Aqueous peroxyl radical exposure to THP-1 cells causes glutathione loss followed by protein oxidation and cell death without increased caspase-3 activity

Protein oxidation within cells exposed to oxidative free radicals has been reported to occur in an uninhibited manner with both hydroxyl and peroxyl radicals. In contrast, THP-1 cells exposed to peroxyl radicals (ROO center dot) generated by thermo decomposition of the azo compound AAPH showed a distinct lag phase of at least 6 h, during which time no protein oxidation or cell death was observed. Glutathione appears to be the source of the lag phase as cellular levels were observed to rapidly decrease during this period. Removal of glutathione with buthionine sulfoxamine eliminated the lag phase. At the end of the lag phase there was a rapid loss of cellular MTT reducing activity and the appearance of large numbers of propidium iodide/annexin-V staining necrotic cells with only 10% of the cells appearing apoptotic (annexin-V staining only). Cytochrome c was released into the cytoplasm after 12 h of incubation but no increase in caspase-3 activity was found at any time points. We propose that the rapid loss of glutathione caused by the AAPH peroxyl radicals resulted in the loss of caspase activity and the initiation of protein oxidation. The lack of caspase-3 activity appears to have caused the cells to undergo necrosis in response to protein oxidation and other cellular damage. (c) 2007 Elsevier B.V. All rights reserved.

Flux control of sulphate assimilation in Arabidopsis thaliana : adenosine 5′-phosphosulphate reductase is more susceptible than ATP sulphurylase to negative control by thiols

The effect of externally applied l-cysteine and glutathione (GSH) on ATP sulphurylase and adenosine 5′-phosphosulphate reductase (APR), two key enzymes of assimilatory sulphate reduction, was examined in Arabidopsis thaliana root cultures. Addition of increasing l-cysteine to the nutrient solution increased internal cysteine, γ-glutamylcysteine and GSH concentrations, and decreased APR mRNA, protein and extractable activity. An effect on APR could already be detected at 0.2 mm l-cysteine, whereas ATP sulphurylase was significantly affected only at 2 mm l-cysteine. APR mRNA, protein and activity were also decreased by GSH at 0.2 mm and higher concentrations. In the presence of l-buthionine-S, R-sulphoximine (BSO), an inhibitor of GSH synthesis, 0.2 mm l-cysteine had no effect on APR activity, indicating that GSH formed from cysteine was the regulating substance. Simultaneous addition of BSO and 0.5 mm GSH to the culture medium decreased APR mRNA, enzyme protein and activity. ATP sulphurylase activity was not affected by this treatment. Tracer experiments using 35SO42– in the presence of 0.5 mm l-cysteine or GSH showed that both thiols decreased sulphate uptake, APR activity and the flux of label into cysteine, GSH and protein, but had no effect on the activity of all other enzymes of assimilatory sulphate reduction and serine acetyltransferase. These results are consistent with the hypothesis that thiols regulate the flux through sulphate assimilation at the uptake and the APR step. Analysis of radioactive labelling indicates that the flux control coefficient of APR is more than 0.5 for the intracellular pathway of sulphate assimilation. This analysis also shows that the uptake of external sulphate is inhibited by GSH to a greater extent than the flux through the pathway, and that the flux control coefficient of APR for the pathway, including the transport step, is proportionately less, with a significant share of the control exerted by the transport step.

Studies of the metabolism and the toxicity of N-Methylformamide and related amides

The hepatotoxicity of the industrial solvent and investigational anti-tumour agent N-methylformamide (NMF, HOCNHCH3) and several structural analogues was assessed in mice. NMF and its ethyl analogue (NEF) were equipotent hepatotoxins causing extensive centrilobular necrosis and damage to the gall bladder. Pretreatment of mice with SKF525A did not influence the toxicity of these N-alkylformamides. Replacement of the formyl hydrogen of NMF with deuterium or methyl significantly reduced its hepatotoxicity. An in vitro model for the study of the toxicity and metabolism of N-alkylformamides was developed using isolated mouse hepatocytes. The cytotoxicity of NMF in vitro was concentration-dependent with maximal toxicity being achieved at concentrations of 5mM or above. The cytotoxic potential of related amides correlated well with their in vivo hepatotoxic potential. Pretreatment of mice with buthionine sulphoximine (BSO), which depleted hepatocytic levels of glutathione to 15% of control values, exacerbated the cytotoxicity of NMF towards the hepatocytes. NMF (1mM or above), incubated with isolated mouse hepatocytes, depleted intracellular glutathione levels to 26% of control values within 4h. Depletion of glutathione was quantitatively matched by the formation of a carbamoylating metabolite. Metabolism was dependent on the concentration of NMF and was drastically reduced in incubations of hepatocytes isolated from mice pretreated with BSO. The carbamoylating metabolite, S-(N-methylcarbamoyl)-glutathione (SMG), was identified in vitro using FAB-MS. The generation of SMG was subject to a large primary H/D kinetic isotope effect when the formyl hydrogen was replaced with deuterium. Likewise, glutathione depletion and metabolite formation were reduced or abolished by the deuteration or methylation of the formyl moiety of NMF. NEF, like NMF, depleted hepatocytic glutathione levels and was metabolised to a carbamoylating metabolite. Radioactivity derived from 14C-NMF and 14C-NEF, labelled in the alkyl moieties, was found to be irreversibly associated with microsomal protein on incubation in vitro. Binding was dependent on the presence of NADPH and was mostly abolished in the presence of reduced glutathione. SKF525A failed to influence the binding.

Synthèse de sulfilimines et de sulfoximines catalysée par les métaux de transition

Les sulfilimines et les sulfoximines sont des motifs structuraux dont l’intérêt synthétique est grandissant, notamment du fait de leurs applications en chimie médicinale et en agrochimie. Les travaux rapportés dans cet ouvrage décrivent le développement de nouvelles méthodes de synthèse efficaces pour la production de ces unités atypiques. Ces méthodes sont basées sur la réactivité d’une source d’azote électrophile, vis-à-vis de thioéthers et de sulfoxydes. L’utilisation d’un complexe métallique introduit en quantité catalytique a permis de favoriser le processus réactionnel. En tirant bénéfice de l’expertise de notre groupe de recherche sur le développement de réactions d’amination stéréosélectives de liaisons C-H et d’aziridination de styrènes, nous avons d’abord étudié la réactivité des N-mésyloxycarbamates comme source d’azote électrophile. Après avoir optimisé sa synthèse sur grande échelle, ce réactif chiral a été utilisé dans des réactions d’amination de thioéthers et de sulfoxydes, catalysées par un dimère de rhodium (II) chiral. Un processus diastéréosélectif efficace a été mis au point, permettant de produire des sulfilimines et des sulfoximines chirales avec d’excellents rendements et sélectivités. Au cours de l’optimisation de cette méthode de synthèse, nous avons pu constater l’effet déterminant de certains additifs sur la réactivité et la sélectivité de la réaction. Une étude mécanistique a été entreprise afin de comprendre leur mode d’action. Il a été observé qu’une base de Lewis telle que le 4-diméthylaminopyridine (DMAP) pouvait se coordiner au dimère de rhodium(II) et modifier ses propriétés structurales et redox. Les résultats que nous avons obtenus suggèrent que l’espèce catalytique active est un dimère de rhodium de valence mixte Rh(II)/Rh(III). Nous avons également découvert que l’incorporation de sels de bispyridinium avait une influence cruciale sur la diastéréosélectivité de la réaction. D’autres expériences sur la nature du groupe partant du réactif N-sulfonyloxycarbamate nous ont permis de postuler qu’une espèce nitrénoïde de rhodium était l’intermédiaire clé du processus d’amination. De plus, l’exploitation des techniques de chimie en débit continu nous a permis de développer une méthode d’amination de thioéthers et de sulfoxydes très performante, en utilisant les azotures comme source d’azote électrophile. Basée sur la décompositon photochimique d’azotures en présence d’un complexe de fer (III) simple et commercialement disponible, nous avons été en mesure de produire des sulfilimines et des sulfoximines avec d’excellents rendements. Le temps de résidence du procédé d’amination a pu être sensiblement réduit par la conception d’un nouveau type de réacteur photochimique capillaire. Ces améliorations techniques ont permis de rendre la synthèse plus productive, ce qui constitue un élément important d’un point de vue industriel.

Synthèse de sulfilimines et de sulfoximines catalysée par les métaux de transition

Les sulfilimines et les sulfoximines sont des motifs structuraux dont l’intérêt synthétique est grandissant, notamment du fait de leurs applications en chimie médicinale et en agrochimie. Les travaux rapportés dans cet ouvrage décrivent le développement de nouvelles méthodes de synthèse efficaces pour la production de ces unités atypiques. Ces méthodes sont basées sur la réactivité d’une source d’azote électrophile, vis-à-vis de thioéthers et de sulfoxydes. L’utilisation d’un complexe métallique introduit en quantité catalytique a permis de favoriser le processus réactionnel. En tirant bénéfice de l’expertise de notre groupe de recherche sur le développement de réactions d’amination stéréosélectives de liaisons C-H et d’aziridination de styrènes, nous avons d’abord étudié la réactivité des N-mésyloxycarbamates comme source d’azote électrophile. Après avoir optimisé sa synthèse sur grande échelle, ce réactif chiral a été utilisé dans des réactions d’amination de thioéthers et de sulfoxydes, catalysées par un dimère de rhodium (II) chiral. Un processus diastéréosélectif efficace a été mis au point, permettant de produire des sulfilimines et des sulfoximines chirales avec d’excellents rendements et sélectivités. Au cours de l’optimisation de cette méthode de synthèse, nous avons pu constater l’effet déterminant de certains additifs sur la réactivité et la sélectivité de la réaction. Une étude mécanistique a été entreprise afin de comprendre leur mode d’action. Il a été observé qu’une base de Lewis telle que le 4-diméthylaminopyridine (DMAP) pouvait se coordiner au dimère de rhodium(II) et modifier ses propriétés structurales et redox. Les résultats que nous avons obtenus suggèrent que l’espèce catalytique active est un dimère de rhodium de valence mixte Rh(II)/Rh(III). Nous avons également découvert que l’incorporation de sels de bispyridinium avait une influence cruciale sur la diastéréosélectivité de la réaction. D’autres expériences sur la nature du groupe partant du réactif N-sulfonyloxycarbamate nous ont permis de postuler qu’une espèce nitrénoïde de rhodium était l’intermédiaire clé du processus d’amination. De plus, l’exploitation des techniques de chimie en débit continu nous a permis de développer une méthode d’amination de thioéthers et de sulfoxydes très performante, en utilisant les azotures comme source d’azote électrophile. Basée sur la décompositon photochimique d’azotures en présence d’un complexe de fer (III) simple et commercialement disponible, nous avons été en mesure de produire des sulfilimines et des sulfoximines avec d’excellents rendements. Le temps de résidence du procédé d’amination a pu être sensiblement réduit par la conception d’un nouveau type de réacteur photochimique capillaire. Ces améliorations techniques ont permis de rendre la synthèse plus productive, ce qui constitue un élément important d’un point de vue industriel.