Clonagem e caracterização parcial de cDNA de glândula salivar de Boophilus microplus (Acari:Ixodidae) similar a glutationa s-transferase

O carrapato Boophilus microplus é um ectoparasita hematófago de bovino que causa sérias perdas econômicas. Estudos para o desenvolvimento de formas alternativas de controle do carrapato tem sido realizados para diminuir ou substituir a aplicação de agentes químicos, que contaminam o ambiente, os derivados da carne, além dos problemas de resistência das gerações de carrapatos aos acaricidas. As vacinas são uma forma alternativa de controle do carrapato. As enzimas glutationa S-transferase (GSTs) são alvo potencial para intervenção imunológica contra alguns parasitas. Este trabalho teve como objetivo isolar e caracterizar parcialmente um cDNA de B. microplus similar a GST da classe Mu. O clone SG2 foi isolado dentre aproximadamente 8 x 103 pfu de fagos recombinantes de uma biblioteca de cDNA de glândula salivar de partenógina, sondada com anti-soro de coelho contra glândula salivar. O clone SG2 contendo um inserto de 864 pb teve sua seqüência determinada e a fase de leitura aberta corresponde a 220 amino ácidos. A análise desta seqüência indicou que o gene clonado codifica uma GST de B. microplus (BmGST) com um motivo altamente conservado entre os resíduos 60 e 68 que compreende o sítio de ligação a glutationa (GSH) e outro motivo SLAILRYL, centrado no resíduo 78 da seqüência. No alinhamento múltiplo da AgSG2 com outras GSTs foi observada uma similaridade de até 41% com GSTs da classe Mu de outros organismos e inclusive com outra GST da classe Mu isolada de larva de B. microplus (HE et al., 1999). A proteína recombinante AgSG2 purificada apresentou atividade enzimática contra o substrato cromogênico CDNB. Ensaios de atividade enzimática com extratos de tecidos, secreções e excreções foram realizados para verificar a presença de GST. Ensaios de RT-PCR com tecidos de B. microplus indicaram que os sítios de síntese de BmGST são glândulas salivares e intestino de partenógina e teleógina.

Caracterização molecular e morfofisiológica de diferentes isolados do fungo entomopatogênico Metarhizium anisopliae e análise morfológica do processo de infecção em Boophilus microplus

A caracterização molecular e morfofisiológica de 28 isolados de Metarhizium ssp. foi avaliada por análises de seqüências do espaçador transcrito interno (ITS1 e ITS2), presença de elementos dsRNA e taxa de crescimento e esporulação em diferentes temperaturas e pH. A patogenicidade de 19 isolados do fungo entomopatogênico Metarhizium ssp. foi avaliada para fêmeas ingurgitadas do carrapato Boophilus microplus. As alterações cronológicas durante o processo de infecção Metarhizium anisopliae isolado E6 em B. microplus foi avaliada em detalhe por microscopia óptica e eletrônica de varredura e transmissão. O seqüenciamento do espaçador transcrito interno confirmou a identidade taxonômica dos isolados avaliados como M. anisopliae var. anisopliae ou M. anisopliae var. majus e mostrou que dois isolados (CG291 e CG423), previamente classificados como Metarhizium flavoviride, são pertencentes a M. anisopliae var. anisopliae. Os testes sobre a influência da temperatura e pH no desenvolvimento e esporulação dos isolados evidenciaram que a melhor temperatura de crescimento para a maioria desses foi 28oC e que o crescimento foi ótimo na faixa de pH entre 4 a 9. Os bioensaios mostraram que três isolados (C14, CG47 e CG97) foram altamente patogênicos para fêmeas ingurgitadas de B. microplus sendo tão virulentos quanto o isolado E6, previamente analisado, causando cerca de 90-100% de mortalidade ao 4o dia de infecção. Outros isolados foram menos virulentos ou não mostraram virulência para o carrapato. A presença de dsRNA foi avaliada em 28 isolados e detectada em 21 isolados. Vários padrões de dsRNA foram observados baseados no tamanho molecular analisado por eletroforese em gel de agarose. Nenhuma correlação foi observada entre a presença de dsRNA e a virulência do fungo. As observações microscópicas evidenciaram que o fungo M. anisopliae isolado E6 invade seu hospedeiro por penetração direta da cutícula, sendo que este processo envolveu as etapas de adesão e germinação dos conídios, formação do apressório e penetração do fungo na cutícula do hospedeiro. A adesão e germinação dos conídios na superfície da cutícula se iniciou após 24 h de infecção. Neste mesmo tempo, ocorreu diferenciação do apressório, estrutura que exerce a pressão mecânica durante o processo de penetração, sendo que este processo é facilitado pela ação de enzimas hidrolíticas secretadas pelo fungo. A penetração de algumas hifas ocorreu até 24 h após a infecção do fungo, embora, neste mesmo tempo de infecção, a maioria dos conídios ainda estivesse em processo de germinação. A penetração em massa do fungo foi observada 72 h após a infecção e, após 96 h, as hifas emergiram na superfície da cutícula para originarem novos conídios e assegurarem a perpetuação do fungo. A intensa invasão das hifas nos tecidos adjacentes confirmou a eficácia do isolado E6 na infecção do carrapato B. microplus.

Produção e purificação de β-1,3 glicanases em Metarhizium anisopliae

Metarhizium anisopliae é um fungo cosmopolita com capacidade de infectar uma grande variedade de hospedeiros, estando entre eles o carrapato Boophilus microplus. A penetração de M. anisopliae em seus hospedeiros ocorre de forma ativa onde a cutícula constitui a principal barreira. A penetração é um processo multifatorial, porém, o emprego de pressão mecânica e a secreção de enzimas hidrolíticas parecem ser fundamentais para o seu sucesso. M. anisopliae, quando cultivado em meios com fontes de carbono que mimetizam a cutícula de seus hospedeiros, secreta enzimas como proteases, quitinases e lipases. Atualmente, o emprego de técnicas que identificam genes diferencialmente expressos (RDA) mostrou o possível envolvimento de outras enzimas, como as β-glicanases, durante o processo de penetração. A descoberta da ocorrência de modificações morfológicas como espessamento e perda da definição da parede celular nas extremidades das hifas que penetram na cutícula do carrapato sustentam ainda mais o possível envolvimento de enzimas que degradam as β-glicanas nas etapas iniciais da infecção. Neste trabalho, foi investigada a produção de β-1,3- glicanases pela linhagem E6 de M. anisopliae como também, buscou-se purificar as enzimas produzidas. A síntese e secreção de β-1,3-glicanases foram verificadas em meio contendo diferentes fontes de carbono sendo a secreção diferenciada dependendo da condição testada. A utilização de glicose em determinadas concentrações pareceu inibir a secreção enzimática. Duas das condições testadas, N-acetilglicosamina (NAG) 0,5% e parede celular de Rizoctonia solani 0,5%, foram utilizadas para a produção enzimática em larga escala. O sobrenadante dos cultivos em fermentador foi submetido ao processo de purificação que constou de três etapas: concentração por ultrafiltração com membrana de celulose regenerada, aplicação em coluna de troca iônica QSepharose Fast Flow e aplicação em coluna de filtração em gel Superdex 75. O emprego deste protocolo permitiu a purificação parcial de uma β-1,3-glicanase com aproximadamente 95kDa, secretada durante a fermentação em presença de parede celular de Rizoctonia solani, e de outra, com aparentemente a mesma massa molecular secretada em fermentação utilizando NAG 0,5% como fonte de carbono. Durante este trabalho, também foi confirmada a presença de pelo menos um gene que codifica uma exo-β-1,3-glicanase no genoma da linhagem E6 de M. anisopliae. Por fim, o estudo das β-1,3 glicanases em M. anisopliae é justificado pela importância destas enzimas em variados aspectos do desenvolvimento do fungo bem como, pelo seu possível envolvimento na infecção de hospedeiros.

Morphological description of Amblyomma brasiliense Aragão, 1908 (Acari: Ixodidae) larvae and nymphs

Fundação de Amparo à Pesquisa do Estado de São Paulo (FAPESP)

Mechanism of infection and colonization of Rhipicephalus sanguineus eggs by Mertarhizium anisopliae as revealed by scanning eletron microscopy and histopathology

O presente trabalho teve como objetivo verificar a forma de penetração do fungo Metarhizium anisopliae em ovos do carrapato Rhipicephalus sanguineus, assim como as lesões infringidas no interior do ovo. A aderência e penetração do fungo foram estudadas por meio da microscopia eletrônica de varredura e a ação do fungo nos tecidos internos avaliada em secções histológicas convencionais. Para observação destes eventos, realizaram-se infecções experimentais em 11 grupos de ovos do R. sanguineus contendo 25 mg cada. Os ovos foram banhados durante 3 minutos, sob agitação manual, em suspensão com concentração de 10(8) conídios/mL. Nos grupos controle o banho foi realizado apenas no veículo da suspensão. Os ovos foram processados para análise histopatológica e microscopia eletrônica de varredura nos seguintes tempos após a infecção: 1 e 18h, e um, dois, três, quatro, cinco, seis, sete, nove e onze dias. Observou-se grande germinação de conídios em 67% dos ovos 18h após a inoculação e o fungo penetrou em 92,6% dos ovos 5 dias após a infecção. A extrusão do patógeno ocorreu em 87% dos ovos 7 dias após a infecção, chegando a 100% no 9º dia. Nas análises histopatológicas não foram observadas lesões dignas de nota, porem deve-se ressaltar que houve significativa redução (53,9%) na eclosão a partir dos ovos infectados.

Patogenicidade de isolados de Beauveria bassiana para ovos, larvas e ninfas ingurgitadas de Rhipicephalus sanguineus

Fundação de Amparo à Pesquisa do Estado de São Paulo (FAPESP)

Controle de larvas de Boophilus microplus por Metarhizium anisopliae em pastagens infestadas artificialmente

Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior (CAPES)

Eventos externos e internos da infecção de larvas e ninfas de Rhipicephalus sanguineus por Metarhizium anisopliae

Examinaram-se a adesão, a germinação, a penetração e a colonização de larvas e ninfas de Rhipicephalus sanguineus por Metarhizium anisopliae, assim como as lesões infringidas pelo fungo nas respectivas fases do ciclo de vida do ácaro. Realizaram-se infecções experimentais em 11 grupos contendo 250 larvas e 11 grupos contendo 75 ninfas de R. sanguineus, por meio de banho, durante três minutos sob agitação manual, em suspensão contendo 10(8) conídios/ml do fungo. Nos grupos-controles, o banho foi realizado usando o veículo da suspensão. Larvas e ninfas foram processadas para um estudo histopatológico e de microscopia eletrônica de varredura nos seguintes tempos após a infecção: uma e 18 horas, e um, dois, três, quatro, cinco, seis, sete, nove e 11 dias. A germinação dos conídios ocorreu em até 18 horas pós-inoculação, e o fungo penetrou nas larvas e ninfas através do tegumento, dois e três dias após a infecção, respectivamente. Após penetração, o fungo invadiu o corpo das larvas e ninfas, promovendo uma colonização difusa, sem preferência aparente por tecidos específicos. Lesões significativas não foram observadas. A morte das larvas e ninfas ocorreu no terceiro e quarto dias pós-infecção, e a esporulação do patógeno sobre o cadáver foi iniciada no sexto dia pós-infecção.

QualiAB: desenvolvimento e validação de uma metodologia de avaliação de serviços de atenção básica

Este artigo apresenta o desenvolvimento, validação e utilização de uma metodologia de avaliação da qualidade dos serviços de atenção primária do Sistema Único de Saúde (SUS), o Questionário de Avaliação da Qualidade de Serviços de Atenção Básica (QualiAB). Destina-se aos serviços de atenção básica, organizados segundo diferentes modelos de atenção, incluindo a Saúde da Família. Contém 50 indicadores sobre oferta e organização do trabalho assistencial e programático e 15 sobre gerenciamento, na forma de questões de múltipla escolha, autorespondidas via web pela equipe local do serviço. Confere a cada resposta valor zero, um ou dois; a média geral atribui ao serviço um grau de qualidade expresso pela distância do melhor padrão correspondente à média dois. Foi construído por processo de consenso interativo, que incluiu metodologias qualitativas, teste-piloto, aplicação em 127 serviços, validação de construto e confiabilidade. Respondido, em 2007, por 598 (92%) dos serviços de 115 municípios paulistas, mostrou bom poder para discriminar níveis de qualidade. Adotado em 2010 como parte de um programa de apoio à Atenção Básica da Secretaria de Estado da Saúde de São Paulo, foi respondido por 95% (2.735) dos serviços de 586 municípios (90,8% do Estado). Os resultados foram encaminhados aos municípios. O QualiAB fornece uma avaliação válida, simples e com a possibilidade de retorno imediato para gerentes e profissionais. Mostrou factibilidade, aceitabilidade, bom poder de discriminação e utilidade para auxiliar a gestão da rede de atenção básica do SUS em São Paulo. A experiência indica aplicabilidade nas redes de atenção básica do Brasil.

Cytogenetic analysis of five Hypostomus species (Siluriformes, Loricariidae)

Fundação de Amparo à Pesquisa do Estado de São Paulo (FAPESP)

Esterase profile in the postembryonic development of Rhipicephalusmicroplus

Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior (CAPES)

In vitro activity of Artemisia annua L (Asteraceae) extracts against Rhipicephalus (Boophilus) microplus

A atividade de extratos vegetais sobre parasitas pode indicar grupos de substâncias de uso potencial no controle de Rhipicephalus (Boophilus) microplus. O objetivo do presente estudo foi investigar a ação in vitro de extratos de Artemisia annua sobre esta espécie. A concentração das lactonas sesquiterpênicas artemisinina e deoxiartemisinina presentes nos extratos vegetais, foi quantificada via cromatografia líquida de alta eficiência. Quatro extratos produzidos a partir do extrato bruto concentrado (EBC) foram avaliados sobre larvas pela metodologia do papel impregnado, com leitura após 24 horas de incubação. As fêmeas ingurgitadas foram imersas por cinco minutos no EBC e nos seus quatro extratos derivados, e incubadas para posterior análise dos parâmetros biológicos. Os extratos não tiveram eficácia sobre as larvas nas concentrações avaliadas (de 3,1 a 50 mg.mL-1). O EBC apresentou melhor eficácia sobre as fêmeas ingurgitadas (CE 50 de 130,6 mg.mL-1 e CE 90 de 302,9 mg.mL-1) que os extratos derivados. Esses resultados tendem a confirmar que a ação da artemisinina sobre as fêmeas ingurgitadas de R. (B.) microplus estaria condicionada à sua ingestão através do sangue. Nesse caso, os métodos in vitro seriam inadequados para a efetiva avaliação da ação de A. annua R.(B.) microplus.

Amblyomma calcaratum parasitando tamanduá-bandeira (Myrmecophaga tridactyla) em São Paulo

Ocurrence of Amblyomma calcaratum parasitizing giant anteater (Myrmecophaga tridactyla) is described in the State of São Paulo, Brazil.

Soroprevalência de Borrelia burgdorferi latu sensu associada à presença de carrapatos em cães de áreas rurais do Estado do Rio de Janeiro, Brasil

Pesquisou-se a presença de anticorpos contra Borrelia burgdorferi latu sensu em cães de áreas rurais de sete municípios do Estado do Rio de Janeiro, pelo ensaio imunoenzimático indireto, associando-se os resultados com a presença de carrapatos nestes animais. de 199 cães examinados, 15,58% estavam positivos, com títulos que variaram de 400 (13,57%) a 1600 (0,5%). Os casos positivos se distribuíram uniformemente nos sete municípios. Não houve diferença estatística (P > 0,05) de soropositivos entre as faixas etárias dos cães acima de seis meses. Carrapatos foram encontrados e coletados em 71 (35,68%) cães, dos quais 24,1% estavam infestados com Amblyomma cajennense, 13,6% com Rhipicephalus sanguineus, 2,5% com Amblyomma aureolatum e 1,5% com Amblyomma ovale. Dos animais soropositivos para B. burgdorferi, 38,7% apresentavam A. cajennense e 22,6% apresentavam R. sanguineus, não havendo, entretanto, correlação positiva entre a presença do carrapato e sorologia positiva.

Análise de fatores genéticos e ambientais que afetam a infestação de fêmeas bovinas da raça Caracu por carrapatos (Boophilus microplus)

Este trabalho foi conduzido com o objetivo de avaliar o efeito de fatores de meio sobre a infestação de bovinos Caracu pelo carrapato Boophilus microplus (Canestrini, 1887) e estimar parâmetros genéticos do grau de infestação por esse ectoparasita. Foram realizadas contagens em fêmeas de dois rebanhos, nas quatro estações, por dois anos consecutivos (setembro/1998 a julho/2000). Contou-se o número de carrapatos (NC) em um dos lados do animal e atribuiu-se escore visual (EC) de acordo com a quantidade de carrapatos no animal. Foram feitas de uma a oito avaliações, totalizando-se 4.079 e 3.994 observações de NC e EC, respectivamente, em 718 animais. Os dados foram analisados pelo método dos quadrados mínimos com um modelo que incluiu efeitos de rebanho (R), cor do animal (C), R x C, animal dentro de R x C como erro a, ano e estação da avaliação, espessura de pelame e idade do animal como covariável. As estimativas dos componentes de variância foram obtidas pelo método da máxima verossimilhança restrita livre de derivadas, utilizando-se um modelo que incluiu os efeitos fixos de grupo de contemporâneos (fazenda-ano-época), espessura do pelame e idade do animal como covariável e os efeitos aleatórios aditivos diretos e de ambiente permanente. Antes das análises, a variável NC foi transformada para log10 (n + 1) e EC para (x + 0,5)½, em que n é o número de carrapatos contados no animal e x, o escore (0 a 4). A incidência de carrapatos foi maior no verão e, quanto maior a espessura do pelame, maior o nível de infestação. As estimativas de herdabilidade e repetibilidade foram, respectivamente, 0,22 e 0,29 para NC e 0,15 e 0,21 para EC; a correlação genética entre NC e EC foi igual a 1,00. Os resultados sugerem que é possível obter progresso genético para resistência a carrapato pela seleção.