Estudo da imobilização de proteases para a síntese de oligolisinas

Enzymatic synthesis of peptides using proteases has attracted a great deal of attention in recent years. One key challenge in peptide synthesis is to find supports for protease immobilization capable of working in aqueous medium at high performance, producing watersoluble oligopeptides. At present, few reports have been described using this strategy. Therefore, the aim of this thesis was to immobilize proteases applying different methods (Immobilization by covalent bound, entrapment onto polymeric gels of PVA and immobilization on glycidil metacrylate magnetic nanoparticles) in order to produce water-soluble oligopeptides derived from lysine. Three different proteases were used: trypsin, α-chymotrypsin and bromelain. According to immobilization strategies associated to the type of protease employed, trypsin-resin systems showed the best performance in terms of hydrolytic activity and oligopeptides synthesis. Hydrolytic activities of the free and immobilized enzymes were determined spectrophotometrically based on the absorbance change at 660 nm at 25 °C (Casein method). Calculations of oligolysine yield and average degree of polymerization (DPavg) were monitored by 1H-NMR analysis. Trypsin was covalently immobilized onto four different resins (Amberzyme, Eupergit C, Eupergit CM and Grace 192). Maximum yield of bound protein was 92 mg/g, 82 mg/g and 60 mg/g support for each resin respectively. The effectiveness of these systems (Trypsin-resins) was evaluated by hydrolysis of casein and synthesis of water-soluble oligolysine. Most systems were capable of catalyzing oligopeptide synthesis in aqueous medium, albeit at different efficiencies, namely: 40, 37 and 35% for Amberzyme, Eupergit C and Eupergit CM, respectively, in comparison with free enzyme. These systems produced oligomers in only 1 hour with DPavg higher than free enzyme. Among these systems, the Eupergit C-Trypsin system showed greater efficiency than others in terms of hydrolytic activity and thermal stability. However, this did not occur for oligolysine synthesis. Trypsin-Amberzyme proved to be more successful in oligopeptide synthesis, and exhibited excellent reusability, since it retained 90% of its initial hydrolytic and synthetic activity after 7 reuses. Trypsin hydrophobic interactions with Amberzyme support are responsible for protecting against strong enzyme conformational changes in the medium. In addition, the high concentration of oxirane groups on the surface promoted multi-covalent linking and, consequently, prevented the immobilized enzyme from leaching. The aforementioned results suggest that immobilized Trypsin on the supports evaluated can be efficiently used for oligopeptides synthesis in aqueous media

Estudo integrado do potencial fitorremediador da Eichhornia crassipes em ambientes naturais e sua utilização para obtenção de extratos proteicos

This study aimed to analyze the phytoremediation potential of Eichhornia crassipes in natural environments, optimize the extraction process of crude protein from plant tissue and, obtain and characterize this process in order to determine its viability of use instead of the protein sources of animal and/or human feed. For this, it has been determined in Apodi/Mossoró river water the concentration of ammonium ions, nitrite, nitrate, calcium, magnesium, potassium, iron, copper, manganese, zinc, nickel, cobalt, sodium, aluminum, cádmium, lead, and total chromium; It was determined in plant tissue of aquatic macrophytes of Eichhornia crassipes species present in Apodi/Mossoró River the moisture content, ash, calcium, magnesium, potassium, iron, copper, manganese, zinc, nickel, cobalt, sodium, aluminum, cadmium, lead, total chromium, total nitrogen and crude protein. It was also determined the translocation factor and bioaccumulation of all the quantified elements; It was developed and optimized the extraction procedure of crude protein based on the isoelectric method and a factorial design 24 with repetition; It was extracted and characterized the extract obtained by determining the moisture content, ash, magnesium, potassium, iron, copper, manganese, zinc, nickel, cobalt, sodium, cadmium, total nitrogen and crude protein. And finally, it was also characterized the protein extract using Thermogravimetric Analysis (TG), Derived Thermogravimetric (DTG), Differential Scanning Calorimetry (DSC), Infrared Spectroscopy (FT-IR) and jelly-like electrophoresis of polyacrylamide (SDS -PAGE) to assess the their molecular weights/mass. Thus, from the results obtained for the translocation and bioaccumulation factors was found that the same can be used as phytoremediation agent in natural environments of all quantified elements. It was also found that the developed method of extraction and protein precipitation was satisfactory for the purpose of the work, which gave the best conditions of extraction and precipitation of proteins as: pH extraction equal to 13.0, extraction temperature equals 60 ° C, reaction time equals to 30 minutes, and pH precipitation equals to 4.0. As for the extract obtained, the total nitrogen and crude protein were quantified higher than those found in the plant, increasing the crude protein content approximately 116.88% in relation to the quantified contente in the vegetal tissue of macrophyte. The levels of nickel and cadmium were the unique that were found below the detection limit of used the equipment. The electrophoretic analysis allowed us to observe that the protein extract obtained is composed of low polypeptide chains by the molecular and phytochelatins, with 6 and 15 kDa bands. Analysis of TG, DTG, DSC and FT-IR showed similarities in protein content of the obtained extracts based on different collection points and 9 parts of the plant under study, as well as commercial soy protein and casein. Finally, based on all these findings, it was concluded that the obtained extract in this work can be used instead of the protein sources of animal feed should, before that, test its digestibility. As human supplementation, it is necessary to conduct more tests associated with the optimization process in the sense of removing undesirable components and constant monitoring of the water body and the raw material used

Alterations in the intestinal wall due to protein malnutrition in rats. Evaluation of the rupture strength and the tissue's collagen

OBJETIVO: Avaliar o efeito da desnutrição protéica na parede intestinal do rato através da medida de força de ruptura e dosagem do colágeno tecidual no íleo e cólon distal. MÉTODOS: Foram utilizados 120 ratos, pesando em média 100g, que receberam durante 07 dias uma dieta padrão, contendo 20% de caseína para adaptação dos animais as condições do biotério. Após esse período os animais foram divididos em dois grupos de 60, o controle denominado grupo um que recebeu a dieta padrão, e o grupo teste denominado grupo dois, que recebeu dieta hipoprotéica contendo 2% de caseína. Os dois grupos receberam suas respectivas dietas por um período de 21 dias. Após esse período iniciou-se o sacrifício seqüencial dos animais em ambos os grupos, em número de 12 animais em cada momento, correspondendo ao dia Zero (MO), 4º dia (M1), 7º dia (M2), 14º dia (M3), e 21º dia (M4) sendo mantida a mesma dieta até o final do sacrifício. em cada momento foram avaliados o peso corpóreo, albumina sanguínea, hidroxiprolina tecidual, relação hidroxiprolina/proteína tecidual e a força de ruptura no segmento ileal e cólico dos animais. RESULTADOS: Observou-se que a força de ruptura do segmento ileal e do cólon distal foi menor nos animais desnutridos (Grupo 2). A perda da resistência mecânica foi maior no segmento do cólon distal do que no segmento ileal, provavelmente pela menor concentração do colágeno tecidual no cólon distal. CONCLUSÃO: A desnutrição protéica induz a diminuição da resistência mecânica no íleo e no cólon distal associado a diminuição do colágeno tecidual na parede intestinal.

Composição química e qualidade biológica da torta de colza (Brassica napus, L: )

A composição química e a qualidade biológica da torta de colza obtida da semente, variedade CTC-4, foram determinados. A farinha foi preparada me diante prensagem da semente e extração da gordura com solvente, lixiviada durante 2 horas, com água corrente na proporção de 1:5, e agitação constante, a fim de reduzir os níveis de glicosinolatos. O efeito tóxico foi observado através do peso dos órgãos e da histopatologia dos órgãos em experimento de 60 dias. A qualidade biológica da torta desintoxicada, ao nível de 5% e 10%, foi semelhante ao da caseína (PER controle 3,18 vs 3,08, 5% e 2,98, 10%). O PER da torta crua foi de 2,28. Os ratos que receberam a farinha crua tiveram órgãos maiores. As tireóides dos ratos submetidos as dietas 2 e 3, não demonstraram alterações que suspeitassem de um efeito bociogênico e as alterações ocorridas nas tireóides dos animais que receberam, D-4 foram semelhantes àquelas ocorridas nos grupos 2 e 3. Não houve danos célulares graves em relação ao fígado, os rins, o coração, baço e supra-renais para todos os grupos observados. O método de extração dos fatores tóxicos da colza foi eficiente de acordo com os resultados obtidos para o presente estudo.

Efeito da gordura protegida sobre a produção e composição do leite em ovelhas da raça Bergamácia

Objetivou-se avaliar o efeito da gordura protegida sobre a produção e composição do leite em ovelhas da raça Bergamácia. Utilizaram-se 77 ovelhas distribuídas, por ordem de parição e idade, em duas dietas: uma composta de silagem de milho e concentrado; e outra com gordura protegida (35 g/ovelha/dia) no concentrado. As dietas foram isoenergéticas e isoproteicas e continham 70% NDT e 16% PB com base na matéria seca. Os cordeiros permaneceram com suas mães até os 45 dias de idade, quando foram desmamados. Quarenta e oito horas após o parto, deu-se início a ordenha realizada uma vez ao dia, às 7 h, para mensuração diária da produção de leite durante 60 dias. Amostras de leite foram coletadas semanalmente para análise da composição centesimal e do teor de caseína. A dieta com gordura protegida promoveu maior produção média diária de leite após a desmama (0,531 vs 0,489 kg/dia), entretanto, a produção total do período não diferiu entre controle e com gordura protegida (0,453 vs 0,468 kg/dia, respectivamente). Não foi observada influência das dietas sobre os teores de gordura do leite até a sexta semana de lactação. As diferenças ocorreram apenas após a desmama. Os teores de alfa e beta caseínas diferiram entre os grupos controle e gordura protegida (31,73 vs 18,56 Kda para alfa-caseína e 32,67 vs 26,44 Kda para beta-caseína, respectivamente). A adição de gordura protegida na dieta não altera a produção nem a composição centesimal do leite até a desmama.

Dieta hiperlipídica com farinha de soja como fonte proteica: utilização na seleção de ratos propensos e resistentes à obesidade

OBJETIVO: Desenvolver uma dieta hiperlipídica de baixo custo, tendo farinha de soja como fonte proteica, que seja eficiente na seleção de ratos propensos e resistentes à obesidade e que permita alcançar fenótipo obeso nos animais propensos. Além desses requisitos, a dieta deve ser palatável e não rejeitada a curto prazo pelo animal. MÉTODOS: A dieta proposta foi obtida misturando-se leite condensado (15,5%), amendoim (18,5%), farinha de soja (20,0%), óleo de milho (6,0%), ração Bio Tec (30,0%) e bolacha wafer de chocolate (10,0%). A mistura foi peletizada e submetida à análise bromatológica. A dieta foi ofertada a ratos Wistar durante uma semana; posteriormente, os animais foram divididos em três grupos, de acordo com o ganho de peso. O terço superior foi considerado propenso à obesidade e o terço inferior, resistente à obesidade. Após 80 dias de oferta da dieta, os animais foram sacrificados e foram quantificados o peso corpóreo, consumo alimentar, gorduras retroperitoneal, periepididimal, de carcaça e gorduras totais. RESULTADOS: Verificou-se que a dieta apresentava 5,31kcal/g, com a seguinte composição: 22,3% de gordura, 22,2% de proteína, 15,9% de fibra, estimando-se 35,7% de carboidrato. Ratos propensos à obesidade, alimentados por 87 dias com a dieta hipercalórica, apresentaram peso corpóreo, gorduras retroperitoneal, periepididimal e totais significativamente maiores do que animais resistentes à obesidade (p<0,05). O consumo de alimentos também foi maior em animais propensos (p<0,05). Verificou-se também que a substituição da caseína pela farinha de soja, como componente proteico da ração, levou à diminuição de 96,0% no custo do estudo. CONCLUSÃO: A dieta formulada com farinha de soja apresentou custo reduzido e foi capaz de desenvolver o fenótipo obeso em ratos propensos, à semelhança do observado na literatura com outras dietas.

Microbial rennet produced by Mucor miehei in solid-state and submerged fermentation

Fundação de Amparo à Pesquisa do Estado de São Paulo (FAPESP)

Queijo Parmesão: caracterização físico-química, microbiológica e microestrutura

Fundação de Amparo à Pesquisa do Estado de São Paulo (FAPESP)

LENTIL TANNIN-GLOBULIN INTERACTIONAND and IN VITRO HYDROLYSIS

As frações protéicas foram isoladas dos cotiledones e os taninos isolados e purificados da casca da lentilha. A fração globulina correspondeu a 42,7 % do nitrogenio total da farinha de lentilha representando a fração protéica majoritária. Comparativamente ao metanol e metanol-HCl 1% a mistura acetona:água (7:3) representou o melhor meio extrator para os taninos da casca. A fração globulina isolada, nativa e aquecida (99oC/15 min), e caseína foram hidrolisadas com tripsina e pepsina na ausência de taninos e na presença de relações tanino:proteína de 1:40, 1:20, 1:10, 1:5 e 1:2,5. A hidrólise tríptica e péptica das proteínas não-aquecidas foram reduzidas com o aumento da relação tanino-proteína. A caseína não aquecida mostrou ser mais susceptível à tripsina que à globulina, o oposto sendo observado com a pepsina. O aquecimento seguido de interação com os taninos e hidrólise teve um efeito mais pronunciado sobre a digestão com tripsina que com pepsina para ambas proteínas.

Exigência Protéica e Relação Energia/Proteína para Alevinos de Piracanjuba (Brycon orbignyanus)

O objetivo do presente estudo foi determinar a exigência protéica e correspondente relação energia/proteína em dietas para alevinos de piracanjuba, Brycon orbignyanus. Seis dietas semi-purificadas isocalóricas foram formuladas para conter 3.000 kcal de energia metabolizável (EM)/kg e concentrações de proteína bruta (PB) de 24, 26, 29, 32, 36 e 42%. Para essas concentrações, as relações E/P das dietas foram de 12,3; 11,6; 10,4; 9,2; 8,5 e 7,1 kcal EM/g PB, respectivamente. As fontes de proteína, lipídios e carboidratos digestíveis foram, respectivamente, caseína/gelatina, óleo de fígado de bacalhau/óleo de soja e dextrina. Após condicionamento de cinco dias, as dietas foram fornecidas, até a saciedade, em duas alimentações diárias, a 162 alevinos (27 peixes/dieta), que apresentaram 8,38 ± 0,09 g de peso médio inicial, distribuídos em 18 tanques de fibra-de-vidro de 100 L, conectados a um sistema de recirculação de água. A temperatura média da água foi de 26,3°C, com extremos de 23,7 e 30,2°C. Após 90 dias, a concentração de proteína na dieta que proporcionou ganho em peso máximo aos peixes foi 29% PB, com relação E/P igual a 10,4 kcal EM/g PB. As dietas com concentrações de PB iguais a 32, 36 e 42% não se mostraram superiores para conversão alimentar, taxa de eficiência protéica, valor produtivo da proteína e retenção de energia bruta. A deposição corporal de proteína e gordura não sofreu influência da concentração de PB da dieta

Impacto da desnutrição fetal/neonatal e do exercício durante a recuperação nutricional sobre lipídios teciduais e homeostase glicêmica de ratos

Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior (CAPES)

Análise metaloproteômica de cálcio, ferro e zinco em colostro, leite de transição e leite maduro humanos

Pós-graduação em Biologia Geral e Aplicada - IBB

Produção de glicerol quinase em Pichia pastoris

Fundação de Amparo à Pesquisa do Estado de São Paulo (FAPESP)

Produção, purificação, caracterização bioquímica e determinação do padrão de ação de protease do fungo termofílico Thermoascus aurantiacus

Fundação de Amparo à Pesquisa do Estado de São Paulo (FAPESP)

Efeito de colágeno hidrolisado sobre a qualidade tecnológica de queijo Minas frescal light

Pós-graduação em Engenharia e Ciência de Alimentos - IBILCE