Transformação genética em cevada por bombardeamento de partículas

A presente Tese de Doutorado objetivou: (1) definir um método eficiente de transformação genética, por bombardeamento de partículas, para a obtenção de plantas transgênicas de cultivares brasileiras de cevada e (2) identificar gene(s) codificante(s) de quitinase(s) potencialmente capaz(es) de conferir resistência ao fungo patogênico de cevada Bipolaris sorokiniana. Culturas de calos obtidos a partir de escutelos imaturos das cultivares Brasileiras de cevada MN-599 e MN-698 (Cia. de Bebidas das Américas, AMBEV) foram bombardeadas com partículas de tungstênio e avaliadas quanto à expressão do gene repórter gusA através de ensaios histoquímicos de GUS e quanto ao efeito dos bombardeamentos na indução estruturas embriogênicas e regeneração de plantas. As condições de biobalística analisadas incluíram a região promotora regulando a expressão de gusA, tipo e pressão de gás hélio de dois aparelhos de bombardeamento, distância de migração das partículas, número de tiros e a realização de pré e pós-tratamento osmótico dos tecidos-alvo. No presente trabalho foram obtidos um número bastante alto de pontos azuis por calo, a indução de calos embriogênicos e embriões somáticos em uma freqüência de até 58,3% e a regeneração de 60 plantas, sendo 43 de calos bombardeados. As melhores condições observadas foram o promotor e primeiro íntron do gene Adh de milho (plasmídeo pNGI), o aparelho de bombardeamento “ Particle Inflow Gun” (PIG) utilizando-se a distância de migração de partículas de 14,8 cm, dois tiros disparados por placa e a realização de tratamento osmótico dos explantes com 0,2 M de manitol e 0,2 M de sorbitol 4-5 horas antes e 17-19 horas depois dos bombardeamentos. Das 43 plantas obtidas de calos bombardeadas, 3 apresentaram atividade de GUS na base das suas folhas. A utilização de primers sintéticos definidos a partir de genes de quitinases descritos na literatura em PCRs resultou na amplificação de dois fragmentos de aproximadamente 700 e 500 pb a partir de DNA total das cvs. MN-599 e MN-698 de cevada e um fragmento, com aproximadamente 500 pb, a partir do DNA total do isolado A4c de Trichoderma sp. Estes fragmentos foram purificados dos géis de agarose e diretamente seqüenciados de forma manual e automática. Os fragmentos de 700 e 500 pb amplificados do genoma da cultivar MN-599 foram identificados como genes de quitinases de cevada e o fragmento de 500 pb do isolado A4c de Trichoderma sp. não apresentou homologia com seqüências conhecidas de quitinases depositadas no EMBL/GenBank. A utilização de novos pares de primers, representando seqüências conservadas de quitinases do fungo Metarhizium anisopliae, resultou na amplificação de 3 fragmentos a partir do DNA total do isolado A4b de Trichoderma sp., que estão sendo purificados para realização de seqüenciamento.

Caracterização da mutagênese por inserção do retrotransposon Tos17 em genótipos de arroz

O aumento do potencial produtivo da cultura de arroz via melhoramento genético está principalmente relacionado ao rendimento, a qualidade de grãos e a obtenção de plantas resistentes a doenças e pragas. Neste caso, deve ser explorada a variabilidade genética natural ou induzida através de agentes mutagênicos físicos, químicos ou biológicos. A vantagem do uso de mutagênicos biológicos, como os transposons e os retrotransposons, é que ao serem inseridos podem interrompem um gene causando uma mutação. Esta retrotransposição deixa uma marca que possibilita a identificação molecular do local de inserção. No presente trabalho, foi utilizada a estratégia de mutagênese insercional através de eventos de transposição do retrotransposon Tos17, induzido por cultura in vitro. A análise de diferentes genótipos de arroz é muito importante para avaliar se a transposição ocorre de forma similar em genótipos distintos. Foram avaliados calos embriogênicos de cultivares que têm um histórico de variabilidade genética em homozigose, linhagens obtidas através de cruzamentos com espécies silvestres e ecótipos de arroz vermelho, submetidos a 6 meses de cultura in vitro. O método escolhido para avaliar o número de cópias de Tos17 em calos embriogênicos foi a quantificação relativa por PCR em tempo real. A identificação dos genes mutados pela inserção do retrotransposon foi feita através do isolamento e amplificação das seqüências que flanqueiam os insertos de Tos17. O resultado deste experimento indica um aumento no número de cópias de Tos17 em 8 dos 21 genótipos avaliados. O seqüenciamento dos fragmentos de DNA que flanqueiam os insertos do retrotransposon Tos17, indicaram alta similaridade com seqüências genômicas não codificantes de arroz.

Enraizamento de estacas de Camellia sinensis L. em função da época de coleta de ramos, genótipos e ácido indolbutírico

Fundação de Amparo à Pesquisa do Estado de São Paulo (FAPESP)

Calli induction in leaf explants of coffee elite genotypes

Visando a alcançar alta eficiência na indução de calos a partir de explantes foliares de plantas matrizes de C. arabica com alta heterozigose, por meio da embriogênese somática indireta, foram instalados três experimentos. O primeiro experimento foi conduzido em esquema fatorial 2x5, constituído de dois meios de cultura (BOXTEL & BERTHOULY, 1996 e TEIXEIRA et al., 2004) e cinco genótipos de C. arabica. No segundo experimento, foi avaliado o potencial de produção de calos embriogênicos em 10 genótipos, sendo cada genótipo considerado como um tratamento e, no terceiro experimento, foram avaliadas as variações nas concentrações de 2.4-D (2,5 e 20µM) e 2-iP (2,5 e 20µM) nos meios primário e secundário de TEIXEIRA et al. (2004). As culturas foram mantidas a 25oC, sob obscuridade. Para os genótipos 2.2 e 7.2, verificou-se a superioridade do meio de cultura Teixeira et al. (2004) em relação ao meio BOXTEL & BERTHOULY (1996). No genótipo 4.2, observou-se o comportamento inverso, ou seja, a superioridade do meio BOXTEL & BERTHOULY (1996). Os genótipos 3.0 e 5.0 apresentaram o mesmo comportamento em ambos os meios de cultura estudados, evidenciando que a produção de embriões somáticos é fortemente dependente do genótipo. A indução de calos depende da relação de 2-iP e 2.4-D. A combinação de 20.0µM of 2.4-D e 20.0µM of 2-iP promoveu a maior porcentagem de indução de calos embriogênicos.

Indução de embriogênese somática em cupuaçu (Theobroma grandiflorum Schum.)

Folhas jovens de cupuaçu (Theobroma grandiflorum Schum.) foram empregadas para indução de embriogênese somática, as quais foram cultivadas inicialmente em meio MS suplementado com 6,0 mg/L BAP e 0,5 mg/L AIA (meio de estabelecimento), seguindo-se o cultivo em meio MS suplementado com 2,20 mg/L TDZ (meio de indução). A região da nervura mostrou intumescimento três dias após inoculação no meio de estabelecimento, o qual foi seguido pela formação de cachos de calos. As massas calosas foram transferidas para o meio de indução, e as estruturas com características pró-embriogênicas puderam ser observadas após uma semana. Estudos de microscopia eletrônica de varredura revelaram estruturas com características de embriões somáticos no meio com TDZ.

Influência de diferentes meios de cultura sobre o crescimento de Pfaffia glomerata (Spreng.) Pedersen (Amaranthaceae) para conservação in vitro

Fundação de Amparo à Pesquisa do Estado de São Paulo (FAPESP)

A biotecnologia vegetal como alternativa para a cotonicultura familiar sustentável

This paper aims to describe the familiar cotton culture in the districts of Tangará and Triunfo Potiguar, located in the state of Rio Grande do Norte. It relates specific problems that small cotton agriculturists face in the cotton production and sale as well as their perception in relation to public policies that have been put into practice in these districts. The research revealed soils with potentiality for the cotton culture, but that are not being cultivated for anything else but subsistence, not being able to become productive, specifically through the cotton culture. That activity should be practiced so that it preserves the environment and the familiar farmers themselves, since it was verified they are constant1y exposed to health problems due to insecticides use. In what refers to fomentation policies it was observed that bureaucracy delays the liberation of the money destined to production, seeds delivery and other actions related to production and commercialization. Some procedures such as information and training about productivity development and attention with the environrnent and infrastructure are recommended. The results indicate lack of investments, rural credit and technical help, main1y in Triunfo Potiguar. There is unanimity, from the rural farmers of that district in what refers to the desire of improving the production and remaining in that activity. In this sense, the contribution of this research for the most appropriate culture production can be materialized through the technique of tissue's culture, aimed at obtaining plants that are resistant to diseases. The data indicated that the hormonal supplementations used induced regenerative calluses making in vitro morphogenesis possible in alI tested varieties. The use of the activated coal antioxidant was efficient, reducing oxidation, however not suppressing it. The results lead to an opportunity for the familiar tàrmers from Rio Grande do Norte enlarge the cotton culture, because to obtain plants that are resistant to diseases implies in insecticides reduction, propitiating smaller impact to the atmosphere and less cost

Enraizamento de estacas de atemoieira (Annona Cherimola Mill. x A. squamosa L.) cv. Gefner submetidas a tratamento lento e rápido com auxinas

Realizou-se este trabalho, com o objetivo de avaliar o uso de concentrações de diferentes auxinas no enraizamento de estacas de atemoieira (Annona cherimola Mill. x A. squamosa L.) cv. Gefner, empregando-se tratamento lento e rápido. O delineamento experimental empregado foi inteiramente casualizado, em esquema fatorial 3x7 (auxinas x concentrações), com 5 repetições de 12 estacas por parcela, para cada método de aplicação de auxina (lento e rápido). As estacas foram tratadas com os reguladores vegetais, por meio da imersão da base em soluções, contendo IBA, NAA e 2,4-D, durante 24 horas (tratamento lento) nas concentrações 0 (testemunha), 50, 100, 200, 300, 400 e 500 mg L-1 de cada regulador e 5 segundos (tratamento rápido) nas concentrações 0 (testemunha), 500, 1000, 2000, 3000, 4000 e 5000 mg L-1 de cada regulador. As variáveis avaliadas foram: porcentagem de estacas sobreviventes, enraizadas, sobreviventes com calos, comprimento de raiz por estaca, porcentagem de estacas enraizadas com folhas remanescentes, com brotação e com folhas remanescentes e brotação. Para o enraizamento de estacas de atemoieira cv. 'Gefner' conclui-se que, o tratamento lento, com 200 mg L-1 de NAA, proporcionou incremento ao processo, da mesma forma que o tratamento rápido com IBA, independente da concentração.

Lesões na dança: estudo transversal híbrido em academias da cidade de Bauru-SP

As atividades físicas praticadas pelos bailarinos predispõem-nos à ocorrência de inúmeros agravos. A busca por informações sobre as lesões dessa modalidade permitiu constatar, em nosso meio, escassez de investigações sobre o assunto. Nesse sentido, o objetivo desta pesquisa foi apontar as principais lesões da dança, visando descrever sua distribuição e caracterização a partir de nossa realidade, bem como sugerir medidas preventivas para os agravos de maior ocorrência. Para tanto, realizou-se estudo com 122 bailarinas na faixa etária de 8 a 30 anos, alocadas nas academias de dança da cidade de Bauru. em sua maioria, eram membros do corpo de baile (42%) ou estudantes (45%), com 3 a 11 anos de prática (73%), alunas de balé clássico (84%) e jazz (66%) e participavam de 4 a 8 aulas semanais (70%), com duração de 60 a 120 minutos (89%). O procedimento para coleta de dados foi o inquérito de morbidade referida para obtenção de informações sobre os agravos ocorridos no período de um ano. A apresentação dos resultados deu-se sob a forma de estatística descritiva, com distribuições de freqüência absoluta, relativa, corrigida e razão de lesões. em termos analíticos foram utilizados testes não paramétricos de Wilcoxon, Spearman e Kruskal-Wallis, para p < 0,05. Os resultados apontaram 53,27% das respondentes com freqüências entre 1 e 6 lesões agudas, que aumentam com a idade, concentram-se no plano tegumentar (79,46%) e estão associadas a variáveis como a idade em que começou a dançar e com o uso de sapatilha de ponta; 97,48% são agravos de membros inferiores, com predominância de calos (47,03%) e bolhas (28,56%) nos pés. O balé clássico foi o estilo responsável pela maior parte das lesões; as mais experientes e as estudantes foram as mais afetadas e o uso da sapatilha de ponta implicou risco elevado para ocorrência dos agravos observados nos pés.

Enraizamento de estacas herbáceas de nespereira (Eriobotrya japonica Lindl)

O cultivo da nespereira (Eriobotrya japonica Lindl) tem despertado interesse no Brasil, devido ao bom rendimento que proporciona aos produtores e à facilidade de comercialização. Com isso, cada vez mais se buscam métodos de propagação que preservem as características genéticas de interesse, induzam precocidade na formação da muda e no início de produção, além de baixo custo. O método de estaquia se adequa a estas características; sendo assim, o objetivo deste experimento é avaliar o efeito do tipo de estaca herbácea na produção de mudas de nespereira, num experimento conduzido na Faculdade de Ciências Agrárias e Veterinárias - FCAV/UNESP, Câmpus de Jaboticabal (SP), utilizando plantas matrizes de nespereiras, plantadas em 1977, da variedade Mizuho, pertencentes à coleção de plantas frutíferas da Universidade. Utilizaram-se estacas apicais herbáceas com e sem meristema apical, com 2 ou 4 folhas inteiras ou cortadas pela metade, num total de 6 tratamentos, 4 repetições e 12 estacas por parcela, em delineamento inteiramente casualizado. Após 120 dias do plantio das estacas em bandejas com vermiculita e mantidas sob câmara de nebulização, concluiu-se que a porcentagem de estacas vivas e a presença de calos foram significativamente maiores nas estacas apicais sem meristema e com quatro folhas inteiras, e não há efeito do tipo de estaca herbácea sobre o número de estacas enraizadas, número e comprimento médio de raízes. A presença de calos na base das estacas indica a possibilidade de estímulo natural de enraizamento que pode ser potencializada com a utilização de fitorreguladores.

Ultrastructural analysis of in vitro direct and indirect organogenesis

Fundação de Amparo à Pesquisa do Estado de São Paulo (FAPESP)

Estudo das poliaminas na morfogênese in vitro de Hemerocallis sp.

Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e Tecnológico (CNPq)

Interações entre auxinas e ácido bórico, no enraizamento de estacas caulinares de Coffea arabica L. cv. Mundo Novo

O presente trabalho teve como finalidade, estudar o efeito de auxinas e do boro no enraizamento de estacas caulinares de Coffea arabica L. cv. Mundo Novo. As estacas foram retiradas de ramos ortotrópicos semi-lenhosos de cafeeiro, as quais foram tratadas durante 24 horas com soluções de IBA ou NAA e boro, e a mistura das três substâncias, resultando um total de 14 tratamentos. Para a avaliação do objetivo em questão, foram realizadas as seguintes observações, mediante coleta após 90 dias de plantio: número de estacas enraizadas e número de estacas com calos. Através dos resultados obtidos, pode-se concluir que, para obter um maior número de estacas enraizadas, é conveniente o tratamento com NAA à 100 ou 200 ppm mais boro.

Efeitos da aplicação de reguladores vegetais e do ácido bórico, em estacas de lichieira (Litchi chinensis Sonn.)

Estudaram-se as interações entre os ácidos indol-butírico, alfa-naftaleno-acético e bórico no desenvolvimento de calos e na sobrevivência das estacas de lichieira (Litchi chinensis Sonn.). As estacas apresentavam 25 cm de comprimento e 4 folhas cortadas pela metade, sendo retiradas em duas épocas diferentes (janeiro e abril) e colocadas para enraizar em bandejas de isopor, tendo como substrato vermiculita e em condições de câmara de nebulização. Foi feita imersão de 2,5 cm da base das estacas, em soluções aquosas por l minuto. Os tratamentos utilizados corresponderam a 5.000 e 2.000 ppm de IBA; 3.000 e 1.500 ppra de NAA; 150 microgramas/ml de H3BO3; IBA 5.000 e 2.000 ppm + H3BO(3)150 microgramas/ml; NAA 3.000 e 1.500 ppm + H3BO3 150 microgramas/ml e H2O. Avaliou-se a formação de calos e a sobrevivência das estacas após 120 dias do plantio. Através dos resultados obtidos, foi possível concluir que dos tratamentos utilizados, nenhum foi efetivo na formação de raízes, havendo somente a formação de calos. A melhor época para a retirada de estacas correspondeu ao mês de abril.

Tolerância à salinidade em feijão (Phaseolus vulgaris L)

Uma das aplicações das técnicas da cultura de tecidos no melhoramento é a identificação de linhas de células que apresentam tolerância à salinidade. Vários autores obtiveram linhas de células tolerantes ao estresse salino; e estudo de mecanismos bioquímicos da tolerância a sais em plantas tem demonstrado altas correlações entre estes e o acúmulo de macromoléculas em tecido de plantas superiores. Para verificar essas correlações em feijão (Phaseolus vulgaris cv IAC carioca), calos oriundos de eixos embrionários foram cultivados em meio sólido, suplementado com NaCl nas concentrações de 0 a 60 mM. Após 13 dias de incubação, os calos foram coletados e analisados quanto ao crescimento relativo, teor de proteínas, teor de prolina e atividade da peroxidase. Os parâmetros analisados mostraram decréscimo no crescimento relativo e no de proteínas em resposta ao NaCl. Paralelamente, observou-se aumento significativo no conteúdo de prolina e atividade da enzima peroxidase.