Oxidação de proteínas por oxigênio singlete: mecanismos de dano, estratégias para detecção e implicações biológicas

Proteins are potential targets for singlet molecular oxygen (¹O2) oxidation. Damages occur only at tryptophan, tyrosine, histidine, methionine, and cysteine residues at physiological pH, generating oxidized compounds such as hydroperoxides. Therefore, it is important to understand the mechanisms by which ¹O2, hydroperoxides and other oxidized products can trigger further damage. The improvement and development of new tools, such as clean sources of ¹O2 and isotopic labeling approaches in association with HPLC/mass spectrometry detection will allow one to elucidate mechanistic features involving ¹O2-mediated protein oxidation.

The antioxidant action of Polypodium leucotomos extract and kojic acid: reactions with reactive oxygen species

Two natural products Polypodium leucotomos extract (PL) and kojic acid (KA) were tested for their ability to scavenge reactive oxygen species (·OH, ·O2-, H2O2, ¹O2) in phosphate buffer. Hydroxyl radicals were generated by the Fenton reaction, and the rate constants of scavenging were 1.6 x 10(9) M-1 s-1 for KA and 1.0 x 10(9) M-1 s-1 for PL, similar to that of ethanol (1.4 x 10(9) M-1 s-1). With superoxide anions generated by the xanthine/hypoxanthine system, KA and PL (0.2-1.0 mg/ml) inhibited ·O2-dependent reduction of nitroblue tetrazolium by up to 30 and 31%, respectively. In the detection of ¹O2 by rose bengal irradiation, PL at 1.0 mg/ml quenched singlet oxygen by 43% relative to azide and KA by 36%. The present study demonstrates that PL showed an antioxidant effect, scavenging three of four reactive oxygen species tested here. Unlike KA, PL did not significantly scavenge hydrogen peroxide.

Alternative electron transfer routes involved in photoprotection of cyanobacteria

In oxygenic photosynthesis, the highly oxidizing reactions of water splitting produce reactive oxygen species (ROS) and other radicals that could damage the photosynthetic apparatus and affect cell viability. Under particular environmental conditions, more electrons are produced in water oxidation than can be harmlessly used by photochemical processes for the reduction of metabolic electron sinks. In these circumstances, the excess of electrons can be delivered, for instance, to O2, resulting in the production of ROS. To prevent detrimental reactions, a diversified assortment of photoprotection mechanisms has evolved in oxygenic photosynthetic organisms. In this thesis, I focus on the role of alternative electron transfer routes in photoprotection of the cyanobacterium Synechocystis sp. PCC 6803. Firstly, I discovered a novel subunit of the NDH-1 complex, NdhS, which is necessary for cyclic electron transfer around Photosystem I, and provides tolerance to high light intensities. Cyclic electron transfer is important in modulating the ATP/NADPH ratio under stressful environmental conditions. The NdhS subunit is conserved in many oxygenic phototrophs, such as cyanobacteria and higher plants. NdhS has been shown to link linear electron transfer to cyclic electron transfer by forming a bridge for electrons accumulating in the Ferredoxin pool to reach the NDH-1 complexes. Secondly, I thoroughly investigated the role of the entire flv4-2 operon in the photoprotection of Photosystem II under air level CO2 conditions and varying light intensities. The operon encodes three proteins: two flavodiiron proteins Flv2 and Flv4 and a small Sll0218 protein. Flv2 and Flv4 are involved in a novel electron transport pathway diverting electrons from the QB pocket of Photosystem II to electron acceptors, which still remain unknown. In my work, it is shown that the flv4-2 operon-encoded proteins safeguard Photosystem II activity by sequestering electrons and maintaining the oxidized state of the PQ pool. Further, Flv2/Flv4 was shown to boost Photosystem II activity by accelerating forward electron flow, triggered by an increased redox potential of QB. The Sll0218 protein was shown to be differentially regulated as compared to Flv2 and Flv4. Sll0218 appeared to be essential for Photosystem II accumulation and was assigned a stabilizing role for Photosystem II assembly/repair. It was also shown to be responsible for optimized light-harvesting. Thus, Sll0218 and Flv2/Flv4 cooperate to protect and enhance Photosystem II activity. Sll0218 ensures an increased number of active Photosystem II centers that efficiently capture light energy from antennae, whilst the Flv2/Flv4 heterodimer provides a higher electron sink availability, in turn, promoting a safer and enhanced activity of Photosystem II. This intertwined function was shown to result in lowered singlet oxygen production. The flv4-2 operon-encoded photoprotective mechanism disperses excess excitation pressure in a complimentary manner with the Orange Carotenoid Protein-mediated non-photochemical quenching. Bioinformatics analyses provided evidence for the loss of the flv4-2 operon in the genomes of cyanobacteria that have developed a stress inducible D1 form. However, the occurrence of various mechanisms, which dissipate excitation pressure at the acceptor side of Photosystem II was revealed in evolutionarily distant clades of organisms, i.e. cyanobacteria, algae and plants.

Zur Reaktionskinetik der Oxidation von Kohlenstoffmaterialien aus Biomasse

Zur Modellierung von Vergasungs- und Verbrennungsprozessen zur energetischen Nutzung von Biomasse ist die Kenntnis von reaktionskinetischen Daten für die Sauerstoff-Oxidation von Biomassepyrolysaten erforderlich. Eine ausführliche Literaturübersicht zeigt den Stand der Forschung bezüglich der experimentellen Ermittlung von reaktionskinetischen Parametern für die Oxidation von Pyrolysaten aus Lignin, Cellulose und pflanzlicher Biomasse sowie der Suche nach einem plausiblen Reaktionsmechanismus für die Reaktion von Sauerstoff mit festen Kohlenstoffmaterialien. Es wird eine Versuchsanlage mit einem quasistationär betriebenen Differentialreaktor konstruiert, die eine Messung der Reaktionskinetik und der reaktiven inneren Oberfläche (RSA) für die Reaktion eines Pyrolysats aus Maispflanzen mit Sauerstoff ermöglicht. Die getrockneten und zerkleinerten Maispflanzen werden 7 Minuten lang bei 1073 K in einem Drehrohrofen pyrolysiert. Das Pyrolysat zeichnet sich vor allem durch seine hohe Porosität von über 0,9 und seinen hohen Aschegehalt von 0,24 aus. Die RSA wird nach der Methode der Messung von Übergangskinetiken (TK) bestimmt. Die Bestimmung der RSA erfolgt für die Reaktionsprodukte CO und CO2 getrennt, für die entsprechend ermittelten Werte werden die Bezeichnungen CO-RSA und CO2-RSA eingeführt. Die Abhängigkeit dieser Größen von der Sauerstoffkonzentration läßt sich durch eine Langmuir-Isotherme beschreiben, ebenso das leichte Absinken der CO-RSA mit der Kohlendioxidkonzentration. Über dem Abbrand zeigen sich unterschiedliche Verläufe für die CO-RSA, CO2-RSA und die innere Oberfläche nach der BET-Methode. Zur Charakterisierung der Oberflächenzwischenprodukte werden temperaturprogrammierte Desorptionsversuche (TPD) durchgeführt. Die Ergebnisse zeigen, daß eine Unterscheidung in zwei Kohlenstoff-Sauerstoff-Oberflächenkomplexe ausreichend ist. Die experimentellen Untersuchungen zum Oxidationsverlauf werden im kinetisch bestimmten Bereich durchgeführt. Dabei werden die Parameter Temperatur, Sauerstoff-, CO- und CO2-Konzentration variiert. Anhand der Ergebnisse der reaktionskinetischen Untersuchungen wird ein Reaktionsmechanismus für die Kohlenstoff-Sauerstoff-Reaktion entwickelt. Dieser Reaktionsmechanismus umfaßt 7 Elementarreaktionen, für welche die reaktionskinetischen Parameter numerisch ermittelt werden. Darüber hinaus werden reaktionskinetische Parameter für einfachere massenbezogene Reaktionsgeschwindigkeitsansätze berechnet und summarische Reaktionsgeschwindigkeitsansätze für die Bildung von CO und CO2 aus dem Reaktionsmechanismus hergeleitet.

Phototransformation of hematoporphyrin in aqueous solution: Anomalous behavior at low oxygen concentration

The photoactivation of a photosensitizer is the initial step in photodynamic therapy (PDT) where photochemical reactions result in the production of reactive oxygen species and eventually cell death. In addition to oxidizing biomolecules, some of these photochemical reactions lead to photosensitizer degradation at a rate dependent on the oxygen concentration among other factors. We investigated photodegradation of Photogem A (R) (28 mu M), a hematoporphyrin derivative, at different oxygen concentrations (9.4 to 625.0 mu M) in aqueous solution. The degradation was monitored by fluorescence spectroscopy. The degradation rate (M/s) increases as the oxygen concentration increases when the molar ratio of oxygen to PhotogemA (R) is greater than 1. At lower oxygen concentrations (< 25 mu M) an inversion of this behavior was observed. The data do not fit a simple kinetic model of first-order dependence on oxygen concentration. This inversion of the degradation rate at low oxygen concentration has not previously been demonstrated and highlights the relationship between photosensitizer and oxygen concentrations in determining the photobleaching mechanism(s). The findings demonstrate that current models for photobleaching are insufficient to explain completely the effects at low oxygen concentration.

A combination of techniques to evaluate photodynamic efficiency of photosensitizers

Photodynamic therapy, used mainly for cancer treatment and microorganisms inaction, is based on production of reactive oxygen species by light irradiation of a sensitizer. Hematoporphyrin derivatives as Photofrin (R) (PF) Photogem (R) (PG) and Photosan (R) (PF), and chlorin-c6-derivatives as Photodithazine (R)(PZ), have suitable sensitizing properties. The present study provides a way to make a fast previous evaluation of photosensitizers efficacy by a combination of techniques: a) use of brovine serum albumin and uric acid as chemical dosimeters; b) photo-hemolysis of red blood cells used as a cell membrane interaction model, and c) octanol/phosphate buffer partition to assess the relative lipophilicity of the compounds. The results suggest the photodynamic efficient rankings PZ > PG >= PF > PS. These results agree with the cytotoxicity of the photosensitizers as well as to chromatographic separation of the HpDs, both performed in our group, showing that the more lipophilic is the dye, the more acute is the damage to the RBC membrane and the oxidation of indol, which is immersed in the hydrophobic region of albumin.

Superoxide radical protects liposome-contained cytochrome c against oxidative damage promoted by peroxynitrite and free radicals

The effects of nitrosative species on cyt c structure and peroxidase activity were investigated here in the presence of O(2)(center dot-) and anionic and zwitterionic vesicles. Nitrosative species were generated by 3-morpholinesydnonymine (SIN1) decomposition, using cyt c heme iron and/or molecular oxygen as electron acceptor. Far-and near-UV CD spectra of SIN1-treated cyt c revealed respectively a slight decrease of a-helix content (from 39 to 34%) and changes in the tryptophan structure accompanied by increased fluorescence. The Soret CD spectra displayed a significant decrease of the positive signal at 403 nm. EPR spectra revealed the presence of a low-spin cyt c form (S = 1/2) with g(1) = 2.736, g(2) = 2.465, and g(3) = 2.058 after incubation with SIN1. These data suggest that the concomitant presence of NO(center dot) and O(2)(center dot-) generated from dissolved oxygen, in a system containing cyt c and liposomes, promotes chemical and conformational modi. cations in cyt c, resulting in a hypothetical bis-histidine hexacoordinated heme iron. We also show that, paradoxically, O(2)(center dot-) prevents not only membrane lipoperoxidation by peroxide-derived radicals but also oxidation of cyt c itself due to the ability of O(2)(center dot-) to reduce heme iron. Finally, lipoperoxidation measurements showed that, although it is a more efficient peroxidase, SIN1-treated cyt c is not more effective than native cyt c in promoting damage to anionic liposomes in the presence of tert-ButylOOH, probably due to loss of affinity with negatively charged lipids. (C) 2009 Elsevier Inc. All rights reserved.

The role of mitochondrial DNA damage in the citotoxicity of reactive oxygen species

Mitochondria contain their own genome, a small circular molecule of around 16.5 kbases. The mitochondrial DNA (mtDNA) encodes for only 13 polypeptides, but its integrity is essential for mitochondrial function, as all 13 proteins are regulatory subunits of the oxidative phosphorylation complexes. Nonetheless, the mtDNA is physically associated with the inner mitochondrial membrane, where the majority of the cellular reactive oxygen species are generated. In fact, the mitochondrial DNA accumulates high levels of oxidized lesions, which have been associated with several pathological and degenerative processes. The cellular responses to nuclear DNA damage have been extensively studied, but so far little is known about the functional outcome and cellular responses to mtDNA damage. In this review we will discuss the mechanisms that lead to damage accumulation and the in vitro models we are establishing to dissect the cellular responses to oxidative damage in the mtDNA and to sort out the differential cellular consequences of accumulation of damage in each cellular genome, the nuclear and the mitochondrial genome.

Sistemas bioinspirados aplicados no estudo de interação e sensoriamento de derivados xantênicos

Fundação de Amparo à Pesquisa do Estado de São Paulo (FAPESP)

Photo-activated phase separation in giant vesicles made from different lipid mixtures

Using giant unilamellar vesicles (GUVs) made from POPC. DPPC, cholesterol and a small amount of a porphyrin-based photosensitizer that we name PE-porph, we investigated the response of the lipid bilayer under visible light, focusing in the formation of domains during the lipid oxidation induced by singlet oxygen. This reactive species is generated by light excitation of PE-porf in the vicinity of the membrane, and thus promotes formation of hydroperoxides when unsaturated lipids and cholesterol are present. Using optical microscopy we determined the lipid compositions under which GUVs initially in the homogeneous phase displayed Lo-Ld phase separation following irradiation. Such an effect is attributed to the in situ formation of both hydroperoxized POPC and cholesterol. The boundary line separating homogeneous Lo phase and phase coexistence regions in the phase diagram is displaced vertically towards the higher cholesterol content in respect to ternary diagram of POPC:DPPC:cholesterol mixtures in the absence of oxidized species. Phase separated domains emerge from sub-micrometer initial sizes to evolve over hours into large Lo-Ld domains completely separated in the lipid membrane. This study provides not only a new tool to explore the kinetics of domain formation in mixtures of lipid membranes, but may also have implications in biological signaling of redox misbalance. (C) 2011 Elsevier B.V. All rights reserved.

Einzelmolekülspektroskopie an einer homologen Reihe von Rylendiimiden und an einem bichromophoren Modellsystem für elektronischen Energietransfer

In dieser Arbeit wurden Untersuchungen zur Fluoreszenzdynamik und zum Mechanismus des Photobleichens einzelner Farbstoffmoleküle einer homologen Reihe von Rylentetracarbonsäurediimiden durchgeführt. Mit der Erweiterung des elektronischen π-Systems verringert sich die HOMO/LUMO-Energiedifferenz, so dass strahlungslose Relaxationsprozesse gemäß des Energielückengesetzes zunehmen. Die konfokale Einzelmolekülspektroskopie in Kombination mit zeitkorrelierter Einzelphotonenzählung ermöglicht es, Fluktuationen der inneren Konversionsrate zu detektieren. Der limitierende Faktor jedes Einzelmolekülexperiments ist die Photostabilität der Moleküle. Für die homologe Reihe konnten mindestens zwei Photobleichmechanismen identifiziert werden. Wenn Singulett-Sauerstoff durch Selbstsensibilisierung erzeugt werden kann, ist unter Luft die Photooxidation der wahrscheinlichste Mechanismus. Unter Ausschluss von Luftsauerstoff spielt die Bildung langlebiger Dunkelzustände eine entscheidende Rolle, die bevorzugt über höher angeregte Triplett- und Singulett-Zustände abläuft. Es wird angenommen, dass es sich hierbei um einen reversiblen Ionisierungsprozess handelt, bei dem das Radikal-Kation der Rylendiimide gebildet wird. Es konnte gezeigt werden, dass durch eine geeignete Wahl der Anregungsbedingungen die Dunkelzustandspopulierung verhindert und zugleich die Photostabilität der Fluorophore deutlich erhöht wird. Durch die Verknüpfung der beiden niedrigsten Homologen erhält man ein Donor-Akzeptor-Modellsystem, bei dem die Anregungsenergie mit hoher Effizienz vom Donor- auf den Akzeptor-Chromophor übertragen wird. In der Fluoreszenz einzelner Bichromophore wurden bei selektiver Anregung des Donors kollektive Auszeiten beobachtet, die durch effiziente Singulett-Triplett-Annihilation verursacht werden.

Isotopic study of ceria-catalyzed soot oxidation in the presence of NOx

The ceria-catalyzed soot oxidation mechanism has been studied by a pulse technique with labeled O2 in the absence and presence of NO, using ceria–soot mixtures prepared in the loose contact mode. In the absence of soot, the ceria-catalyzed oxidation of NO to NO2 takes place with ceria oxygen and not with gas-phase O2. However, the oxygen exchange process between gas-phase O2 and ceria oxygen (to yield back O2, but with oxygen atoms coming from ceria) prevailed with regard to the ceria-catalyzed oxidation of NO to NO2. Gas-phase O2 did not react directly with soot when pulsed to a soot–ceria loose contact mixture. Instead, ceria oxygen is transferred to soot (this step does not require gas-phase molecular oxygen to be present), and gas-phase O2 fills up the vacancies created on the oxide in a further step. The transfer of oxygen between ceria and soot occurred directly in the absence of NO. However, in the presence of NO, NO2 is expected to be additionally generated by ceria oxygen oxidation, which also reacts with soot. The main reaction products of the ceria-catalyzed soot oxidation reaction with NO/O2 were CO2 and NO. Additionally, evidence of the reduction of NOx to N2 was found.

Novel chromone and xanthone derivatives: Synthesis and ROS/RNS scavenging activities

Chromones and xanthones are oxygen-containing heterocyclic compounds acknowledged by their antioxidant properties. In an effort to develop novel agents with improved activity, a series of compounds belonging to these chemical classes were prepared. Their syntheses involve the condensation of appropriate 2-methyl-4H-chromen-4-ones, obtained via Baker-Venkataraman rearrangement, with (E)-3-(3,4-dimethoxyphenyl)acrylaldehyde to provide the corresponding 2-[(1E,3E)-4-(3,4-dimethoxyphenyl)buta-1,3-dien-1-yl]-4H-chromen-4-ones. Subsequent electrocyclization and oxidation of these compounds led to the synthesis of 1-aryl-9H-xanthen-9-ones. After cleavage of the protecting groups, hydroxylated chromones and xanthones were assessed as scavenging agents against both reactive oxygen species (ROS) [superoxide radical (O2(•-)), hydrogen peroxide (H2O2), hypochlorous acid (HOCl), singlet oxygen ((1)O2), and peroxyl radical (ROO(•))] and reactive nitrogen species (RNS) [nitric oxide ((•)NO) and peroxynitrite anion (ONOO(-))]. Generally, all the tested new hydroxylated chromones and xanthones exhibited scavenger effects dependent on the concentration, with IC50 values found in the micromolar range. Some of them were shown to have improved scavenging activity when compared with previously reported analogues, allowing the inference of preliminary conclusions on the structure-activity relationship.

Synergistischer photoinduzierter Schadstoffabbau mittels eines Porphyrazin-Titandioxid-Hybrids

Die zunehmende Luftverschmutzung aufgrund des steigenden Energiebedarfs und Mobilitätsanspruchs der Bevölkerung, insbesondere in urbanen Gebieten, erhöht das Gefährdungspotential für die Gesundheit und verschlechtert so die Lebensqualität. Neben der Vermeidung von Emissionen toxischer Gase als mittel- und langfristig optimale Maßnahme zur Verbesserung der Luftqualität, stellt der Abbau emittierter Luftschadstoffe ein geeignetes und kurzfristig wirksames Mittel dar. Ein solcher Abbau kann durch Photokatalyse erzielt werden, allerdings nutzen Photokatalysatoren, die auf dem Halbleiter Titandioxid (TiO2) basieren, das solare Emissionsspektrum nur geringfüfig aus und sind in Innenräumen und anderen UV-schwachen Bereichen nicht wirksam. Um diese Nachteile zu überwinden, wurde ein Photokatalysator entwickelt und hergestellt, der aus TiO2 (P25) als UV-aktiver Photokatalysator und als Trägermaterial sowie einem seinerseits im Vis-Bereich photoaktiven Porphyrazin-Farbstoff als Beschichtung besteht. Die sterisch anspruchsvollen und in der Peripherie mit acht Bindungsmotiven für TiO2 versehenen Farbstoffmoleküle wurden zu diesem Zweck auf der Halbleiteroberfläche immobilisiert. Die so gebildeten Porphyrazin-Titandioxid-Hybride wurde ausführlich charakterisiert. Dabei wurden unter anderem die Bindung der Farbstoffe auf der Titandioxidoberfläche mittels Adsorptionsisothermen und die UV/Vis-spektroskopischen Eigenschaften des Hybridmaterials untersucht. Zur Bestimmung der photokatalytischen Aktivitäten der Einzelkomponenten und des Hybridmaterials wurden diese auf die Fähigkeit zur Bildung von Singulett-Sauerstoff, Wasserstoffperoxid und Hydroxylradikalen hin sowie in einem an die ISO-22197-1 angelehnten Verfahren auf die Fähigkeit zum Abbau von NO hin jeweils bei Bestrahlung in drei Wellenlängenbereichen (UV-Strahlung, blaues Licht und rotes Licht) geprüft. Darüber hinaus konnte die Aktivität des Hybridmaterials bei der Photodynamischen Inaktivierung (PDI) von Bakterien unter UV- und Rotlichtbestrahlung im Vergleich zum reinen Ttandioxid bestimmt werden. Die Charakterisierung des Hybridmaterials ergab, dass die Farbstoffmoleküle in einer neutralen Suspension nahezu irreversibel in einer monomolekularen Schicht mit einer Bindungsenergie von -41.43 kJ/mol an die Oberfläche gebunden sind und das Hybridmaterial mit hohen Extinktionskoeffizienten von bis zu 105 M-1cm-1 in großen Bereichen des UV/Vis-Spektrums Photonen absorbiert. Das Spektrum des Hybridmaterials setzt sich dabei additiv aus den beiden Einzelspektren zusammen. Die Auswirkungen der Charakterisierungsergebnisse auf die Bildung reaktiver Sauerstoffspezies wurden ausführlich diskutiert. Der Vergleich der Aktivitäten in Bezug auf die Bildung der reaktiven Sauerstoffspezies zeigte, dass die Aktivität des Hybridmaterials bis auf die bei der Bildung von Hydroxylradikalen unter UV-Bestrahlung in allen Versuchen deutlich höher war als die Aktivität des reinen Titandioxids. Im Gegensatz zu reinem Titandioxid erzeugte das Hybridmaterial in allen untersuchten Wellenlängenbereichen Mengen an Singulett-Sauerstoff, die photophysikalisch eindeutig detektierbar waren. Zur Erklärung und Deutung dieser Beobachtungen wurde eine differenzierte Diskussion geführt, die die Ergebnisse der Hybridpartikelcharakterisierung aufgreift und implementiert. Der Vergleich der NO-Abbaueffizienzen ergab bei allen Experimenten durchgängig deutlich höhere Werte für das Hybridmaterial. Zudem wurden durch das Hybridmaterial nachgewiesenermaßen wesentlich geringere Mengen des unerwünschten Nebenprodukts des Abbaus (NO2) gebildet. Im Zuge der Diskussion wurden verschiedene mögliche Mechanismen der „sauberen“ Oxidation zu Nitrat durch das Hybridmaterial vorgestellt. Untersuchungen zur Photodynamischen Inaktivierung verschiedener Bakterien ergaben, dass das Hybridmaterial neben einer zu P25 ähnlichen Aktivität unter UV-Bestrahlung, anders als P25, auch eine PDI verschiedener Bakterien unter Rotlichtbestrahlung erreicht.

Octahedral molybdenum cluster complexes with aromatic sulfonate ligands

This article describes the synthesis, structures and systematic study of the spectroscopic and redox properties of a series of octahedral molybdenum metal cluster complexes with aromatic sulfonate ligands (nBu4N)2[{Mo6X8}(OTs)6] and (nBu4N)2[{Mo6X8}(PhSO3)6] (where X- is Cl-, Br- or I-; OTs- is p-toluenesulfonate and PhSO3 - is benzenesulfonate). All the complexes demonstrated photoluminescence in the red region and an ability to generate singlet oxygen. Notably, the highest quantum yields (>0.6) and narrowest emission bands were found for complexes with a {Mo6I8}4+ cluster core. Moreover, cyclic voltammetric studies revealed that (nBu4N)2[{Mo6X8}(OTs)6] and (nBu4N)2[{Mo6X8}(PhSO3)6] confer enhanced stability towards electrochemical oxidation relative to corresponding starting complexes (nBu4N)2[{Mo6X8}X6].