GAMT deficiency affecting brain cell development

Les syndromes de déficiences cérébrales en créatine (CCDS) sont dus à des mutations dans les gènes GATM et G AMT (codant pour les enzymes AGAT et G AMT de la voie de synthèse de créatine) ainsi que SLC6A8 (transporteur de créatine), et génèrent une absence ou une très forte baisse de créatine (Cr) dans le cerveau, mesurée par spectroscopic de résonance magnétique. Les patients CCDS développent des handicaps neurologiques sévères. Les patients AGAT et GAMT peuvent être traités avec des doses importantes de Cr, mais gardent dans la plupart des cas des séquelles neurologiques irréversibles. Aucun traitement efficace n'existe à ce jour pour la déficience en SLC6A8. Bien que de nombreux modèles aient été développés pour comprendre la Cr cérébrale en conditions physiologiques, les pathomécanismes des CCDS ne sont pas encore compris. Des souris transgéniques pour les gènes Gatm, Gamt et Slc6a8 ont été générées, mais elles ne miment que partiellement la pathologie humaine. Parmi les CCDS, la déficience en GAMT est la plus sévère, en raison de l'accumulation cérébrale de l'intermédiaire guanidinoacétate (GAA). Alors que la toxicité cérébrale du GAA a été étudiée par exposition directe au GAA d'animaux adultes sains, les mécanismes de la toxicité du GAA en condition de déficience en GAMT dans le cerveau en développement sont encore inconnus. Le but de ce projet était donc de développer un modèle de déficience en GAMT dans des cultures 3D primaires de cellules nerveuses de rat en agrégats par knock-down du gène GAMT, en utilisant un virus adéno-associé (AAV) induisant le mécanisme d'interférence à l'ARN (RNAi). Le virus scAAV2, à la multiplicité d'infection de 1000, s'est révélé le plus efficace pour transduire tous les types de cellules nerveuses des cultures (neurones, astrocytes, oligodendrocytes), et générer un knock-down maximal de la protéine GAMT de 85% (jour in vitro 18). Cette déficience partielle en GAMT s'est révélée insuffisante pour générer une déficience en Cr, mais a causé l'accumulation attendue de GAA, à des doses comparables aux niveaux observés dans le LCR des patients GAMT. Le GAA a induit une croissance axonale anarchique accompagnée d'une baisse de l'apoptose naturelle, suivis par une induction tardive de mort cellulaire non-apoptotique. Le co-traitement par la Cr a prévenu tous les effets toxiques du GAA. Ce travail montre que l'accumulation de GAA en absence de déficience en Cr est suffisante pour affecter le développement du tissu nerveux, et suggère que des formes de déficiences en GAMT supplémentaires, ne présentant pas de déficiences en Cr, pourraient être découvertes par mesure du GAA, en particulier à travers les programmes récemment proposés de dépistage néonatal de la déficience en GAMT. -- Cerebral creatine deficiency syndromes (CCDS) are caused by mutations in the genes GATM and GAMT (respectively coding for the two enzymes of the creatine synthetic pathway, AGAT and GAMT) as well as SLC6A8 (creatine transporter), and lead to the absence or very strong decrease of creatine (Cr) in the brain when measured by magnetic resonance spectroscopy. Affected patients show severe neurological impairments. While AGAT and GAMT deficient patients can be treated with high dosages of Cr, most remain with irreversible brain sequelae. No treatment has been successful so far for SLC6A8 deficiency. While many models have helped understanding the cerebral Cr pathways in physiological conditions, the pathomechanisms underlying CCDS are yet to be elucidated. Transgenic mice carrying mutations in the Gatm, Gamt and Slc6a8 genes have been developed, but only partially mimic the human pathology. Among CCDS, GAMT deficiency is the most severe, due to the CNS accumulation of the guanidinoacetate (GAA) intermediate. While brain toxicity of GAA has been explored through direct GAA exposure of adult healthy animals, the mechanisms underlying GAA toxicity in GAMT deficiency conditions on the developing CNS are yet unknown. The aim of this project was thus to develop and characterize a GAMT deficiency model in developing brain cells by gene knockdown, by adeno-associated virus (AAV)-driven RNA interference (RNAi) in rat 3D organotypic primary brain cell cultures in aggregates. scAAV2 with a multiplicity of infection of 1000 was shown as the most efficient serotype, was able to transduce all brain cell types (neurons, astrocytes, oligodendrocytes) and to induce a maximal GAMT protein knockdown of 85% (day in vitro 18). Metabolite analysis showed that partial GAMT knockdown was insufficient to induce Cr deficiency but generated the awaited GAA accumulation at concentrations comparable to the levels observed in cerebrospinal fluid of GAMT-deficient patients. Accumulated GAA induced axonal hypersprouting paralleled with inhibition of natural apoptosis, followed by a later induction in non-apoptotic cell death. Cr supplementation led to the prevention of all GAA-induced toxic effects. This work shows that GAA accumulation without Cr deficiency is sufficient to affect CNS development, and suggests that additional partial GAMT deficiencies, which may not show the classical brain Cr deficiency, may be discovered through GAA measurement including by recently proposed neonatal screening programs for GAMT deficiency.

PEC1/AtABCG32 transport function in cuticle biosynthesis

Most aerial parts of the plants are covered by a hydrophobic coating called cuticle. The cuticle is formed of cutin, a complex mixture of esterified fatty acids that are embedded and associated with waxes. The cuticle often appears as a superposition of layers of different composition: The cuticle proper formed of cutin and a mixture of waxes and underneath, the cuticle layer containing cutin, intracuticular waxes and polysaccharides of the cell wall. In addition to its involvement in plant development by preventing organ fusions, the cuticle acts as a barrier to prevent water loss and protect plants against environmental aggressions such as excessive radiation or pathogens attacks. PEC1/AtABCG32 is an ABC transporter from the PDR family involved in cutin biosynthesis. Characterization of the peci mutant in Arabidopsis thaliana showed that PEC1 plays a significant role in the diffusion barrier formation in leaves and petals. The cuticles of leaves and flowers of peci are permeable and the cuticular layer rather than the cuticular proper was altered in the petals, underlining the importance of this particular layer in the maintenance of the diffusion barrier. Chemical analysis on the flower cutin monomer composition of ped mutant revealed a decrease in hydroxylated cutin monomers, suggesting a function of PEC1 in the incorporation of these monomers in the polymer cutin. However, the exact nature of the substrates of PEC1 remained elusive. PEC1 homologues in barley and rice, respectively HvABCG31/EIBI1 and OsABCG31, are also implicated in cuticle biosynthesis. Interestingly, the rice mutant displays more severe phenotypes such as dwarfism and spreading necrosis conducting to the seedling death. In this work, we further characterized osabcg31 mutant and hairpin-RNAi downregulated OsABCG31 plant lines showing reduced growth and cuticle permeability. Our analysis showed a decrease in hydroxylated cutin monomers and severe disruptions in the cuticle, which explain the permeability. Further insights into the function of the cuticle in rice resistance/susceptibility to Pathogens were obtained after inoculation with Magnaporthe oryzae, the fungus responsible for the rice blast disease. Osabcg31 as well as the transgenic lines downregulating OsABCG31 showed increased resistance to the fungus. However, only later steps of infection are reduced . and no impact is obseived on the germination or penetration stages, suggesting that the cuticle disruption per se is not responsible for the resistance. We further investigated the cause of the resistance by analyzing the expression of defense related gene in osabcg31 prior to infection. We found that osabcg31 constitutively express defense related genes, which may explain the resistance, the dwarfism and the cell death. osabcg31 is thus a tool to study the connection between cuticle, plant development and defense signaling networks in rice. The transport function of PEC1 family members is still unknown. In order to link cutin biosynthesis and transport activity, we combined ped mutation with mutations in cutin synthesis related genes. Here, we show that PEC1 acts independently from GPAT4 and GPAT8 pathway and partially overlaps with GPAT6 biosynthesis pathway that leads to the production of hydroxylated C16 cutin precursor 2-Mono(10,16-dihydroxyhexadecanoylJglycerol (2-MHG). In addition, we noticed that despite a comparable cutin monomer composition, ped mutant leaves cuticle are permeable while that of gpat6 mutant are not. This finding raises the possibility of PEC1 being required for the incorporation of C16 hydroxylated monomers and their structural arrangement rather than their direct transport towards the cuticle. A careful investigation of the cuticle permeability, cutin composition and ultrastructure during leave development in Wt plants and ped mutants revealed a possible different regulation of several pathways of cutin biosynthesis and showed the importance of PEC1 function early during leave cuticle maturation. In order to elucidate the transport activity of PEC1, we successfully expressed PEC1 in Nicotiana benthamiana plant system for direct transport experiments. This system will be used to test the PEC 1-dependent transport of potential substrates such as sn-2-monoacylglycerol loaded with a hydroxylated C16 fatty acid. -- Toutes les parties aériennes des plantes sont recouvertes d'une couche hydrophobe appelée «cuticule». Cette cuticule est composée de cutine, un polymère d'acides gras estérifiés, et de cires. La cuticule apparaît souvent sous forme de couches superposées: une première couche extérieure appelée «cuticle proper» formée de cutine et d'un mélange de cires, et une deuxième couche, la «cuticle layer», formée de cutine associée à des cires intracuticulaires et des polysaccharides pariétaux. La cuticule joue le rôle de barrière prévenant contre la perte d'eau et les agressions environnementales. AtABCG32/PEC1 est un transporteur ABC de la famille des PDR impliqué dans la synthèse de la cutine. L'étude du mutant peci d'Arabidopsis thaliana a révélé une fonction de PEC1 dans la formation de la barrière de diffusion. La cuticule des feuilles et fleurs de peci est perméable. Des altérations de la «cuticle layer» ont été démontrées, soulignant son importance dans le maintien de la barrière. L'analyse de la composition de la cutine de peci a montré une réduction spécifique en monomères hydroxylés, suggérant un rôle de PEC1 dans leur incorporation dans la cuticule. Cependant, la nature exacte des substrats de PEC1 n'a pas été identifiée. PEC1 possède deux homologues chez l'orge et le riz, respectivement HvABCG31 et OsABCG31, et qui sont impliqués dans la biosynthèse de la cuticule. Chez le riz, des phénotypes plus sévères ont été observés tels que nanisme et nécroses conduisant à la mort des jeunes plants. Dans cette étude, nous avons continué la caractérisation de osabcg31 ainsi que des lignées de riz sous exprimant le gène OsABCG31 et présentant une cuticule perméable tout en ayant une meilleure croissance. Notre étude a démontré une réduction des monomères hydroxylés de cutine et une désorganisation de la structure de la cuticule, aggravée dans le mutant osabcg31. Ce résultat explique la perméabilité observée. Des mformations P|us approfondies sur l'implication de la cuticule dans la résistance aux pathogènes ont été obtenues après inoculation du mutant osabcg31 et les lignées sous- exprimant OsABCG31 avec une souche virulente de Magnaporthe Oryzae, le champignon responsable de la pyriculariose du riz. Les différentes lignées testées ont démontré une résistance au pathogène. Cependant, seules les étapes tardives de l'infection sont réduites et aucun impact n'est observé sur la germination des spores ou la pénétration du champignon, suggérant que les modifications de la cuticule ne sont pas directement à l'origine de la résistance. L'analyse de l'expression de gènes impliqués dans la résistance à Magnaporthe.oryzae a mis en évidence l'expression constitutive de ces gènes en l'absence de tout contact avec le pathogène. Ceci explique la résistance, le nanisme et la mort cellulaire observés. Ainsi, osabcg31 représente un outil efficace pour l'étude intégrée des systèmes de régulation de la défense, de développement des plantes et la cuticule. La nature des substrats transportés par PEC1/AtABCG32 reste inconnue. Dans le but d'établir une liaison entre biosynthèse de cutine et transport des précurseurs par PEC1, la mutation peci a été combinée avec des mutants impliqués dans différentes voies de biosynthèse. Cette étude a démontré une fonction indépendante de PEC1 de la voie de biosynthèse impliquant les enzymes GPAT4 et GPAT8, et une fonction partiellement indépendante de la voie impliquant GPAT6 qui mène à la production de précurseurs sn-2- monoacylglycerol chargés en acides gras en C16 (2-MHG). De plus, malgré un profil similaire en monomères de cutine, gpat6 conserve une cuticule imperméable alors que celle de PEC1 est perméable. Ceci suggère que PEC1 est nécessaire à l'incorporation des monomères en C16 et leur arrangement structurel plutôt que simplement à leur transport direct. L'étude approfondie de la perméabilité cuticulaire, de la structure ainsi que de la composition en cutine pendant le développement des feuilles de peci et la plante sauvage a révélé l'existence de différentes régulations des voies de biosynthèses des monomères et a démontré l'importance de PEC1 dans les premières étapes de la mise en place de la cuticule. Pour identifier les substrats transportés, l'expression de PEC1 chez le système hétérologue Nicotiana benthamiana a été conduite avec succès. Ce système sera utilisé pour tester le transport de substrats potentiels tels que le sn-2-monoacylglycerol chargé en acide gras en C16.

Multimodal carrier liability in the U.S. and Canada : towards uniformity of applicable rules?

"Thèse présentée à la Faculté des études supérieures en vue de l'obtention du grade de Docteur en Droit (LL.D.) et à la Faculté de Droit et de Sciences Politiques de l'Université de Nantes en vue de l'obtention du grade de Docteur"