Impact of antibiotic use on carbapenem resistance in Pseudomonas aeruginosa: is there a role for antibiotic diversity?

In this study, we aimed to evaluate the relationship between the rates of resistance of Pseudomonas aeruginosa to carbapenems and the levels and diversity of antibiotic consumption. Data were retrospectively collected from 20 acute care hospitals across 3 regions of Switzerland between 2006 and 2010. The main outcome of the present study was the rate of resistance to carbapenems among P. aeruginosa. Putative predictors included the total antibiotic consumption and carbapenem consumption in defined daily doses per 100 bed days, the proportion of very broad-spectrum antibiotics used, and the Peterson index. The present study confirmed a correlation between carbapenem use and carbapenem resistance rates at the hospital and regional levels. The impact of diversifying the range of antibiotics used against P. aeruginosa resistance was suggested by (i) a positive correlation in multivariate analysis between the above-mentioned resistance and the proportion of consumed antibiotics having a very broad spectrum of activity (coefficient = 1.77; 95% confidence interval, 0.58 to 2.96; P < 0.01) and (ii) a negative correlation between the resistance and diversity of antibiotic use as measured by the Peterson homogeneity index (coefficient = -0.52; P < 0.05). We conclude that promoting heterogeneity plus parsimony in the use of antibiotics appears to be a valuable strategy for minimizing the spread of carbapenem resistance in P. aeruginosa in hospitals.

Characterisation and clinical features of Enterobacter cloacae bloodstream infections occurring at a tertiary care university hospital in Switzerland: is cefepime adequate therapy?

Despite many years of clinical experience with cefepime, data regarding the outcome of patients suffering from bloodstream infections (BSIs) due to Enterobacter cloacae (Ecl) are scarce. To address the gap in our knowledge, 57 Ecl responsible for 51 BSIs were analysed implementing phenotypic and molecular methods (microarrays, PCRs for bla and other genes, rep-PCR to analyse clonality). Only two E. cloacae (3.5%) were ESBL-producers, whereas 34 (59.6%) and 18 (31.6%) possessed inducible (Ind-Ecl) or derepressed (Der-Ecl) AmpC enzymes, respectively. All isolates were susceptible to imipenem, meropenem, gentamicin and ciprofloxacin. Der-Ecl were highly resistant to ceftazidime and piperacillin/tazobactam (both MIC₉₀≥256 μg/mL), whereas cefepime retained its activity (MIC₉₀ of 3 μg/mL). rep-PCR indicated that the isolates were sporadic, but Ecl collected from the same patients were indistinguishable. In particular, three BSIs initially due to Ind-Ecl evolved (under ceftriaxone or piperacillin/tazobactam treatment) into Der-Ecl because of mutations or a deletion in ampD or insertion of IS4321 in the promoter. These last two mechanisms have never been described in Ecl. Mortality was higher for BSIs due to Der-Ecl than Ind-Ecl (3.8% vs. 29.4%; P=0.028) and was associated with the Charlson co-morbidity index (P=0.046). Using the following directed treatments, patients with BSI showed a favourable treatment outcome: cefepime (16/18; 88.9%); carbapenems (12/13; 92.3%); ceftriaxone (4/7; 57.1%); piperacillin/tazobactam (5/7; 71.4%); and ciprofloxacin (6/6; 100%). Cefepime represents a safe therapeutic option and an alternative to carbapenems to treat BSIs due to Ecl when the prevalence of ESBL-producers is low.

Non-phenotypic tests to detect and characterize antibiotic resistance mechanisms in Enterobacteriaceae

In the past 2 decades, we have observed a rapid increase of infections due to multidrug-resistant Enterobacteriaceae. Regrettably, these isolates possess genes encoding for extended-spectrum β-lactamases (e.g., blaCTX-M, blaTEM, blaSHV) or plasmid-mediated AmpCs (e.g., blaCMY) that confer resistance to last-generation cephalosporins. Furthermore, other resistance traits against quinolones (e.g., mutations in gyrA and parC, qnr elements) and aminoglycosides (e.g., aminoglycosides modifying enzymes and 16S rRNA methylases) are also frequently co-associated. Even more concerning is the rapid increase of Enterobacteriaceae carrying genes conferring resistance to carbapenems (e.g., blaKPC, blaNDM). Therefore, the spread of these pathogens puts in peril our antibiotic options. Unfortunately, standard microbiological procedures require several days to isolate the responsible pathogen and to provide correct antimicrobial susceptibility test results. This delay impacts the rapid implementation of adequate antimicrobial treatment and infection control countermeasures. Thus, there is emerging interest in the early and more sensitive detection of resistance mechanisms. Modern non-phenotypic tests are promising in this respect, and hence, can influence both clinical outcome and healthcare costs. In this review, we present a summary of the most advanced methods (e.g., next-generation DNA sequencing, multiplex PCRs, real-time PCRs, microarrays, MALDI-TOF MS, and PCR/ESI MS) presently available for the rapid detection of antibiotic resistance genes in Enterobacteriaceae. Taking into account speed, manageability, accuracy, versatility, and costs, the possible settings of application (research, clinic, and epidemiology) of these methods and their superiority against standard phenotypic methods are discussed.

Detection, treatment, and prevention of carbapenemase-producing Enterobacteriaceae : Recommendations from an International Working Group

The prevalence of carbapenemase-producing Enterobacteriaceae (CPE) has increased during the past 10 years. Its detection is frequently difficult, because they do not always show a minimum inhibitory concentration (MIC) value for carbapenems in the resistance range. Both broth microdilution and agar dilution methods are more sensitive than disk diffusion method, Etest and automated systems. Studies on antimicrobial treatment are based on a limited number of patients; therefore, the optimal treatment is not well established. Combination therapy with two active drugs appears to be more effective than monotherapy. Combination of a carbapenem with another active agent — preferentially an aminoglycoside or colistin — could lower mortality provided that the MIC is #4 mg/l and probably #8 mg/l, and is administered in a higher-dose/prolonged-infusion regimen. An aggressive infection control and prevention strategy is recommended, including reinforcement of hand hygiene, using contact precautions and early detection of CPE through use of targeted surveillance.

Antibiotic resistance and phylogenetic characterization of Acinetobacter baumannii strains isolated from commercial raw meat in Switzerland.

The spread of antibiotic-resistant bacteria through food has become a major public health concern because some important human pathogens may be transferred via the food chain. Acinetobacter baumannii is one of the most life-threatening gram-negative pathogens; multidrug-resistant (MDR) clones of A. baumannii are spreading worldwide, causing outbreaks in hospitals. However, the role of raw meat as a reservoir of A. baumannii remains unexplored. In this study, we describe for the first time the antibiotic susceptibility and fingerprint (repetitive extragenic palindromic PCR [rep-PCR] profile and sequence types [STs]) of A. baumannii strains found in raw meat retailed in Switzerland. Our results indicate that A. baumannii was present in 62 (25.0%) of 248 (CI 95%: 19.7 to 30.9%) meat samples analyzed between November 2012 and May 2013, with those derived from poultry being the most contaminated (48.0% [CI 95%: 37.8 to 58.3%]). Thirty-nine strains were further tested for antibiotic susceptibility and clonality. Strains were frequently not susceptible (intermediate and/or resistant) to third- and fourth-generation cephalosporins for human use (i.e., ceftriaxone [65%], cefotaxime [32%], ceftazidime [5%], and cefepime [2.5%]). Resistance to piperacillin-tazobactam, ciprofloxacin, colistin, and tetracycline was sporadically observed (2.5, 2.5, 5, and 5%, respectively), whereas resistance to carbapenems was not found. The strains were genetically very diverse from each other and belonged to 29 different STs, forming 12 singletons and 6 clonal complexes (CCs), of which 3 were new (CC277, CC360, and CC347). RepPCR analysis further distinguished some strains of the same ST. Moreover, some A. baumannii strains from meat belonged to the clonal complexes CC32 and CC79, similar to the MDR isolates responsible for human infections. In conclusion, our findings suggest that raw meat represents a reservoir of MDR A. baumannii and may serve as a vector for the spread of these pathogens into both community and hospital settings.

Applicazione della spettrometria di massa MALDI-TOF in microbiologia clinica

Riassunto La spettrometria di massa (MS) nata negli anni ’70 trova oggi, grazie alla tecnologia Matrix-Assisted Laser Desorption Ionization-Time of Flight (MALDI-TOF), importanti applicazioni in diversi settori: biotecnologico (per la caratterizzazione ed il controllo di qualità di proteine ricombinanti ed altre macromolecole), medico–clinico (per la diagnosi di laboratorio di malattie e per lo sviluppo di nuovi trattamenti terapeutici mirati), alimentare ed ambientale. Negli ultimi anni, questa tecnologia è diventata un potente strumento anche per la diagnosi di laboratorio in microbiologia clinica, rivoluzionando il flusso di lavoro per una rapida identificazione di batteri e funghi, sostituendo l’identificazione fenotipica convenzionale basata su saggi biochimici. Attualmente mediante MALDI-TOF MS sono possibili due diversi approcci per la caratterizzazione dei microrganismi: (1) confronto degli spettri (“mass spectra”) con banche dati contenenti profili di riferimento (“database fingerprints”) e (2) “matching” di bio-marcatori con banche dati proteomiche (“proteome database”). Recentemente, la tecnologia MALDI-TOF, oltre alla sua applicazione classica nell’identificazione di microrganismi, è stata utilizzata per individuare, indirettamente, meccanismi di resistenza agli antibiotici. Primo scopo di questo studio è stato verificare e dimostrare l’efficacia identificativa della metodica MALDI-TOF MS mediante approccio di comparazione degli spettri di differenti microrganismi di interesse medico per i quali l’identificazione risultava impossibile a causa della completa assenza o presenza limitata, di spettri di riferimento all’interno della banca dati commerciale associata allo strumento. In particolare, tale scopo è stato raggiunto per i batteri appartenenti a spirochete del genere Borrelia e Leptospira, a miceti filamentosi (dermatofiti) e protozoi (Trichomonas vaginalis). Secondo scopo di questo studio è stato valutare il secondo approccio identificativo basato sulla ricerca di specifici marcatori per differenziare parassiti intestinali di interesse medico per i quali non è disponibile una banca dati commerciale di riferimento e la sua creazione risulterebbe particolarmente difficile e complessa, a causa della complessità del materiale biologico di partenza analizzato e del terreno di coltura nei quali questi protozoi sono isolati. Terzo ed ultimo scopo di questo studio è stata la valutazione dell’applicabilità della spettrometria di massa con tecnologia MALDI-TOF per lo studio delle resistenze batteriche ai carbapenemi. In particolare, è stato messo a punto un saggio di idrolisi dei carbapenemi rilevata mediante MALDI-TOF MS in grado di determinare indirettamente la produzione di carbapenemasi in Enterobacteriaceae. L’efficacia identificativa della metodica MALDI-TOF mediante l’approccio di comparazione degli spettri è stata dimostrata in primo luogo per batteri appartenenti al genere Borrelia. La banca dati commerciale dello strumento MALDI-TOF MS in uso presso il nostro laboratorio includeva solo 3 spettri di riferimento appartenenti alle specie B. burgdorferi ss, B. spielmani e B. garinii. L’implementazione del “database” con specie diverse da quelle già presenti ha permesso di colmare le lacune identificative dovute alla mancanza di spettri di riferimento di alcune tra le specie di Borrelia più diffuse in Europa (B. afzelii) e nel mondo (come ad esempio B. hermsii, e B. japonica). Inoltre l’implementazione con spettri derivanti da ceppi di riferimento di specie già presenti nel “database” ha ulteriormente migliorato l’efficacia identificativa del sistema. Come atteso, il ceppo di isolamento clinico di B. lusitaniae (specie non presente nel “database”) è stato identificato solo a livello di genere corroborando, grazie all’assenza di mis-identificazione, la robustezza della “nuova” banca dati. I risultati ottenuti analizzando i profili proteici di ceppi di Borrelia spp. di isolamento clinico, dopo integrazione del “database” commerciale, indicano che la tecnologia MALDI-TOF potrebbe essere utilizzata come rapida, economica ed affidabile alternativa ai metodi attualmente utilizzati per identificare ceppi appartenenti a questo genere. Analogamente, per il genere Leptospira dopo la creazione ex-novo della banca dati “home-made”, costruita con i 20 spettri derivati dai 20 ceppi di riferimento utilizzati, è stata ottenuta una corretta identificazione a livello di specie degli stessi ceppi ri-analizzati in un esperimento indipendente condotto in doppio cieco. Il dendrogramma costruito con i 20 MSP-Spectra implementati nella banca dati è formato da due rami principali: il primo formato dalla specie non patogena L. biflexa e dalla specie a patogenicità intermedia L. fainei ed il secondo che raggruppa insieme le specie patogene L. interrogans, L. kirschneri, L. noguchii e L. borgpetersenii. Il secondo gruppo è ulteriormente suddiviso in due rami, contenenti rispettivamente L. borgpetersenii in uno e L. interrogans, L. kirschneri e L. noguchii nell’altro. Quest’ultimo, a sua volta, è suddiviso in due rami ulteriori: il primo comprendente la sola specie L. noguchii, il secondo le specie L. interrogans e L. kirshneri non separabili tra loro. Inoltre, il dendrogramma costruito con gli MSP-Spectra dei ceppi appartenenti ai generi Borrelia e Leptospira acquisiti in questo studio, e appartenenti al genere Brachyspira (implementati in un lavoro precedentemente condotto) mostra tre gruppi principali separati tra loro, uno per ogni genere, escludendo possibili mis-identificazioni tra i 3 differenti generi di spirochete. Un’analisi più approfondita dei profili proteici ottenuti dall’analisi ha mostrato piccole differenze per ceppi della stessa specie probabilmente dovute ai diversi pattern proteici dei distinti sierotipi, come confermato dalla successiva analisi statistica, che ha evidenziato picchi sierotipo-specifici. È stato, infatti, possibile mediante la creazione di un modello statistico dedicato ottenere un “pattern” di picchi discriminanti in grado di differenziare a livello di sierotipo sia i ceppi di L. interrogans sia i ceppi di L. borgpetersenii saggiati, rispettivamente. Tuttavia, non possiamo concludere che i picchi discriminanti da noi riportati siano universalmente in grado di identificare il sierotipo dei ceppi di L. interrogans ed L. borgpetersenii; i picchi trovati, infatti, sono il risultato di un’analisi condotta su uno specifico pannello di sierotipi. È stato quindi dimostrato che attuando piccoli cambiamenti nei parametri standardizzati come l’utilizzo di un modello statistico e di un programma dedicato applicato nella routine diagnostica è possibile utilizzare la spettrometria di massa MALDI-TOF per una rapida ed economica identificazione anche a livello di sierotipo. Questo può significativamente migliorare gli approcci correntemente utilizzati per monitorare l’insorgenza di focolai epidemici e per la sorveglianza degli agenti patogeni. Analogamente a quanto dimostrato per Borrelia e Leptospira, l’implementazione della banca dati dello spettrometro di massa con spettri di riferimento di miceti filamentosi (dermatofiti) si è rilevata di particolare importanza non solo per l’identificazione di tutte le specie circolanti nella nostra area ma anche per l’identificazione di specie la cui frequenza nel nostro Paese è in aumento a causa dei flussi migratori dalla zone endemiche (M. audouinii, T. violaceum e T. sudanense). Inoltre, l’aggiornamento del “database” ha consentito di superare la mis-identificazione dei ceppi appartenenti al complesso T. mentagrophytes (T. interdigitale e T. mentagrophytes) con T. tonsurans, riscontrata prima dell’implementazione della banca dati commerciale. Il dendrogramma ottenuto dai 24 spettri implementati appartenenti a 13 specie di dermatofiti ha rivelato raggruppamenti che riflettono quelli costruiti su base filogenetica. Sulla base dei risultati ottenuti mediante sequenziamento della porzione della regione ITS del genoma fungino non è stato possibile distinguere T. interdigitale e T. mentagrophytes, conseguentemente anche gli spettri di queste due specie presentavano picchi dello stesso peso molecoalre. Da sottolineare che il dendrogramma costruito con i 12 profili proteici già inclusi nel database commerciale e con i 24 inseriti nel nuovo database non riproduce l’albero filogenetico per alcune specie del genere Tricophyton: gli spettri MSP già presenti nel database e quelli aggiunti delle specie T. interdigitale e T. mentagrophytes raggruppano separatamente. Questo potrebbe spiegare le mis-identificazioni di T. interdigitale e T. mentagrophytes con T. tonsurans ottenute prima dell’implementazione del database. L’efficacia del sistema identificativo MALDI-TOF è stata anche dimostrata per microrganismi diversi da batteri e funghi per i quali la metodica originale è stata sviluppata. Sebbene tale sistema identificativo sia stato applicato con successo a Trichomonas vaginalis è stato necessario apportare modifiche nei parametri standard previsti per l’identificazione di batteri e funghi. Le interferenze riscontrate tra i profili proteici ottenuti per i due terreni utilizzati per la coltura di questo protozoo e per i ceppi di T. vaginalis hanno, infatti, reso necessario l’utilizzo di nuovi parametri per la creazione degli spettri di riferimento (MSP-Spectra). L’importanza dello sviluppo del nuovo metodo risiede nel fatto che è possibile identificare sulla base del profilo proteico (e non sulla base di singoli marcatori) microorganismi cresciuti su terreni complessi che potrebbero presentare picchi nell'intervallo di peso molecolare utilizzato a scopo identificativo: metaboliti, pigmenti e nutrienti presenti nel terreno possono interferire con il processo di cristallizzazione e portare ad un basso punteggio identificativo. Per T. vaginalis, in particolare, la “sottrazione” di picchi dovuti a molecole riconducibili al terreno di crescita utilizzato, è stata ottenuta escludendo dall'identificazione l'intervallo di peso molecolare compreso tra 3-6 kDa, permettendo la corretta identificazione di ceppi di isolamento clinico sulla base del profilo proteico. Tuttavia, l’elevata concentrazione di parassita richiesta (105 trofozoiti/ml) per una corretta identificazione, difficilmente ottenibile in vivo, ha impedito l’identificazione di ceppi di T. vaginalis direttamente in campioni clinici. L’approccio identificativo mediante individuazione di specifici marcatori proteici (secondo approccio identificativo) è stato provato ed adottato in questo studio per l’identificazione e la differenziazione di ceppi di Entamoeba histolytica (ameba patogena) ed Entamoeba dispar (ameba non patogena), specie morfologiacamente identiche e distinguibili solo mediante saggi molecolari (PCR) aventi come bersaglio il DNA-18S, che codifica per l’RNA della subunità ribosomiale minore. Lo sviluppo di tale applicazione ha consentito di superare l’impossibilità della creazione di una banca dati dedicata, a causa della complessità del materiale fecale di partenza e del terreno di coltura impiagato per l’isolamento, e di identificare 5 picchi proteici in grado di differenziare E. histolytica da E. dispar. In particolare, l’analisi statistica ha mostrato 2 picchi specifici per E. histolytica e 3 picchi specifici per E. dispar. L’assenza dei 5 picchi discriminanti trovati per E. histolytica e E. dispar nei profili dei 3 differenti terreni di coltura utilizzati in questo studio (terreno axenico LYI-S-2 e terreno di Robinson con e senza E. coli) permettono di considerare questi picchi buoni marcatori in grado di differenziare le due specie. La corrispondenza dei picchi con il PM di due specifiche proteine di E. histolytica depositate in letteratura (Amoebapore A e un “unknown putative protein” di E. histolytica ceppo di riferimento HM-1:IMSS-A) conferma la specificità dei picchi di E. histolytica identificati mediante analisi MALDI-TOF MS. Lo stesso riscontro non è stato possibile per i picchi di E. dispar in quanto nessuna proteina del PM di interesse è presente in GenBank. Tuttavia, va ricordato che non tutte le proteine E. dispar sono state ad oggi caratterizzate e depositate in letteratura. I 5 marcatori hanno permesso di differenziare 12 dei 13 ceppi isolati da campioni di feci e cresciuti in terreno di Robinson confermando i risultati ottenuti mediante saggio di Real-Time PCR. Per un solo ceppo di isolamento clinico di E. histolytica l’identificazione, confermata mediante sequenziamento della porzione 18S-rDNA, non è stata ottenuta mediante sistema MALDI-TOF MS in quanto non sono stati trovati né i picchi corrispondenti a E. histolytica né i picchi corrispondenti a E. dispar. Per questo ceppo è possibile ipotizzare la presenza di mutazioni geno/fenotipiche a livello delle proteine individuate come marcatori specifici per E. histolytica. Per confermare questa ipotesi sarebbe necessario analizzare un numero maggiore di ceppi di isolamento clinico con analogo profilo proteico. L’analisi condotta a diversi tempi di incubazione del campione di feci positivo per E. histolytica ed E. dipar ha mostrato il ritrovamento dei 5 picchi discriminanti solo dopo 12 ore dall’inoculo del campione nel terreno iniziale di Robinson. Questo risultato suggerisce la possibile applicazione del sistema MALDI-TOF MS per identificare ceppi di isolamento clinico di E. histolytica ed E. dipar nonostante la presenza di materiale fecale che materialmente può disturbare e rendere difficile l’interpretazione dello spettro ottenuto mediante analisi MALDI-TOF MS. Infine in questo studio è stata valutata l’applicabilità della tecnologia MALDI-TOF MS come saggio fenotipico rapido per la determinazione di ceppi produttori di carbapenemasi, verificando l'avvenuta idrolisi del meropenem (carbapeneme di riferimento utilizzato in questo studio) a contatto con i ceppi di riferimento e ceppi di isolamento clinico potenzialmente produttori di carbapenemasi dopo la messa a punto di un protocollo analitico dedicato. Il saggio di idrolisi del meropenem mediante MALDI-TOF MS ha dimostrato la presenza o l’assenza indiretta di carbapenemasi nei 3 ceppi di riferimento e nei 1219 (1185 Enterobacteriaceae e 34 non-Enterobacteriaceae) ceppi di isolamento clinico inclusi nello studio. Nessuna interferenza è stata riscontrata per i ceppi di Enterobacteriaceae variamente resistenti ai tre carbapenemi ma risultati non produttori di carbapenemasi mediante i saggi fenotipici comunemente impiegati nella diagnostica routinaria di laboratorio: nessuna idrolisi del farmaco è stata infatti osservata al saggio di idrolisi mediante MALDI-TOF MS. In un solo caso (ceppo di K. pneumoniae N°1135) è stato ottenuto un profilo anomalo in quanto presenti sia i picchi del farmaco intatto che quelli del farmaco idrolizzato. Per questo ceppo resistente ai tre carbapenemi saggiati, negativo ai saggi fenotipici per la presenza di carbapenemasi, è stata dimostrata la presenza del gene blaKPC mediante Real-Time PCR. Per questo ceppo si può ipotizzare la presenza di mutazioni a carico del gene blaKPC che sebbene non interferiscano con il suo rilevamento mediante PCR (Real-Time PCR positiva), potrebbero condizionare l’attività della proteina prodotta (Saggio di Hodge modificato e Test di Sinergia negativi) riducendone la funzionalità come dimostrato, mediante analisi MALDI-TOF MS, dalla presenza dei picchi relativi sia all’idrolisi del farmaco sia dei picchi relativi al farmaco intatto. Questa ipotesi dovrebbe essere confermata mediante sequenziamento del gene blaKPC e successiva analisi strutturale della sequenza amminoacidica deducibile. L’utilizzo della tecnologia MALDI-TOF MS per la verifica dell’avvenuta idrolisi del maropenem è risultato un saggio fenotipico indiretto in grado di distinguere, al pari del test di Hodge modificato impiegato comunemente nella routine diagnostica in microbiologia, un ceppo produttore di carbapenemasi da un ceppo non produttore sia per scopi diagnostici che per la sorveglianza epidemiologica. L’impiego del MALDI-TOF MS ha mostrato, infatti, diversi vantaggi rispetto ai metodi convenzionali (Saggio di Hodge modificato e Test di Sinergia) impiegati nella routine diagnostica di laboratorio i quali richiedono personale esperto per l’interpretazione del risultato e lunghi tempi di esecuzione e di conseguenza di refertazione. La semplicità e la facilità richieste per la preparazione dei campioni e l’immediata acquisizione dei dati rendono questa tecnica un metodo accurato e rapido. Inoltre, il metodo risulta conveniente dal punto di vista economico, con un costo totale stimato di 1,00 euro per ceppo analizzato. Tutte queste considerazioni pongono questa metodologia in posizione centrale in ambito microbiologico anche nel caso del rilevamento di ceppi produttori di carbapenemasi. Indipendentemente dall’approccio identificativo utilizzato, comparato con i metodi convenzionali il MALDI-TOF MS conferisce in molti casi un guadagno in termini di tempo di lavoro tecnico (procedura pre-analititca per la preparazione dei campioni) e di tempo di ottenimento dei risultati (procedura analitica automatizzata). Questo risparmio di tempo si accentua quando sono analizzati in contemporanea un maggior numero di isolati. Inoltre, la semplicità e la facilità richieste per la preparazione dei campioni e l’immediata acquisizione dei dati rendono questo un metodo di identificazione accurato e rapido risultando più conveniente anche dal punto di vista economico, con un costo totale di 0,50 euro (materiale consumabile) per ceppo analizzato. I risultati ottenuti dimostrano che la spettrometria di massa MALDI-TOF sta diventando uno strumento importante in microbiologia clinica e sperimentale, data l’elevata efficacia identificativa, grazie alla disponibilità sia di nuove banche dati commerciali sia di aggiornamenti delle stesse da parte di diversi utenti, e la possibilità di rilevare con successo anche se in modo indiretto le antibiotico-resistenze.

Persistência de plasmídeos que codificam carbapenemases do tipo New-Delhi-Metalo-β-Lactamase

As metalo-β-lactamases (MBL) são capazes de hidrolisar os carbapenêmicos, a classe de antimicrobianos com maior potência para o tratamento de infecções graves e de maior uso clinico. Dentre as MBL, o grupo mais recentemente descrito e que apresentou rápida disseminação em todo o mundo é o da New-Delhi-Metalo- β-lactamases (NDM). Nas enterobactérias, os genes que codificam essas enzimas estão mais frequentemente localizados em plasmídeos. O estudo da estabilidade de plasmídeos que albergam o gene blaNDM-1 é importante para entender a predominância de espécies que carregam esses plasmídeos, desvendar mecanismos moleculares envolvidos na sua persistência e para desenvolver novas drogas que possam diminuir a sua persistência. Estudos recentes sobre estabilidade plasmidial evidenciaram que a maprotilina é capaz de induzir perda plasmidial de até 90% em E. coli K12. Neste trabalho, foi estudado o efeito da maprotilina na indução de cura de plasmídeos, que albergam o gene blaNDM-1, em diferentes espécies da família Enterobacteriaceae. Nove isolados pertencentes a diferentes espécies foram incluídas no estudo. Os plasmídeos foram caracterizados quanto ao seu tamanho por eletroforese e por sequenciamento de DNA no sistema Illumina. A persistência plasmidial foi determinada pelo método de contagem em placa em LB ágar com e sem tratamento com maprotilina em concentrações sub-inibitórias (50mg/L). O experimento foi conduzido por 10 dias, representando aproximadamente 100 gerações. Neste estudo evidenciou-se que o grupo das enterobactérias estão envolvidas na disseminação de plasmídeos com blaNDM-1, sendo que plasmídeos do grupo IncF estão mais relacionados a essa dispersão. A maprotilina teve efeito de cura plasmidial em todos os isolados exceto em E. hormaechei \"subsp. oharae\" e C. freundii. O isolado P. rettgeri apresentou maior taxa de perda plasmidial e a análise comparativa da sequência nucleotídica do plasmídeo indicou que a presença da IS5 pode estar relacionada com a diminuição da persistência plasmidial. Diferenças na persistência plasmidial, quando tratados com maprotilina, entre E. hormaechei \"subsp. steigerwaltii\" e E. hormaechei \"subsp. oharae\" sugerem que E. hormaechei \"subsp. oharae\" pode ser um possível disseminador de plasmídeos albergando blaNDM-1, devido a processos de adaptação co-evolutivos.

Enterobacteriaceae produtoras de carbapenemases : um novo desafio no controlo da infecção hospitalar

Trabalho Final do Curso de Mestrado Integrado em Medicina, Faculdade de Medicina, Universidade de Lisboa, 2014

Frequência de resistência a múltiplos fármacos em pseudomonas aeroginosa

A multirresistência bacteriana tem crescido significativamente nos últimos anos. Entre os gram negativos a P. aeruginosa demonstra facilidade de desenvolvimento de resistência aos antibióticos. O objetivo deste estudo foi determinar a frequência de resistência a múltiplos fármacos em isolados de Pseudomonas aeruginosa e detectar cepas multirresistentes em um hospital público de Maceió/AL. De forma retrospectiva, descritiva e transversal, entre janeiro de 2012 a dezembro de 2013, iniciou-se uma ampla análise documental dos registros de atendimento no setor de Microbiologia do Hospital Universitário Professor Alberto Antunes (HUPAA/UFAL) para avaliar o material obtido de pacientes que apresentaram cultura positiva para P. aeruginosa. Vários espécimes clínicos foram obtidos e as cepas identificadas fenotipicamente pelo método automatizado Vitek®, bem como as análises do perfil de susceptibilidade aos antimicrobianos, seguindo os critérios adotados pelo National Committee for Clinical and Laboratory Standards (NCCLS). Foram obtidas 78 culturas com isolados positivos para P. aeruginosa, sendo a maioria procedente de pacientes da UTI geral (47,4%), seguida da Clínica cirúrgica (16,7%). Entre as amostras clínicas analisadas, a secreção traqueal foi a de maior incidência com 25,6%, seguida de secreção de ferida (20,5%) e escarro (18%). O composto mais ativo contra a P. aeruginosa foi a Colistina (100,0%). Detectou-se elevada multirresistência de P. aeruginosa aos betalactâmicos, cefalosporinas e carbapenêmicos. Baseando-se nos dados apresentados, torna-se evidente a necessidade de um monitoramento rotineiro do perfil de sensibilidade desta bactéria em ambiente hospitalar, sendo de extrema utilidade para a escolha adequada na terapêutica empírica, proporcionando conhecimento prévio dos antimicrobianos que apresentam boa eficácia diante deste patógeno, favorecendo o uso racional de antimicrobianos. PALAVRAS-CHAVE: Multirresistência; Pseudomonas aeruginosa;Sensibilidade; Antimicrobianos.

Antibacterial dosing in intensive care: Pharmacokinetics, degree of disease and pharmacodynamics of sepsis

Treatment of sepsis remains a significant challenge with persisting high mortality and morbidity. Early and appropriate antibacterial therapy remains an important intervention for such patients. To optimise antibacterial therapy, the clinician must possess knowledge of the pharmacokinetic and pharmacodynamic properties of commonly used antibacterials and how these parameters may be affected by the constellation of pathophysiological changes occurring during sepsis. Sepsis, and the treatment thereof, increases renal preload and, via capillary permeability, leads to 'third-spacing', both resulting in higher antibacterial clearances. Alternatively, sepsis can induce multiple organ dysfunction, including renal and/or hepatic dysfunction, causing a decrease in antibacterial clearance. Aminoglycosides are concentration-dependent antibacterials and they display an increased volume of distribution (V-d) in sepsis, resulting in decreased peak serum concentrations. Reduced clearance from renal dysfunction would increase the likelihood of toxicity. Individualised dosing using extended interval dosing, which maximises the peak serum drug concentration (C-max)/minimum inhibitory concentration ratio is recommended. beta-Lactams and carbapenems are time-dependent antibacterials. An increase in Vd and renal clearance will require increased dosing or administration by continuous infusion. If renal impairment occurs a corresponding dose reduction may be required. Vancomycin displays predominantly time-dependent pharmacodynamic properties and probably requires higher than conventionally recommended doses because of an increased V-d and clearance during sepsis without organ dysfunction. However, optimal dosing regimens remain unresolved. The poor penetration of vancomycin into solid organs may require alternative therapies when sepsis involves solid organs (e.g. lung). Ciprofloxacin displays largely concentration-dependent kill characteristics, but also exerts some time-dependent effects. The V-d of ciprofloxacin is not altered with fluid shifts or over time, and thus no alterations of standard doses are required unless renal dysfunction occurs. In order to optimise antibacterial regimens in patients with sepsis, the pathophysiological effects of systemic inflammatory response syndrome need consideration, in conjunction with knowledge of the different kill characteristics of the various antibacterial classes. In conclusion, certain antibacterials can have a very high V-d, therefore leading to a low C-max and if a high peak is needed, then this would lead to underdosing. The Vd of certain antibacterials, namely aminoglycosides and vancomycin, changes over time, which means dosing may need to be altered over time. Some patients with serum creatinine values within the normal range can have very high drug clearances, thereby producing low serum drug levels and again leading to underdosing. Copyright © 2010 Elsevier Inc. All rights reserved.

The postantibiotic effect of the carbapenem antibiotics on gram-negative bacteria

Postantibiotic effect (PAE) describes the suppression of microbial growth occurring after a short exposure to an antimicrobial agent. PAE appears to be a property of the majority of antimicrobial agents and is demonstrated by a wide variety of microorganisms. At present, carbapenems and penems are the only members of the -lactam group of antimicrobial agents that exhibit a significant PAE on Gram-negative bacilli. A standardised method was developed to evaluate the in vitro PAE of three carbapenems; imipenem, meropenem and biapenem on Gram-negative bacteria under reproducible laboratory conditions that partially mimicked those occurring in vivo. The effects on carbapenem PAE of the method of antimicrobial removal, concentration, exposure duration, inoculum size, inoculum growth phase, multiple exposures and pooled human serum were determined. Additionally, the reproducibility, susceptibility prior to and after PAE determination and inter-strain variation of carbapenem PAE were evaluated. The method developed determined PAE by utilising viable counts and demonstrated carbapenem PAE to be reproducible, constant over successive exposures, dependent on genera, concentration, duration of exposure, inoculum size and growth phase. In addition, carbapenem PAE was not significantly effected either by agitation, the antimicrobial removal method or the viable count diluent. At present, the mechanism underlying PAE is undetermined. It is thought to be due to either the prolonged persistence of the antimicrobial at the cellular site of action or the true recovery period from non-lethal damage. Increasing the L-lysine concentration and salinity at recovery decreased and increased the carbapenem and imipenem PAE of Pseudomonas aeruginosa, respectively. In addition, no apparent change was observed in the production of virulence factors by P.aeruginosa in PAE phase. However, alterations in cell morphology were observed throughout PAE phase, and the reappearance of normal cell morphology corresponded to the duration of PAE determined by viable count. Thus, the recovery of the penicillin binding protein target enzymes appears to be the mechanism behind carbapenem PAE in P. aeruginosa.

Studies of the nature of Burkholderia cepacia in cystic fibrosis

Burkholderia cepacia is an opportunistic pathogen that colonises of the lungs of cystic fibrosis (CF) patients, with a frequently fatal outcome. Antibiotic resistance is common and highly transmissible epidemic strains have been described in the UK. 37 B. cepacia isolates from clinical and botanical sources were characterised via metabolic capabilities, antibiotic sensitivity, fatty acid methyl ester (FAME) profiles restriction digest analysis of chromosomal DNA by pulsed-gel electrophoresis (PFGE) (with the use of two separate restriction enzymes) and outer membrane protein (OMP) profiles. This revealed isolates of the UK CF epidemic strain to form a distinct group with a specific OMP profile. Cluster analysis of PFGE and FAME profiles revealed the species Burkholderia gladioli and Burkholderia vietnamiensis to be more closely related to each other and to laboratory strains of B. cepacia than to the CF epidemic strain considered a member of the latter species. The epidemic strain of B. cepacia may therefore be worthy of species definition in its own right. All the strains studied showed a high level of resistance to antibiotics, including the carbapenems. Considering this, carbapenemase production by isolates of B. cepacia was investigated. A metallo-β-lactamase from a clinical strain of B. cepacia was isolated and partially purified of using Cibacron blue F3GA-coupled agarose. The resulting preparation showed a single band of β-lactamase activity (pI 8.45) after analytical isoelectric focusing. The enzyme was particularly effective in the hydrolysis of imipenem. Meropenem, biapenem, cephaloridine, ceftazidime, benzylpenicillin, ampicillin and carbenicillin were hydrolysed at a lower rate. An unusual inhibition profile was noted. Inhibition by the metal ion chelators ethylene diamine tetra acetic acid and o-phenanthroline was reversed by addition of zinc, indicating a metallo-enzyme, whilst >90% inhibition was attainable with 0.1mM concentrations of tazobactam and clavulanic acid. A study of 8 other clinical isolates showed an enzyme of pI 8.45 to be present and inducible by imipenem in each case. This enzyme was assigned PCM-I (Pseudomonas cepacia metalloenzyme I).

Characterization of the poxAB Operon Encoding a Class D Carbapenemase in Pseudomonas aeruginosa,

Pseudomonas aeruginosa is a dreaded opportunistic pathogen that causes severe and often intractable infections in immunocompromised and critically ill patients. This bacterium is also the primary cause of fatal lung infections in patients with cystic fibrosis and a leading nosocomial pathogen responsible for nearly 10% of all hospital-acquired infections. P. aeruginosa is intrinsically recalcitrant to most classes of antibiotics and has the ability to acquire additional resistance during treatment. In particular, resistance to the widely used β-lactam antibiotics is frequently mediated by the expression of AmpC, a chromosomally encoded β-lactamase that is ubiquitously found in P. aeruginosa strains. This dissertation delved into the role of a recently reported chromosomal β-lactamase in P. aeruginosa called PoxB. To date, no detailed studies have addressed the regulation of poxB expression and its contribution to β-lactam resistance in P. aeruginosa. In an effort to better understand the role of this β-lactamase, poxB was deleted from the chromosome and expressed in trans from an IPTG-inducible promoter. The loss of poxB did not affect susceptibility. However, expression in trans in the absence of ampC rendered strains more resistant to the carbapenem β-lactams. The carbapenem-hydrolyzing phenotype was enhanced, reaching intermediate and resistant clinical breakpoints, in the absence of the carbapenem-specific outer membrane porin OprD. As observed for most class D β-lactamases, PoxB was only weakly inhibited by the currently available β-lactamase inhibitors. Moreover, poxB was shown to form an operon with the upstream located poxA, whose expression in trans decreased pox promoter (Ppox) activity suggesting autoregulation. The transcriptional regulator AmpR negatively controlled Ppox activity, however no direct interaction could be demonstrated. A mariner transposon library identified genes involved in the transport of polyamines as potential regulators of pox expression. Unexpectedly, polyamines themselves were able induce resistance to carbapenems. In summary, P. aeruginosa carries a chromosomal-encoded β-lactamase PoxB that can provide resistance against the clinically relevant carbapenems despite its narrow spectrum of hydrolysis and whose activity in vivo may be regulated by polyamines.

Infecções por enterobacteriaceae resistente aos carbapenêmicos em hospital de ensino: epidemiologia e caracterização molecular

Introduction: The production of KPC (Klebsiella pneumoniae carbapenemase) has become an important mechanism of carbapenem-resistance among Enterobacteriaceae strains. In Brazil, KPC is already widespread and its incidence has increased significantly, reducing treatment options. The “perfect storm” combination of the absence of new drug developmentand the emergence of multidrug-resistant strains resulted in the need for the use of older drugs, with greater toxicity, such as polymyxins. Aims: To determine the occurrence of carbapenemase-producing strains in carbapenem-resistant Enterobacteriaceae isolated from patients with nosocomial infection/colonization during September/2014 to August/2015, to determine the risk factors associated with 30-day- mortality and the impact of inappropriate therapy. Materials and Methods: We performed a case control study to assess the risk factors (comorbidities, invasive procedures and inappropriate antimicrobial therapy) associated with 30-day-mortality, considering the first episode of infection in 111 patients. The resistance genes blaKPC, blaIMP, blaVIM and blaNDM-1 were detected by polymerase chain reaction technique. Molecular typing of the strains involved in the outbreak was performed by pulsed field gel electrophoresis technique. The polymyxin resistance was confirmed by the microdilution broth method. Results: 188 episodes of carbapenem-resistant Enterobacteriaceae infections/colonizations were detected; of these, 122 strains were recovered from the hospital laboratory. The presence of blaKPC gene were confirmed in the majority (74.59%) of these isolates. It was not found the presence of blaIMP , blaVIM and blaNDM-1 genes. K. pneumoniae was the most frequent microorganism (77,13%), primarily responsible for urinary tract infections (21,38%) and infections from patients of the Intensive Care Unit (ICU) (61,38%). Multivariate statistical analysis showed as predictors independently associated with mortality: dialysis and bloodstream infection. The Kaplan-Meier curve showed a lower probability of survival in the group of patients receiving antibiotic therapy inappropriately. Antimicrobial use in adult ICU varied during the study period, but positive correlation between increased incidence of strains and the consumption was not observed. In May and July 2015, the occurrence rates of carbapenem-resistant Enterobacteriaceae KPC-producing per 1000 patient-days were higher than the control limit established, confirming two outbreaks, the first caused by colistin-susceptible KPC-producing K. pneumoniae isolates, with a polyclonal profile and the second by a dominant clone of colistin-resistant (≥ 32 μg/mL) KPC-producing K. pneumoniae. The cross transmission between patients became clear by the temporal and spatial relationships observed in the second outbreak, since some patients occupied the same bed, showing problems in hand hygiene adherence among healthcare workers and inadequate terminal disinfection of environment. The outbreak was contained when the ICU was closed to new admissions. Conclusions: The study showed an endemicity of K. pneumoniae KPC-producing in adult ICU, progressing to an epidemic monoclonal expansion, resulted by a very high antibiotic consumption of carbapenems and polymyxins and facilitated by failures in control measures the unit.

Antimicrobial susceptibility of Pseudomonas aeruginosa isolated from cystic fibrosis patients through Northern Europe

Pseudomonas aeruginosa is a major cause of morbidity and mortality in cystic fibrosis patients. This study compares the antimicrobial susceptibility of 153 P. aeruginosa isolates from the United Kingdom (UK) (n=58), Belgium (n=44), and Germany (n=51) collected from 120 patients during routine visits over the 2006-2012 period. MICs were measured by broth microdilution. Genes encoding extended spectrum β-lactamases (ESBL), metallo-β-lactamases and carbapenemases were detected by PCR. Pulsed Field Gel Electrophoresis and Multi-Locus Sequence Typing were performed on isolates resistant to ≥ 3 antibiotic classes among penicillins/cephalosporins, carbapenems, fluoroquinolones, aminoglycosides, polymyxins. Based on EUCAST/CLSI breakpoints, susceptibility was ≤ 30%/≤ 40% (penicillins, ceftazidime, amikacin, ciprofloxacin), 44-48%/48-63% (carbapenems), 72%/72% (tobramycin), and 92%/78% (colistin) independently of patient's age. Sixty percent of strains were multidrug resistant (MDR; European Centre for Disease prevention and Control criteria). Genes encoding ESBL (most prevalent BEL, PER, GES, VEB, CTX-M, TEM, SHV, and OXA), metallo β-lactamases (VIM, IMP, NDM), or carbapenemases (OXA-48, KPC) were not detected. The Liverpool Epidemic Strain (LES) was prevalent in UK isolates only (75% of MDR isolates). Four MDR ST958 isolates were found spread over the three countries. The other MDR clones were evidenced in ≤ 3 isolates and localized in a single country. A new sequence type (ST2254) was discovered in one MDR isolate in Germany. Clonal and non-clonal isolates with different susceptibility profiles were found in 21 patients. Thus, resistance and MDR are highly prevalent in routine isolates from 3 countries, with carbapenem (meropenem), tobramycin and colistin remaining the most active drugs.