Remboursement des médicaments et nouvelles thérapies. Pour une lutte efficace contre la maladie d’Alzheimer

L'Humanité (quotidien national)

Narrative therapy for adults with major depressive disorder: Improved symptom and interpersonal outcomes

Abstract This study investigated depressive symptom and interpersonal relatedness outcomes from eight sessions of manualized narrative therapy for 47 adults with major depressive disorder. Post-therapy, depressive symptom improvement (d=1.36) and proportions of clients achieving reliable improvement (74%), movement to the functional population (61%), and clinically significant improvement (53%) were comparable to benchmark research outcomes. Post-therapy interpersonal relatedness improvement (d=.62) was less substantial than for symptoms. Three-month follow-up found maintenance of symptom, but not interpersonal gains. Benchmarking and clinical significance analyses mitigated repeated measure design limitations, providing empirical evidence to support narrative therapy for adults with major depressive disorder. RÉSUMÉ Cette étude a investigué les symptômes dépressifs et les relations interpersonnels d'une thérapie narrative en huit séances chez 47 adultes souffrant d'un trouble dépressif majeur. Après la thérapie, l'amélioration des symptômes dépressifs (d=1.36) et la proportion de clients atteignant un changement significatif (74%), le mouvement vers la population fonctionnelle (61%), enfin l'amélioration clinique significative (53%) étaient comparables aux performances des études de résultats. L'amélioration des relations interpersonnelles (d=0.62) était inférieure à l'amélioration symptomatique. Le suivi à trois mois montrait un maintien des gains symptomatiques mais pas pour les relations interpersonnelles. L’évaluation des performances et les analyses de significativité clinique modèrent les limitations du plan de recherche à mesures répétées et apportent une preuve empirique qui étaie l'efficacité des thérapies narratives pour des adultes avec un trouble dépressif majeur. Este estudo investigou sintomas depressivos e resultados interpessoais relacionados em oito sessões de terapia narrativa manualizada para 47 adultos com perturbação depressiva major. No pós terapia, melhoria de sintomas depressivos (d=1,36) e proporção de clientes que alcançam melhoria válida (74%), movimento para a população funcional (61%) e melhoria clinicamente significativa (53%) foram comparáveis com os resultados da investigação reportados. As melhorias pós terapia nos resultados interpessoais relacionados (d=.62) foi menos substancial do que para os sintomas. Aos três meses de seguimento houve a manutenção dos sintomas mas não dos ganhos interpessoais. As análises de benchemarking e de melhoria clinicamente significativas atenuam as limitações de um design de medidas repetidas, fornecendo evidência empírica para a terapia narrativa para adultos com perturbação depressiva major. Questo lavoro ha valutato i sintomi depressivi e gli outcome nella capacità di relazionarsi a livello interpersonale in 8 sedute di psicoterapia narrativa manualizzata in un gruppo di 47 adulti con depressione maggiore. I risultati ottenuti relativamente a: post terapy, miglioramento dei sintomi depressivi (d_1.36), proporzione di pazienti che hanno raggiunto un miglioramento affidabile e consistente (74%), movimento verso il funzionamento atteso nella popolazione (61%) e miglioramento clinicamente significativo (53%) sono paragonabili ai valori di riferimento della ricerca sull'outcome. I miglioramento della capacità di relazionarsi valutata alla fine del trattamento (d_.62) si è rivelata meno sostanziale rispetto ai sintomi. Un follow-up dopo 3 mesi ha dimostrato che il miglioramento sintomatologico è stato mantenuto, ma non quello degli obiettivi interpersonali. Valori di riferimento e analisi della significatività clinica hanno fatto fronte ai limiti del disegno a misure ripetute, offrendo prove empiriche sulla rilevanza della terapia narrativa in pazienti adulti con depressione maggiore

Hodgkin lymphoma and immunodeficiency in persons with HIV/AIDS

In persons with HIV/AIDS (PWHAs), Hodgkin lymphoma (HL) risk is increased. However, HL incidence in PWHAs has unexpectedly increased since highly active antiretroviral therapy (HAART) was introduced. We linked nationwide HIV/AIDS and cancer registry data from 1980 through 2002. Immunity was assessed by CD4 T-lymphocyte counts at AIDS onset. Annual HL incidence rates were calculated for 4 through 27 months after AIDS onset. During 477 368 person years (py's) of follow-up in 317 428 persons with AIDS (PWAs), 173 HL cases occurred (36.2 per 105 py's). Incidence was significantly higher in 1996 to 2002 than earlier. Incidence in PWAs with 150 to 199 CD4 cells/μL was 53.7 per 105 py's, whereas in PWAs with fewer than 50 CD4 cells/μL, it was 20.7 per 105 py's (Ptrend = .002). For each HL subtype, incidence decreased with declining CD4 counts, but nodular sclerosing decreased more precipitously than mixed cellularity, thereby increasing the proportion of mixed cellularity HL seen in PWAs. We conclude that HL incidence is lower with severe immunosuppression than with moderate immunosuppression, and HAART-related improvements in CD4 counts likely explain the increasing HL incidence in PWHAS observed since 1996. With more severe immunosuppression, nodular sclerosing HL becomes infrequent, explaining the higher proportion of mixed cellularity HL found in PWAs. Pathogenesis implications are discussed.

The influence of HIV infection to the periodontium; a clinical, microbiological, and enzymological study

The main targets of human immunodeficiency virus (HIV) are CD4 receptors of CD4+ lymphocytes and many other cells such as monocytes/macrophages, megakaryocytes, peripheral blood dendritic cells, follicular dendritic cells (DC), epidermal Langerhans cells, and astrocytes. Infection and killing of CD4+ lymphocytes or false reaction of the body to HIV infection and the spontaneous apoptosis of CD4+ lymphocytes decrease CD4+ lymphocyte counts leading to immunosuppression, further disease progression, and appearance of opportunistic infections and malignancies. Oral manifestations are considered to be among the first signs of HIV infection. Enhanced degradation of extracellular matrix and basement membrane components in oral diseases including periodontitis is caused by Zn-dependent enzymes called matrix metalloproteinases (MMPs). The levels and degrees of activation of MMP-1, -2, -3, -7, -8, -9, -25, -26, tissue inhibitors of MMPs (TIMP)-1 and -2, and myeloperoxidase (MPO) and collagenolytic/gelatinolytic activities, and also Ig A, -G, and -M, total protein, and albumin levels in a two-year follow-up were studied from salivary samples. The expression of MMP-7, -8, -9, -25, and -26 immunoreactivities in gingival tissue specimens were studied. Healthy HIV-negative subjects served as controls. All studied clinical periodontal parameters and microbiological evaluation of the periodontopathogens showed that periodontal health of the HIV-positive patients was moderately decreased in comparison to the healthy controls. The levels of Candida in the periodontal pockets and salivary MPO increased with the severity of HIV infection. Immunoreactivities and levels of MMPs and TIMPs, and MMP activities (collagenase, gelatinase) were enhanced in the HIV-positive patient salivary samples relative to the healthy controls regardless of the phase of HIV infection. However, these parameters did not reflect periodontal status in a similar way as in the generally healthy periodontitis patients. Salivary total protein, albumin, IgA, -G, and -M levels were significantly higher in all phases of HIV infection compared to the controls, and salivary total protein, IgG and IgM levels remained higher after two years follow-up, partly correlating with the disease progression and which may reflect the leakage of serum components into the mouth and thus a decreased mucosal barrier. Salivary analyses of MMPs and TIMPs with immunohistochemical analyses showed that HIV infection could predispose to periodontal destruction when compared with healthy controls or the body s defence reactions associated with HIV infection may have been reflected or mediated by MMPs.

A comparative phase 1 clinical trial to identify anti-infective mechanisms of vitamin D in people with HIV infection

Objectives:To determine if there is a biological mechanism that explains the association between HIV disease progression and increased mortality with low circulating vitamin D levels; specifically, to determine if restoring vitamin D levels induced T-cell functional changes important for antiviral immunity.Design:This was a pilot, open-label, three-arm prospective phase 1 study.Methods:We recruited 28 patients with low plasma vitamin D (<50nmol/l 25-hydroxyvitamin D3), comprising 17 HIV+ patients (11 on HAART, six treatment-naive) and 11 healthy controls, who received a single dose of 200000IU oral cholecalciferol. Advanced T-cell flow cytometry methods measured CD4(+) T-cell function associated with viral control in blood samples at baseline and 1-month after vitamin D supplementation.Results:One month of vitamin D supplementation restored plasma levels to sufficiency (>75nmol/l) in 27 of 28 patients, with no safety issues. The most striking change was in HIV+ HAART+ patients, where increased frequencies of antigen-specific T cells expressing macrophage inflammatory protein (MIP)-1 - an important anti-HIV blocking chemokine - were observed, with a concomitant increase in plasma MIP-1, both of which correlated significantly with vitamin D levels. In addition, plasma cathelicidin - a vitamin D response gene with broad antimicrobial activity - was enhanced.Conclusion:Vitamin D supplementation modulates disease-relevant T-cell functions in HIV-infected patients, and may represent a useful adjunct to HAART therapy. Copyright (C) 2015 Wolters Kluwer Health, Inc. All rights reserved.

Statistical and econometric analysis of the treatment of HIV/AIDS

The epidemic of HIV/AIDS in the United States is constantly changing and evolving, starting from patient zero to now an estimated 650,000 to 900,000 Americans infected. The nature and course of HIV changed dramatically with the introduction of antiretrovirals. This discourse examines many different facets of HIV from the beginning where there wasn't any treatment for HIV until the present era of highly active antiretroviral therapy (HAART). By utilizing statistical analysis of clinical data, this paper examines where we were, where we are and projections as to where treatment of HIV/AIDS is headed.

Chapter Two describes the datasets that were used for the analyses. The primary database utilized was collected by myself from an outpatient HIV clinic. The data included dates from 1984 until the present. The second database was from the Multicenter AIDS Cohort Study (MACS) public dataset. The data from the MACS cover the time between 1984 and October 1992. Comparisons are made between both datasets.

Chapter Three discusses where we were. Before the first anti-HIV drugs (called antiretrovirals) were approved, there was no treatment to slow the progression of HIV. The first generation of antiretrovirals, reverse transcriptase inhibitors such as AZT (zidovudine), DDI (didanosine), DDC (zalcitabine), and D4T (stavudine) provided the first treatment for HIV. The first clinical trials showed that these antiretrovirals had a significant impact on increasing patient survival. The trials also showed that patients on these drugs had increased CD4+ T cell counts. Chapter Three examines the distributions of CD4 T cell counts. The results show that the estimated distributions of CD4 T cell counts are distinctly non-Gaussian. Thus distributional assumptions regarding CD4 T cell counts must be taken, into account when performing analyses with this marker. The results also show the estimated CD4 T cell distributions for each disease stage: asymptomatic, symptomatic and AIDS are non-Gaussian. Interestingly, the distribution of CD4 T cell counts for the asymptomatic period is significantly below that of the CD4 T cell distribution for the uninfected population suggesting that even in patients with no outward symptoms of HIV infection, there exists high levels of immunosuppression.

Chapter Four discusses where we are at present. HIV quickly grew resistant to reverse transcriptase inhibitors which were given sequentially as mono or dual therapy. As resistance grew, the positive effects of the reverse transcriptase inhibitors on CD4 T cell counts and survival dissipated. As the old era faded a new era characterized by a new class of drugs and new technology changed the way that we treat HIV-infected patients. Viral load assays were able to quantify the levels of HIV RNA in the blood. By quantifying the viral load, one now had a faster, more direct way to test antiretroviral regimen efficacy. Protease inhibitors, which attacked a different region of HIV than reverse transcriptase inhibitors, when used in combination with other antiretroviral agents were found to dramatically and significantly reduce the HIV RNA levels in the blood. Patients also experienced significant increases in CD4 T cell counts. For the first time in the epidemic, there was hope. It was hypothesized that with HAART, viral levels could be kept so low that the immune system as measured by CD4 T cell counts would be able to recover. If these viral levels could be kept low enough, it would be possible for the immune system to eradicate the virus. The hypothesis of immune reconstitution, that is bringing CD4 T cell counts up to levels seen in uninfected patients, is tested in Chapter Four. It was found that for these patients, there was not enough of a CD4 T cell increase to be consistent with the hypothesis of immune reconstitution.

In Chapter Five, the effectiveness of long-term HAART is analyzed. Survival analysis was conducted on 213 patients on long-term HAART. The primary endpoint was presence of an AIDS defining illness. A high level of clinical failure, or progression to an endpoint, was found.

Chapter Six yields insights into where we are going. New technology such as viral genotypic testing, that looks at the genetic structure of HIV and determines where mutations have occurred, has shown that HIV is capable of producing resistance mutations that confer multiple drug resistance. This section looks at resistance issues and speculates, ceterus parabis, where the state of HIV is going. This section first addresses viral genotype and the correlates of viral load and disease progression. A second analysis looks at patients who have failed their primary attempts at HAART and subsequent salvage therapy. It was found that salvage regimens, efforts to control viral replication through the administration of different combinations of antiretrovirals, were not effective in 90 percent of the population in controlling viral replication. Thus, primary attempts at therapy offer the best change of viral suppression and delay of disease progression. Documentation of transmission of drug-resistant virus suggests that the public health crisis of HIV is far from over. Drug resistant HIV can sustain the epidemic and hamper our efforts to treat HIV infection. The data presented suggest that the decrease in the morbidity and mortality due to HIV/AIDS is transient. Deaths due to HIV will increase and public health officials must prepare for this eventuality unless new treatments become available. These results also underscore the importance of the vaccine effort.

The final chapter looks at the economic issues related to HIV. The direct and indirect costs of treating HIV/AIDS are very high. For the first time in the epidemic, there exists treatment that can actually slow disease progression. The direct costs for HAART are estimated. It is estimated that the direct lifetime costs for treating each HIV infected patient with HAART is between $353,000 to $598,000 depending on how long HAART prolongs life. If one looks at the incremental cost per year of life saved it is only $101,000. This is comparable with the incremental costs per year of life saved from coronary artery bypass surgery.

Policy makers need to be aware that although HAART can delay disease progression, it is not a cure and HIV is not over. The results presented here suggest that the decreases in the morbidity and mortality due to HIV are transient. Policymakers need to be prepared for the eventual increase in AIDS incidence and mortality. Costs associated with HIV/AIDS are also projected to increase. The cost savings seen recently have been from the dramatic decreases in the incidence of AIDS defining opportunistic infections. As patients who have been on HAART the longest start to progress to AIDS, policymakers and insurance companies will find that the cost of treating HIV/AIDS will increase.

S-DABO 类衍生物及AZT-氟喹喏酮类偶联物体外抗HIV 活性及机制研究

本论文由2 个相对独立的部分组成: S-DABO 类衍生物体外抗HIV 活性及 其机制研究和AZT－氟喹喏酮类偶联物体外抗HIV-1 活性及其机制研究。 HIV 逆转录酶抑制剂一直是抗HIV 药物研发的热点。该类抑制剂靶定在病 毒复制周期早期，为HAART 疗法提供了很多新的药物组合。目前FDA 批准上 市的逆转录酶抑制剂虽然有很多，但由于较严重的毒副作用、HIV 病毒易变异、 耐药性的出现等问题还需要开发更多的新的逆转录酶抑制剂。本论文对23 个 S-DABO 类化合物和8 个AZT－氟喹喏酮类偶联物的体外抗HIV 活性进行检 测，并对其中活性较高的化合物进行靶点和机制研究。 23 个S-DABO 类化合物采用对C8166 细胞的毒性试验，对HIV-1ⅢB 诱导的 合胞体形成的抑制试验和对HIV-1ⅢB 急性感染的MT-4 细胞的保护试验进行抗 HIV-1 活性初步筛选。试验结果发现所有化合物均对多种HIV 宿主细胞毒性小， 其中22 个化合物具有抗HIV-1 活性，特别是化合物RZK-4 和RZK-5，其对 HIV-1ⅢB 诱导的合胞体形成的SI 值（Selective index）分别为>16666 和>38462； RZK-4 和RZK-5 对HIV-1ⅢB 急性感染的MT-4 细胞的保护的SI 值分别为2666.67 和2150.54，与相应的阳性对照药品NVP（Nevirapine）的SI 值相接近。以p24 抗原水平为指标，对其中20 个化合物的抗HIV-1 活性进行确证，发现这20 个 化合物均能抑制 HIV-1ⅢB p24 抗原的产生，其中RZK-4 和RZK-5 的EC50 值分 别为5.93 和5.74ng/ml，比相应的阳性对照药品NVP（Nevirapine）的EC50 值 要低（27.3ng/ml）。这些化合物对试验株HIV-1MN、临床分离株HIV-1KM018、非 核苷类抑制剂耐药株HIV-1ⅢB A17 也有较好的抑制效果。但这23 个S-DABO 类化合物对HIV-2 病毒株均无抑制作用。通过检测化合物对感染与未感染细胞的 融合的抑制、对HIV-1 逆转录酶和蛋白酶活性的抑制、对慢性感染H9 细胞 （H9/HIV-1ⅢB）中病毒复制的抑制等试验来探讨化合物的抗HIV-1 机制。结果 显示：有20 个化合物对HIV-1 蛋白酶（PR）有抑制作用，其中有17 个化合物 对HIV-1 逆转录酶（RT）有抑制作用；但所有化合物均不能抑制感染与未感染 细胞的融合，也不能抑制慢性感染H9 细胞中病毒的复制。试验结果表明，这 23 个S-DABO 类化合物主要通过抑制HIV-1 逆转录酶来发挥作用，它们是典型 的非核苷类RT 抑制剂。 8 个AZT－氟喹喏酮类偶联物采用对C8166 细胞的毒性试验，对HIV-1ⅢB 诱导的合胞体形成的抑制试验和对HIV-1ⅢB急性感染的MT-4 细胞的保护试验 进行抗HIV-1 活性初步筛选。试验结果发现其中2 个化合物SRLZ 和SROZ 有 较显著的抗HIV-1 活性，其对HIV-1ⅢB诱导的合胞体形成抑制的SI 值分别为 >41667 和>105263；对HIV-1ⅢB 急性感染的MT-4 细胞的保护的SI 值分别为 30162 和 6368，与AZT（Zidothymidine）的SI 值相近似。以p24 抗原水平为 指标，对其抗HIV-1活性进行确证，发现化合物SRLZ和SROZ均能抑制HIV-1ⅢB p24 抗原的产生，其EC50 值分别为 0.71 和2.1ng/ml,比相应的阳性对照药品AZT 的EC50 值要低（3.5ng/ml）。化合物SRLZ 和SROZ 对临床分离株HIV-1KM018 也有较好的抑制活性，其EC50 值分别为1.4 和22ng/ml。通过检测化合物对慢 性感染H9 细胞（H9/HIV-1ⅢB）中病毒复制的抑制试验来探讨化合物的抗HIV-1 机制，结果表明化合物SRLZ 和SROZ 均不能抑制慢性感染H9 细胞中病毒的 复制。通过检测化合物对金黄色葡萄球菌的抑制作用来检测其抗菌活性，化合 物SRLZ 和SROZ 对金黄色葡萄球菌有较好的抑制作用，其MIC（Minimum inhibitory concentration）值分别为14.65 和7.32μg/ml，与其相应的阳性对照药 物的MIC 值相类似。试验结果表明：药物—药物偶连这种化学修饰方法并没有 改变AZT－氟喹喏酮类偶联物的抗HIV 作用靶点，但也没有较大地影响到其体 外抗病毒活性和抗微生物活性。

中国部分地区未经治疗HIV-1 感染者耐药基因研究

高效抗逆转录病毒治疗(HAART)的应用，极大的降低了AIDS发病率和死亡 率，延长了HIV感染者的生命。但HIV耐药在很大程度上影响了HAART的疗效， 耐药株的产生成为影响抗病毒治疗效果的主要因素。欧洲、美国的耐药监测技术 规范均推荐在新感染未经抗病毒药物治疗的患者中进行原发耐药检测。我国政府 于2003年底出台了艾滋病治疗的“四免一关怀”政策，陆续在全国范围内开展了大 规模的免费抗病毒治疗，监测我国未经抗病毒药物治疗HIV-1感染者中的耐药情 况可以为制定合理的用药方案和减少耐药毒株出现提供科学依据。 根据世界卫生组织(WHO)的“HIV 耐药监测指南”，无偿献血者中的HIV-1 感染者，可以认定为HIV 新诊断未治疗人群。分析了云南无偿献血者的血浆和 外周血单核细胞(PBMC)，研究云南无偿献血人群的耐药状况。 已有实验室血清学方法识别HIV-1 新近感染和长期感染，用BED-CEIA 方 法，在河南、安徽、山西自愿咨询检测(VCT)人群中检出新近感染人群，进行耐 药基因研究, 对照研究了部分长期感染人群。 样品提取核酸后，巢式聚合酶链反应(nested-PCR)扩增pol 基因区(含蛋白酶 区1～99 氨基酸全长和逆转录酶区1～242 氨基酸)。PCR 产物双脱氧法测序，所 得序列与洛斯阿拉莫斯HIV 核酸序列库(Los Alamos HIV Database)标准株构建系 统进化树分析亚型；用斯坦福大学耐药数据库(Standford HIV Drug Resistance Database)分析耐药。 研究发现，云南省2005～2006 年无偿献血者中，有52 例为HIV-1 阳性，其 中49 例血浆和相应的PBMC 样品病毒基因扩增成功。序列分析表明，HIV 病毒 的亚型分布为CRF08_BC (51.0%), CRF07_BC (24.5%), CRF01_AE (20.4%)和B (4.1%)；所有样品均未发现蛋白酶抑制剂（PI）耐药基因位点主要突变，只在6 例(11.7%)样品中发现7 例次PI 次要耐药位点突变；另外，在9 例(18.4%)样品中发现10 例次核苷类逆转录酶抑制剂(NRTI) 耐药突变，1 例(2.0%)发生非核苷类 逆转录酶抑制剂(NNRTI) 耐药突变；针对具体药物PI/NRTI/NNRTI 均只有1 例 有潜在的低度耐药，临床仍对药物敏感。PBMC 和血浆的病毒耐药没有显著差异。 从河南、安徽、山西27 个VCT 检测点2006～2007 年采集的10310 例样品 中，通过WB 和BED-CEIA 检测出新近感染人群63 例，分析成功50 例血浆样 品；河南VCT 长期感染样品中随机抽样，分析成功19 例样品。分析成功的69 例VCT 样品中，HIV 病毒株的亚型分布分别为B’ (95.7%)，CRF01_AE(2.9%)和 C(1.4%)。上诉样品均未检出PI 主要耐药相关突变，只在26 例(37.7%)样品中存 在27 例次PI 次要耐药相关突变；3 例(4.3%)样品出现6 例次NRTI 耐药相关突 变，7 例(10.1%)样品出现8 例次NNRTI 耐药相关突变。通过与斯坦福大学耐药 数据库比对，没有发现针对PI 类药物的临床耐药；但有2 例(2.8%)针对NRTI 类 药物耐药，1 例有M184V 突变导致对拉米夫定(3TC)和氟代拉米夫定(FTC)高度 耐药；1 例样品存在T215Y、M41L、L210W 三重突变位点，对阿巴卡韦(ABC)、 去羟肌苷(ddI)和坦那夫韦(TDF)中度耐药，对齐多夫定(AZT)和司他夫定(d4T)高 度耐药；针对NNRTI 类药物，有3 例(4.3%)毒株有耐药，1 例有K103N 突变导 致对奈韦拉平(NVP)、地拉韦啶(DLV)和依菲韦伦(EFV)的高度耐药；1 例有Y188L 突变导致对NVP 和EFV 的高度耐药；1 例存在K101E 和G190A 双重突变，导 致对NVP 的高度耐药，对DLV、EFV 和依曲韦林(ETR)中度耐药。 比较长期感染和新近感染者之间的亚型和耐药，未发现显著差异。 研究结果表明，云南、河南和安徽未经治疗HIV-1 感染者中耐药处于低流行 状态。亚型分布云南无偿献血者以CRF_BC 为主，河南、安徽VCT 人群以B’ 为主。应持续在未经治疗人群中进行耐药监测。

二种抗HIV-1 药物筛选模型的建立及β-咔啉类化合物抗HIV 活性研究

艾滋病的流行严重威胁着人类健康和全球经济的发展，在某些国家已经造成 严重的经济问题和社会问题。由于尚无安全有效的艾滋病疫苗问世，药物治疗仍 是目前防治艾滋病的主要途径。二十多种抗HIV 药物的临床使用以及HAART 疗 法的应用，艾滋病患者的死亡率呈一定的下降趋势。然而，目前使用的抗HIV 药物能够抑制患者体内病毒的复制，但不能完全清除病毒。耐药病毒株的出现和 流行更降低了药物治疗的成功率。为此需要不断研究开发作用于新靶点或具有不 同作用机制的药物。 药物筛选是药物开发中的重要环节，其关键在于建立适合的药物筛选方法。 传统药物筛选费时费力，近年来逐渐被高通量药物筛选方法所代替。本研究中， 我们在大肠杆菌中表达并纯化了HIV-1 蛋白酶，获得了纯度和活性较高的蛋白 酶。利用荧光标记的蛋白酶底物在体外检测化合物对蛋白酶活性的影响，建立了 适于高通量筛选蛋白酶抑制剂的体外筛选方法。通过对大量样本的筛选，发现一 些具有蛋白酶抑制活性的化合物和粗提物。本研究还表达纯化了HIV-1 核衣壳蛋 白NCp7。利用锌离子特异性的荧光染料，建立了相应的高通量筛选方法。该方 法能够筛选出通过逐出NCp7 结合的锌离子而抑制该蛋白功能的化合物。这两种 体外筛选方法的建立大大提高了药物筛选的效率，降低了工作强度，为进一步的 研究打下了基础。 在药物开发过程中，常常通过对已知有效的化合物进行结构修饰以提高药物 活性并降低细胞毒性，改善药物疗效。在先前的药物筛选中，我们发现从高等真 菌中提取的β-咔啉类化合物flazin, 具有一定的抗HIV 活性。通过对flazin 的结 构修饰， 我们发现了治疗指数更高的化合物。本研究对其中两个， dehydroxymethylflazinamide 和flazinamide，进行了更深入的抗HIV 活性研究。 dehydroxymethylflazinamide 和flazinamide 抑制HIV-1IIIB 感染诱导的合胞体形 成的EC50 分别为0.31 μM 和 0.38 μM。 与flazin(EC50 为2.37 μM）相比较， 抗HIV 活性提高了约6-7 倍。这两个化合物对C8166 细胞的半致死浓度(CC50) 分别为27.34μM和118.64μM。Dehydroxymethylflazinamide 的细胞毒性与flazin (CC50 为28.71μM）相似，而flazinamide 的细胞毒性降低了约4 倍左右。与flazin 相比，通过结构修饰，Dehydroxymethylflazinamide 治疗指数从12.1 提高到 88.19，而flazinamide 治疗指数从12.1 提高到312.2。研究还发现，这两个化 合物对临床分离株HIV-1KM018 以及实验株HIV-2ROD、HIV-2CBL-20 也有良好的抑 制效果。 我们对dehydroxymethylflazinamide 和flazinamide 的作用机制也进行了初 步探讨。二者均能有效抑制HIV-1IIIB, HIV-2ROD and HIV-2CBL-20 病毒的细胞间传 播，而不能抑制HIV-1IIB 慢性感染的H9 细胞中病毒复制，说明该化合物可能主 要作用于病毒生活周期的早期阶段； 进一步的研究表明， dehydroxymethylflazinamide 对HIV-1IIIB 进入阶段有很强的抑制活性，说明进入 阶段是该化合物的主要作用靶点；而flazinamide 对直接杀病毒、病毒吸附及进 入均没有显著的抑制效果，该化合物的作用机制还需进一步研究。对酶靶点作用 研究表明，两个化合物对HIV-1 逆转录酶仅有微弱抑制活性说明该酶可能不是作 用靶点；dehydroxymethylflazinamide 对HIV-1 蛋白酶有抑制活性但半效浓度 （EC50）较高,说明该酶可能是化合物的次要靶点。而flazinamide 在体外与重组 的整合酶有较强的结合活性，暗示该化合物可能对整合酶有一定的抑制作用。以 上结果还说明，虽然两个化合物具有类似的结构，但它们可能是通过完全不同的 机制来抑制HIV 的复制.

Age-related immune reconstitution during highly active antiretroviral therapy in human immunodeficiency virus type 1-infected children.

OBJECTIVES: To evaluate the immune reconstitution in HIV-1-infected children in whom highly active antiretroviral therapy (HAART) controlled viral replication and to assess the existence of a relation between the magnitude of this restoration and age. METHODS: All HIV-1-infected children in whom a new HAART decreased plasma viral load below 400 copies/ml after 3 months of therapy were prospectively enrolled in a study of their immune reconstitution. Viral load, lymphocyte phenotyping, determination of CD4+ and CD8+ T cell receptor repertoires and proliferative responses to mitogens and recall antigens were assessed every 3 months during 1 year. RESULTS: Nineteen children were evaluated. Naive and memory CD4+ percentages were already significantly increased after 3 months of HAART. In contrast to memory CD4+ percentages, naive CD4+ percentages continued to rise until 12 months. Age at baseline was inversely correlated with the magnitude of the rise in naive CD4+ cells after 3, 6 and 9 months of therapy but not after 12 months. Although memory and activated CD8+ cells were already decreasing after 3 months, abnormalities of the CD8 T cell receptor repertoire and activation of CD8+ cells persisted at 1 year. HAART increased the response to mitogens as early as 3 months after starting therapy. CONCLUSIONS: In children the recovery of naive CD4+ cells occurs more rapidly if treatment is started at a younger age, but after 1 year of viral replication control, patients of all ages have achieved the same level of restoration. Markers of chronic activation in CD8+ cells persist after 1 year of HAART.

Cellular immune responses in human immunodeficiency virus (HIV)-1-infected children: Is immune restoration by highly active anti-retroviral therapy comparable to non-progression?

The objective of this study was to investigate whether the restored immune functions of vertically human immunodeficiency virus (HIV)-infected children who were severely immunodeficient before the initiation of highly active anti-retroviral therapy (HAART) are comparable to those of untreated slow progressors. We therefore assessed T cell proliferation and cytokine [interferon (IFN)-γ, interleukin (IL)-5 and IL-13] secretions after mitogen, recall antigens and HIV-1-specific stimulation in 12 untreated slow progressors, 16 untreated progressors and 18 treated patients. Treated children were profoundly immunodeficient before the initiation of HAART and had long-lasting suppression of viral replication on treatment. We demonstrated that slow progressors are characterized not only by the preservation of HIV-1-specific lymphoproliferative responses but also by the fact that these responses are clearly T helper type 1 (Th1)-polarized. Children on HAART had proliferative responses to HIV-1 p24 antigen, purified protein derivative (PPD) and tetanus antigen similar to slow progressors and higher than those of progressors. However, in contrast to slow progressors, most treated children exhibited a release of Th2 cytokines accompanying the IFN-γ secretion in response to the HIV-1 p24 antigen. Moreover, despite higher proliferative responses to phytohaemagglutinin (PHA) than the two groups of untreated children, treated children had lower levels of IFN-γ secretion in response to PHA than slow progressors. These data show that in severely immunodeficient vertically HIV-infected children, a long-lasting HAART allows recovering lymphoproliferative responses similar to untreated slow progressors. However, alterations in IFN-γ secretion in response to the mitogen PHA persisted, and their cytokine release after HIV-specific stimulation was biased towards a Th2 response. © 2011 The Authors. Clinical and Experimental Immunology © 2011 British Society for Immunology.

Expression of the common heat-shock protein receptor CD91 is increased on monocytes of exposed yet HIV-1-seronegative subjects.

The significantly higher surface expression of the surface heat-shock protein receptor CD91 on monocytes of human immunodeficiency virus type-1 (HIV-1)-infected, long-term nonprogressors suggests that HIV-1 antigen uptake and cross-presentation mediated by CD91 may contribute to host anti-HIV-1 defenses and play a role in protection against HIV-1 infection. To investigate this further, we performed phenotypic analysis to compare CD91 surface expression on CD14+ monocytes derived from a cohort of HIV-1-exposed seronegative (ESN) subjects, their seropositive (SP) partners, and healthy HIV-1-unexposed seronegative (USN) subjects. The median fluorescent intensity (MFI) of CD91 on CD14+ monocytes was significantly higher in ESN compared with SP (P=0.028) or USN (P=0.007), as well as in SP compared with USN subjects (P=0.018). CD91 MFI was not normalized in SP subjects on highly active antiretroviral therapy (HAART) despite sustainable, undetectable plasma viraemia. Data in three SP subjects experiencing viral rebounds following interruption of HAART showed low CD91 MFI comparable with levels in USN subjects. There was a significant positive correlation between CD91 MFI and CD8+ T cell counts in HAART-naïve SP subjects (r=0.7, P=0.015). Increased surface expression of CD91 on CD14+ monocytes is associated with the apparent HIV-1 resistance that is observed in ESN subjects.

Modelling HIV/AIDS length of stay in Portugal

Tese apresentada como requisito parcial para obtenção do grau de Doutor em Estatística e Gestão de Informação pelo Instituto Superior de Estatística e Gestão de Informação da Universidade Nova de Lisboa

Development of a bifunctional CD1d-anti-HER2 scFv fusion molecule to redirect the iNKT cell-mediated immune response to the tumor site

Abstract : Invariant natural killer T lymphocytes (iNKT) are a unique subpopulation of T lymphocytes recognizing glycolipid antigens in the context of the MHC class I-like molecule CD1d. Upon activation with the high affinity ligand α-galactosylceramide (αGalCer), iNKT cells rapidly produce large amounts of the pro-inflammatory cytokine interferon gamma (IFN-γ) and potently activate cells of the innate and adaptive immune response, such as dendritic cells (DCs), NK and T cells. In this context, iNKT cells have been shown to efficiently mediate antitumor activity, and recent research has focused on the manipulation of these cells for antitumor therapies. However, a major drawback of αGalCer as a free drug is that a single injection of this ligand leads to a short-lived iNKT cell activation followed by a long-term anergy, limiting its therapeutic use. In contrast, we demonstrate here that when αGalCer is loaded on a recombinant soluble CD1d molecule (αGalCer/sCD1d), repeated injections lead to a sustained iNKT and NK cell activation associated with IFN-γ secretion as well as with DC maturation. Most importantly, when the αGalCer/sCD1d is fused to an anti-HER2 scFv antibody fragment, potent inhibition of experimental lung metastasis and established subcutaneous tumors is obtained when systemic treatment is started two to seven days after the injection of HER2-expressing B16 melanoma cells, whereas at this time free αGalCer has no effect. The antitumor activity of the sCD1d-anti-HER2 fusion protein is associated with HER2-specific tumor localization and accumulation of iNKT, NK and T cells at the tumor site. Importantly, active T cell immunization combined with the sCD1d-anti-HER2 treatment leads to the accumulation of antigen-specific CD8 T cells exclusively in HER2-expressing tumors, resulting in potent tumor inhibition. In conclusion, sustained activation and tumor targeting of iNKT cells by recombinant αGalCer/sCD1d molecules thus may promote a combined innate and adaptive immune response at the tumor site that may prove to be effective in cancer immunotherapy. RESUME : Les lymphocytes «invariant Natural Killer T » (iNKT) forment une sous-population particulière de lymphocytes T reconnaissant des antigènes glycolipidiques présentés sur la molécule non-polymorphique CD1d, analogue aux protéines du complexe majeur d'histocompatibilité de classe I. Après activation avec le ligand de haute affinité α-galactosylceramide (αGalCer), les cellules iNKT produisent des grandes quantités de la cytokine pro-inflammatoire interferon gamma (IFN-γ) et activent les cellules du système immunitaire inné et acquis, telles que les cellules dendritiques (DC), NK et T. En conséquence, on a montré que les cellules iNKT exercent des activités anti-tumorales et la recherche s'est intéressée à la manipulation de ces cellules pour développer des thérapies anti-tumorales. Néanmoins, le désavantage majeur de l'αGalCer, injecté seul, est qu'une seule dose de ce ligand aboutit à une activation des cellules iNKT de courte durée suivie par un état anergique prolongé, limitant l'utilisation thérapeutique de ce glycolipide. En revanche, l'étude présentée ici démontre que, si l'αGalCer est chargé sur des molécules récombinantes soluble CD1d (αGalCer/sCDld), des injections répétées aboutissent à une activation prolongée des cellules iNKT et NK associée avec la sécrétion d'IFN-γ et la maturation des cellules DC. Plus important, si on fusionne la molécule αGalCer/sCD1d avec un fragment single-chain (scFv) de l'anticorps anti-HER2, on observe une importante inhibition de métastases expérimentales aux poumons et de tumeurs sous-cutanées même lorsque le traitement systémique est commencé 2 à 7 jours après la greffe des cellules de mélanome B16 transfectées avec l'antigène HER2. Dans les mêmes conditions le traitement avec l'αGalCer seul est inefficace. L'activité anti-tumorale de la protéine sCDld-anti-HER2 est associée à son accumulation spécifique dans des tumeurs exprimant le HER2 ainsi qu'avec une accumulation des cellules iNKT, NK et T à la tumeur. De plus, une immunisation active combinée avec le traitement sCD1d-anti-HER2 aboutit à une accumulation des lymphocytes T CD8 spécifiques de l'antigène d'immunisation, ceci exclusivement dans des tumeurs qui expriment l'antigène HER2. Cette combinaison résulte dans une activité anti-tumeur accrue. En conclusion, l'activation prolongée des cellules iNKT redirigées à la tumeur par des molécules recombinantes αGalCer/sCDld conduit à l'activation de la réponse innée et adaptative au site tumoral, offrant une nouvelle stratégie prometteuse d'immunothérapie contre le cancer. RESUME POUR UN LARGE PUBLIC : Le cancer est une cause majeure de décès dans le monde. Sur un total de 58 millions de décès enregistrés au niveau mondial en 2005, 7,6 millions (soit 13%) étaient dus au cancer. Les principaux traitements de nombreux cancers sont la chirurgie, en association avec la radiothérapie et la chimiothérapie. Néanmoins, ces traitements nuisent aussi aux cellules normales de notre corps et parfois, ils ne suffisent pas pour éliminer définitivement une tumeur. L'immunothérapie est l'une des nouvelles approches pour la lutte contre le cancer et elle vise à exploiter la spécificité du système immunitaire qui peut distinguer des cellules normales et tumorales. Une cellule exprimant un marqueur tumoral (antigène) peut être reconnue par le système immunitaire humoral (anticorps) et/ou cellulaire, induisant une réponse spécifique contre la tumeur. L'immunothérapie peut s'appuyer alors sur la perfusion d'anticorps monoclonaux dirigés contre des antigènes tumoraux, par exemple les anticorps dirigés contre les protéines oncogéniques Her-2/neu dans le cancer du sein. Ces anticorps ont le grand avantage de spécifiquement se localiser à la tumeur et d'induire la lyse ou d'inhiber la prolifération des cellules tumorales exprimant l'antigène. Aujourd'hui, six anticorps monoclonaux non-conjugés sont approuvés en clinique. Cependant l'efficacité de ces anticorps contre des tumeurs solides reste limitée et les traitements sont souvent combinés avec de la chimiothérapie. L'immunothérapie spécifique peut également être cellulaire et exploiter par immunisation active le développement de lymphocytes T cytotoxiques (CTL) capables de détruire spécifiquement les cellules malignes. De telles «vaccinations »sont actuellement testées en clinique, mais jusqu'à présent elles n'ont pas abouti aux résultats satisfaisants. Pour obtenir une réponse lymphocytaire T cytotoxique antitumorale, la cellule T doit reconnaître un antigène associé à la tumeur, présenté sous forme de peptide dans un complexe majeur d'histocompatibilité de classe I (CHM I). Cependant les cellules tumorales sont peu efficace dans la présentation d'antigène, car souvent elles se caractérisent par une diminution ou une absence d'expression des molécules d'histocompatibilité de classe I, et expriment peu ou pas de molécules d'adhésion et de cytokines costimulatrices. C'est en partie pourquoi, malgré l'induction de fortes réponses CTL spécifiquement dirigés contre des antigènes tumoraux, les régressions tumorales obtenus grâce à ces vaccinations sont relativement rares. Les lymphocytes «invariant Natural Killer T » (iNKT) forment une sous-population particulière de lymphocytes T reconnaissant des antigènes glycolipidiques présentés sur la molécule non-polymorphique CD1d, analogue aux protéines CMH I. Après activation avec le ligand de haute affinité α-galactosylceramide (αGalCer), les cellules iNKT produisent des grandes quantités de la cytokine pro-inflammatoire interferon gamma (IFN-γ) et activent les cellules du système immunitaire inné et acquis, telles que les cellules dendritiques (DC), NK et T. En conséquence, on a montré que les cellules iNKT exercent des activités anti-tumorales et la recherche s'est intéressée à la manipulation de ces cellules pour développer des thérapies anti-tumorales. Néanmoins, le désavantage majeur de l'αGalCer, injecté seul, est qu'une seule dose de ce ligand aboutit à une activation des cellules iNKT de courte durée suivie par un état anergique prolongé, limitant l'utilisation thérapeutique de ce glycolipide. Notre groupe de recherche a donc eu l'idée de développer une nouvelle approche thérapeutique où la réponse immunitaire des cellules iNKT serait prolongée et redirigée vers la tumeur par des anticorps monoclonaux. Concrètement, nous avons produit des molécules récombinantes soluble CD1d (sCD1d) qui, si elles sont chargés avec l'αGalCer (αGalCer/sCDld), aboutissent à une activation prolongée des cellules iNKT et NK associée avec la sécrétion d'IFN-γ et la maturation des cellules DC. Plus important, si la molécule αGalCer/sCD1d est fusionnée avec un fragment single-chain (scFv) de l'anticorps anti-HER2, la réponse immunitaire est redirigée à la tumeur pour autant que les cellules cancéreuses expriment l'antigène HER2. Les molécules αGalCer/sCDld ainsi présentées activent les lymphocytes iNKT. Avec cette stratégie, on observe une importante inhibition de métastases expérimentales aux poumons et de tumeurs sous-cutanées, même lorsque le traitement systémique est commencé 2 à 7 jours après la greffe des cellules de mélanome B16 transfectées avec l'antigène HER2. Dans les mêmes conditions le traitement avec l'αGalCer seul est inefficace. L'activité anti-tumorale de la protéine sCDld-anti-HER2 est associée à son accumulation spécifique dans des tumeurs exprimant le HER2 ainsi qu'avec une accumulation des cellules iNKT, NK et T à la tumeur. En conclusion, l'activation prolongée des cellules iNKT redirigées à la tumeur par des molécules récombinantes αGalCer/sCD1d conduit à l'activation de la réponse innée et adaptative au site tumoral, offrant une nouvelle stratégie prometteuse d'immunothérapie contre le cancer.

HARNESSING iNKT CELLS WITH RECOMBINANT CD1d FUSION PROTEINS TO REDIRECT INNATE AND ADAPTIVE IMMUNITY TO THE TUMOR

Les thérapies du cancer, comme la radiothérapie et la chimiothérapie, sont couramment utilisées mais ont de nombreux effets secondaires. Ces thérapies invasives pour le patient nécessitent d'être améliorées et de nombreuses avancées ont été faites afin d'adapter et de personnaliser le traitement du cancer. L'immunothérapie a pour but de renforcer le système immunitaire du patient et de le rediriger de manière spécifique contre la tumeur. Dans notre projet, nous activons les lymphocytes Invariant Natural Killer T (iNKT) afin de mettre en place une immunothérapie innovatrice contre le cancer. Les cellules iNKT sont une unique sous-population de lymphocytes T qui ont la particularité de réunir les propriétés de l'immunité innée ainsi qu'adaptative. En effet, les cellules iNKT expriment à leur surface des molécules présentes aussi sur les cellules tueuses NK, caractéristique de l'immunité innée, ainsi qu'un récepteur de cellules T (TCR) qui représente l'immunité adaptative. Les cellules iNKT reconnaissent avec leur TCR des antigènes présentés par la molécule CD1d. Les antigènes sont des protéines, des polysaccharides ou des lipides reconnus par les cellules du système immunitaire ou les anticorps pour engendrer une réponse immunitaire. Dans le cas des cellules iNKT, l'alpha-galactosylceramide (αGC) est un antigène lipidique fréquemment utilisé dans les études cliniques comme puissant activateur. Après l'activation des cellules iNKT avec l'αGC, celles-ci produisent abondamment et rapidement des cytokines. Ces cytokines sont des molécules agissant comme des signaux activateurs d'autres cellules du système immunitaire telles que les cellules NK et les lymphocytes T. Cependant, les cellules iNKT deviennent anergiques après un seul traitement avec l'αGC c'est à dire qu'elles ne peuvent plus être réactivées, ce qui limite leur utilisation dans l'immunothérapie du cancer. Dans notre groupe, Stirnemann et al ont publié une molécule recombinante innovante, composée de la molécule CD1d soluble et chargée avec le ligand αGC (αGC/sCD1d). Cette protéine est capable d'activer les cellules iNKT tout en évitant l'anergie. Dans le système immunitaire, les anticorps sont indispensables pour combattre une infection bactérienne ou virale. En effet, les anticorps ont la capacité de reconnaître et lier spécifiquement un antigène et permettent l'élimination de la cellule qui exprime cet antigène. Dans le domaine de l'immunothérapie, les anticorps sont utilisés afin de cibler des antigènes présentés seulement par la tumeur. Ce procédé permet de réduire efficacement les effets secondaires lors du traitement du cancer. Nous avons donc fusionné la protéine recombinante αGC/CD1d à un fragment d'anticorps qui reconnaît un antigène spécifique des cellules tumorales. Dans une étude préclinique, nous avons démontré que la protéine αGC/sCD1d avec un fragment d'anticorps dirigé contre la tumeur engendre une meilleure activation des cellules iNKT et entraîne un effet anti-tumeur prolongé. Cet effet anti-tumeur est augmenté comparé à une protéine αGC/CD1d qui ne cible pas la tumeur. Nous avons aussi montré que l'activation des cellules iNKT avec la protéine αGC/sCD1d-anti-tumeur améliore l'effet anti- tumoral d'un vaccin pour le cancer. Lors d'expériences in vitro, la protéine αGC/sCD1d-anti- tumeur permet aussi d'activer les cellules humaines iNKT et ainsi tuer spécifiquement les cellules tumorales humaines. La protéine αGC/sCD1d-anti-tumeur représente une alternative thérapeutique prometteuse dans l'immunothérapie du cancer. - Les cellules Invariant Natural Killer T (iNKT), dont les effets anti-tumoraux ont été démontrés, sont de puissants activateurs des cellules Natural Killer (NK), des cellules dendritiques (DC) et des lymphocytes T. Cependant, une seule injection du ligand de haute affinité alpha-galactosylceramide (αGC) n'induit une forte activation des cellules iNKT que durant une courte période. Celle-ci est alors suivie d'une longue phase d'anergie, limitant ainsi leur utilisation pour la thérapie. Comme alternative prometteuse, nous avons montré que des injections répétées d'αGC chargé sur une protéine recombinante de CD1d soluble (αGC/sCD1d) chez la souris entraînent une activation prolongée des cellules iNKT, associée à une production continue de cytokine. De plus, le maintien de la réactivité des cellules iNKT permet de prolonger l'activité anti-tumorale lorsque la protéine αGC/sCD1d est fusionnée à un fragment d'anticorps (scFv) dirigé contre la tumeur. L'inhibition de la croissance tumorale n'est optimale que lorsque les souris sont traitées avec la protéine αGC/sCD1d-scFv ciblant la tumeur, la protéine αGC/sCD1d-scFv non-appropriée étant moins efficace. Dans le système humain, les protéines recombinantes αGC/sCD1d-anti-HER2 et anti-CEA sont capables d'activer et de faire proliférer des cellules iNKT à partir de PBMCs issues de donneurs sains. De plus, la protéine αGC/sCD1d-scFv a la capacité d'activer directement des clones iNKT humains en l'absence de cellules présentatrices d'antigènes (CPA), contrairement au ligand αGC libre. Mais surtout, la lyse des cellules tumorales par les iNKT humaines n'est obtenue que lorsqu'elles sont incubées avec la protéine αGC/sCD1d-scFv anti- tumeur. En outre, la redirection de la cytotoxicité des cellules iNKT vers la tumeur est supérieure à celle obtenue avec une stimulation par des CPA chargées avec l'αGC. Afin d'augmenter les effets anti-tumoraux, nous avons exploité la capacité des cellules iNKT à activer l'immunité adaptive. Pour ce faire, nous avons combiné l'immunothérapie NKT/CD1d avec un vaccin anti-tumoral composé d'un peptide OVA. Des effets synergiques ont été obtenus lorsque les traitements avec la protéine αGC/sCD1d-anti-HER2 étaient associés avec le CpG ODN comme adjuvant pour la vaccination avec le peptide OVA. Ces effets ont été observés à travers l'activation de nombreux lymphocytes T CD8+ spécifique de la tumeur, ainsi que par la forte expansion des cellules NK. Les réponses, innée et adaptive, élevées après le traitement avec la protéine αGC/sCD1d-anti-HER2 combinée au vaccin OVA/CpG ODN étaient associées à un fort ralentissement de la croissance des tumeurs B16- OVA-HER2. Cet effet anti-tumoral corrèle avec l'enrichissement des lymphocytes T CD8+ spécifiques observé à la tumeur. Afin d'étendre l'application des protéines αGC/sCD1d et d'améliorer leur efficacité, nous avons développé des fusions CD1d alternatives. Premièrement, une protéine αGC/sCD1d dimérique, qui permet d'augmenter l'avidité de la molécule CD1d pour les cellules iNKT. Dans un deuxième temps, nous avons fusionné la protéine αGC/sCD1d avec un scFv dirigé contre le récepteur 3 du facteur de croissance pour l'endothélium vasculaire (VEGFR-3), afin de cibler l'environnement de la tumeur. Dans l'ensemble, ces résultats démontrent que la thérapie médiée par la protéine recombinante αGC/sCD1d-scFv est une approche prometteuse pour rediriger l'immunité innée et adaptive vers le site tumoral. - Invariant Natural Killer T cells (iNKT) are potent activators of Natural Killer (NK), dendritic cells (DC) and T lymphocytes, and their anti-tumor activities have been well demonstrated. However, a single injection of the high affinity CD1d ligand alpha-galactosylceramide (αGC) leads to a strong but short-lived iNKT cell activation followed by a phase of long-term anergy, limiting the therapeutic use of this ligand. As a promising alternative, we have demonstrated that when αGC is loaded on recombinant soluble CD1d molecules (αGC/sCD1d), repeated injections in mice led to the sustained iNKT cell activation associated with continued cytokine secretion. Importantly, the retained reactivity of iNKT cell led to prolonged antitumor activity when the αGC/sCD1d was fused to an anti-tumor scFv fragments. Optimal inhibition of tumor growth was obtained only when mice were treated with the tumor-targeted αGC/CD1d-scFv fusion, whereas the irrelevant αGC/CD1d-scFv fusion was less efficient. When tested in a human system, the recombinant αGC/sCD1d-anti-HER2 and -anti-CEA fusion proteins were able to expand iNKT cells from PBMCs of healthy donors. Furthermore, the αGC/sCD1d-scFv fusion had the capacity to directly activate human iNKT cells clones without the presence of antigen-presenting cells (APCs), in contrast to the free αGC ligand. Most importantly, tumor cell killing by human iNKT cells was obtained only when co- incubated with the tumor targeted sCD1d-antitumor scFv, and their direct tumor cytotoxicity was superior to the bystander killing obtained with αGC-loaded APCs stimulation. To further enhance the anti-tumor effects, we exploited the ability of iNKT cells to transactivate the adaptive immunity, by combining the NKT/CD1d immunotherapy with a peptide cancer vaccine. Interestingly, synergistic effects were obtained when the αGC/sCD1d- anti-HER2 fusion treatment was combined with CpG ODN as adjuvant for the OVA peptide vaccine, as seen by higher numbers of activated antigen-specific CD8 T cells and NK cells, as compared to each regimen alone. The increased innate and adaptive immune responses upon combined tumor targeted sCD1d-scFv treatment and OVA/CpG vaccine were associated with a strong delay in B16-OVA-HER2 melanoma tumor growth, which correlated with an enrichment of antigen-specific CD8 cells at the tumor site. In order to extend the application of the CD1d fusion, we designed alternative CD1d fusion proteins. First, a dimeric αGC/sCD1d-Fc fusion, which permits to augment the avidity of the CD1d for iNKT cells and second, an αGC/sCD1d fused to an anti vascular endothelial growth factor receptor-3 (VEGFR-3) scFv, in order to target tumor stroma environment. Altogether, these results demonstrate that the iNKT-mediated immunotherapy via recombinant αGC/sCD1d-scFv fusion is a promising approach to redirect the innate and adaptive antitumor immune response to the tumor site.