PCR Multiplex fluorescente para detecção de bactérias em sêmen bovino

Este estudo teve como objetivo avaliar o limiar de detecção da técnica de PCR multiplex fluorescente aliada a eletroforese capilar na detecção de agentes infecciosos em amostras de sêmen experimentalmente contaminadas com concentrações decrescentes das bactérias Brucella abortus, Leptospira interrogans sorovar pomona, Campylobacter fetus e Haemophilus somnus. Amostras de sêmen bovino foram experimentalmente contaminadas com concentrações decrescentes de bactérias obtidas através de diluições seriadas na base 10 de modo a obter-se amostras contendo desde 1 vez até 10-7 bactérias/mL a partir da concentração inicial de Leptospira pomona, Brucella abortus, Campylobacter fetus e Haemophilus somnus. As diluições foram efetuadas individualmente para cada bactéria, bem como nas diferentes concentrações necessárias para a padronização do teste de multiplex PCR. As extrações de DNA de todas as soluções contendo espermatozóides e bactérias analisadas no presente estudo foram realizadas segundo protocolo descrito por Heinemann et al. (2000). Os produtos de PCR multiplex foram avaliados por eletroforese em gel de poliacrilamida 8% e separação eletroforética por sistema capilar em equipamento automático de análise de fragmentos de DNA MegaBace. Observou-se a amplificação de fragmentos de 193pb, 330pb, 400pb e 415pb a partir do DNA de B. abortus, L. pomona, H. somnus, C. fetus, respectivamente. Na análise por eletroforese capilar de produtos da PCR multiplex do DNA para detecção simultânea dos quatro patógenos observou-se a sinal de positividade até a diluição de 10-3 bactérias/mL vezes da concentração inicial da solução estoque de cada bactéria. A técnica de PCR multiplex aliada à eletroforese capilar foi usada pela primeira vez para o diagnóstico direto de quatro bactérias patogênicas no sêmen, demonstrando ser um método rápido na detecção de bactérias causadoras de doenças reprodutivas.

Qualidade espermática de sêmen de cães naturalmente infectados por Leishmania sp:

Fundação de Amparo à Pesquisa do Estado de São Paulo (FAPESP)

Colheita de sêmen por eletroejaculação em cutia-parda (Dasyprocta azarae)

As cutias são animais que vivem nas Américas Central e do Sul, com potencial zootécnico e que despertam crescente interesse científico. O objetivo deste estudo foi estabelecer um padrão para colheita de sêmen por eletroejaculação em cutia-parda (Dasyprocta azarae). Foram utilizados machos adultos (n=4) anestesiados e submetidos a quatro séries de 20 estímulos eletroejaculatórios, com 3 segundos de duração cada, com uma intensidade de 2, 4, 6 e 8 volts, com dois minutos de intervalo entre cada série. A colheita de sêmen foi obtida em todos os animais, com ereção parcial com 2 volts, ereção evidente com 4 volts, ejaculação com 6 volts e exacerbação da glande e exteriorização das espículas penianas com 8 volts, observando-se espermatozoides em 100% das amostras. A técnica descrita para colheita de sêmen em cutia-parda foi eficaz.

Efeito do bimestre dentro da estação de monta sobre a fertilidade de éguas inseminadas com sêmen diluído, resfriado e transportado

Este estudo avaliou os efeitos de diferentes bimestres dentro da estação de monta sobre características reprodutivas de éguas. Foram utilizados 147 ciclos estrais de 100 éguas, por duas estações de monta consecutivas, com controle folicular por palpação retal diária e inseminação artificial com sêmen diluído, resfriado e transportado a 14ºC por 3,5 horas. Os grupos experimentais foram constituídos segundo cada bimestre da estação, a saber outubro/novembro, dezembro/janeiro e fevereiro/março, de acordo com a data de ovulação de cada ciclo estral. Os resultados demonstraram (na ordem citada dos bimestres) melhor taxa de concepção ao primeiro ciclo em dezembro/janeiro (42,9%; 70,0%, 28,6%), melhor taxa de concepção por ciclo também em dezembro/janeiro (45,6%; 63,5%; 29,6%), e melhor eficiência de prenhez em outubro/novembro e em dezembro/janeiro (4,4; 6,0; 2,3). Quanto às características ovulatórias, como tamanho do folículo à ovulação e tempo de crescimento folicular, não houve diferença entre os grupos. Conclui-se pela possibilidade de eliminação dos meses extremos da estação de monta sem prejuízo da eficiência reprodutiva do rebanho.

Características físicas e morfológicas de sêmen de touros jovens das raças Gir, Guzerá, Nelore (Bos taurus indicus) e Caracu (Bos taurus taurus)

Foram utilizados 38 tourinhos com idade inicial entre 426 e 462 dias e final entre 751 e 781 dias das raças Nelore, Guzerá, Gir e Caracu, subdivididos em sete grupos genéticos conforme o método de seleção, com o objetivo de comparar o desenvolvimento reprodutivo, avaliado pelas características físicas e morfológicas do sêmen (volume, aspecto, turbilhonamento, motilidade progressiva e vigor, morfologia e concentração espermáticas), em 11 colheitas com intervalos de 29 dias. Os touros dos grupos Nelore seleção (NeS, n=6), Nelore tradicional (NeT, n=9) e Caracu seleção (CaS, n=6), com 415, 430 e 419kg de peso, respectivamente, apresentaram diferenças em todas as características quando comparados com o Nelore controle (NeC, n=4), com 302kg de peso, na segunda colheita, e este foi o único a diferir dos outros seis grupamentos na décima primeira colheita (P<0,05). Foram registradas diferenças na motilidade progressiva média dos espermatozóides na terceira colheita entre o grupamento CaS (68,3%) e o Guzerá tradicional (GuT, n=5) (10,0%), assim como entre o CaS (76,7%) e o NeS (45,0%) na quarta colheita (P<0,05). Não foram registradas diferenças no total de defeitos de espermatozóides nas segunda e última colheitas. Com base na morfologia espermática pode-se concluir que os tourinhos dos grupos genéticos NeT, CaS, Gir Seleção (GiS, n=4), Guzerá Seleção (GuS, n=4), NeC, GuT e NeS alcançaram a maturidade sexual com idades de 547, 532, 578, 544, 547, 572 e 600 dias, e pesos corporais de 430, 440, 389, 420, 336, 451 e 438kg, respectivamente.

Efeito da concentração espermática e do número de inseminações artificiais sobre a fertilidade de éguas inseminadas com sêmen fresco diluído

Sessenta e duas fêmeas eqüinas (tipo militar) foram distribuídas, ao acaso, em dois grupos experimentais para estudar o efeito da concentração espermática (200× 10(6) e 400× 10(6) de espermatozóides progressivamente móveis/dose inseminante) e do número de inseminações/ciclo (duas, três e quatro ou mais inseminações) sobre a fertilidade. As éguas foram rufiadas e inseminadas às segundas, quartas e sextas-feiras, a partir de um folículo de 3,0 a 3,5cm de diâmetro, com sêmen de apenas um garanhão com fertilidade comprovada, diluído para um volume inseminante de 10ml com diluidor de mínima contaminação. As taxas de concepção ao primeiro ciclo para as concentrações de 200 e 400 milhões foram de 66,7% (20/30) e 65,5% (19/29), e as taxas de concepção/ciclo, após quatro ciclos, de 52,0% (26/50) e 57,8% (26/45), respectivamente (P>0,05). As taxas de concepção ao primeiro ciclo para os grupos com duas, três e quatro ou mais inseminações/ciclo foram, respectivamente, 72,0% (18/25), 65,2% (15/23) e 54,6% (6/11), sem que se observassem diferenças entre elas (P>0,05). Após quatro ciclos, as taxas de concepção foram de 59,0% (23/39), 52,5% (21/40) e 50,0% (8/16), respectivamente, na mesma ordem de citação (P>0,05). Com base nos resultados, recomendam-se inseminações às segundas, quartas e sextas-feiras, utilizando-se a concentração de 200×10(6) SPTZ/dose inseminante, sem que haja perda da fertilidade, independente do número de inseminações/ciclo.

Efeito da centrifugação sobre a qualidade do sêmen canino

Avaliou-se o efeito da centrifugação sobre a viabilidade do sêmen canino e compararam-se três meios de diluição pré-centrifugação. Utilizaram-se 10 ejaculados completos de 10 cães que, após a avaliação inicial, foram divididos em quatro porções (grupos). Uma das amostras, não centrifugada, formou o grupo-controle; as outras foram diluídas em três diferentes meios e centrifugadas a 800 x g por 15 minutos, formando os grupos: CPSA - constituído por sêmen centrifugado em plasma seminal autólogo; CLG - sêmen centrifugado em meio à base de leite desnatado e glicose (LG); e CPer- sêmen centrifugado em gradientes de Percoll (45% e 90%). Após a centrifugação e a eliminação do sobrenadante, procedeu-se à ressuspensão de todas as porções do ejaculado em LG e à imediata avaliação quanto à motilidade, vigor, aglutinação espermática e integridade das membranas espermáticas. Todas as suspensões foram, então, incubadas a 37ºC por 30 minutos e reavaliadas. O processo de centrifugação não causou danos aos espermatozoides e a centrifugação em meio LG melhorou a viabilidade espermática.

Perfil em SDS-PAGE das proteínas do plasma seminal e sua relação com a congelabilidade do sêmen de touros doadores da raça gir

Foram utilizados dez animais doadores de sêmen em nível de Central de Inseminação Artificial, da raça Gir, divididos em dois grupos, de acordo com o grau de congelabilidade do sêmen de cada animal. Os animais com sêmen de alta congelabilidade foram aqueles cuja porcentagem de ejaculados viáveis pós-descongelação foi superior a 80%. O grupo de baixa congelabilidade tinha animais com porcentagem menor que 50% de ejaculados viáveis pós-descongelação. Os critérios de avaliação da viabilidade do sêmen e seleção dos animais foram definidos pelo controle de qualidade do Departamento de Produção da Central de Inseminação Artificial. Foram feitas quatro coletas semanais consecutivas, sendo que obtiveram-se as amostras de plasma seminal por centrifugação a 1.500 g por 15 a 20 minutos a 4°C, momentos após a coleta do sêmen em vagina artificial. O plasma seminal foi dialisado em membrana de celulose, em tampão Tris-Glicina pH-7,4 por 24 horas a 4°C, em agitação lenta e constante. As amostras foram padronizadas em 1,0 mg/ml de proteína total, por diluição em tampão Tris-HCl 62mM pH-6,2 mais 20% de glicerol e 4% de SDS. Através de eletroforese do tipo SDS-PAGE, foram feitas as corridas em gel a 13%. A corrida foi feita com a constante de 25 mA, por um período de 5 horas. A coloração do gel foi feita por Coomassie Brilliant Blue. Pelos resultados obtidos, verificou-se que existe uma banda no grupo de alta congelabilidade, cujo fragmento polipeptídico desta proteína tem Mr (mobilidade relativa) 20,3 e PM (peso molecular) aproximado de 61.800 Da. Esta banda não foi detectada nas amostras do grupo de baixa congelabilidade, o que sugere ser um possível marcador bioquímico quanto ao potencial de criopreservação do sêmen de bovinos.

Efeito da idade sobre a fertilidade de éguas inseminadas com sêmen diluído, resfriado a 14ºC e transportado

Para estudar o efeito da idade sobre características ovulatórias e de fertilidade, 147 ciclos estrais de 99 éguas foram agrupados em classes por idade (1 - 3-6 anos; 2 - 7-10 anos; 3 - 11-14 anos; e 4 - 15-19 anos), de acordo com o ano do nascimento. As éguas foram inseminadas com sêmen diluído, resfriado e transportado de apenas um garanhão, três vezes por semana (segundas, quartas e sextas-feiras).O controle folicular, por meio da palpação retal, e a rufiação foram realizados diariamente, durante todo o período experimental. Utilizou-se, para o transporte, o sêmen diluído no diluidor de leite desnatado-glicose no conteiner Celle modificado, sendo a dose inseminante de 400 x 10(6) espermatozóides móveis, no momento da diluição final, pré-resfriamento. O tempo médio da coleta do sêmen à inseminação artificial foi de 3,5 horas e a temperatura final do sêmen, no momento da inseminação, de 14ºC. Não houve influência da idade sobre a velocidade de crescimento folicular e o tamanho do folículo ovulatório. A fertilidade decaiu após os 15 anos de idade, traduzida pela diminuição da taxa de concepção/ciclo e eficiência de prenhez, entretanto, não foram observadas características indicativas de senescência até os 19 anos de idade.

Efeito do número de inseminações artificiais por ciclo sobre a fertilidade de éguas inseminadas com sêmen eqüino diluído, resfriado a 20ºC e transportado

Cento e vinte ciclos estrais de cento e cinco fêmeas eqüinas da raça Mangalarga Marchador foram analisados com o objetivo de estudar o efeito do número de inseminações artificiais por ciclo sobre a fertilidade de éguas inseminadas com sêmen resfriado. Os ciclos foram acompanhados por palpação retal e rufiação, e as inseminações realizadas a cada 48 horas, a partir de um folículo de 30-35 mm de diâmetro até a ovulação, com sêmen diluído, resfriado a 20ºC e transportado. As éguas foram aleatoriamente distribuídas nos seguintes grupos: T1 - uma IA/ciclo, T2 - duas IA/ciclo e T3 - três ou mais IA/ciclo. As taxas de concepção ao primeiro ciclo foram, respectivamente, para T1, T2 e T3, de 47,83% (11/23), 70,00% (21/30) e 45,16% (14/31) e, após cinco ciclos, de 51,43% (18/35), 48,89% (22/45), e 47,50% (19/40) (P>0,05). O número de IA/ciclo não teve efeito sobre a fertilidade das éguas.

Efeito do número de inseminações artificiais sobre a fertilidade de éguas inseminadas com sêmen diluído, resfriado a 14ºC e transportado

Estudou-se o efeito do número de inseminações sobre a fertilidade de éguas inseminadas, três vezes/semana (segundas, quartas e sextas-feiras), com sêmen diluído, resfriado e transportado, de apenas um garanhão. As éguas foram inseminadas a partir da detecção, pela palpação retal, de um folículo de 3,0 a 3,5 cm de diâmetro, em um dos ovários, até a ovulação. Utilizaram-se para o transporte o sêmen diluído no diluidor leite desnatado-glicose e o conteiner Celle modificado, sendo a dose inseminante de 400 x 10(6) espermatozóides móveis, no momento da diluição final, pré-resfriamento. de acordo com o número de inseminações artificiais (IA) utilizadas/ciclo, os resultados de 148 ciclos, de 100 éguas, foram agrupados em: 1 IA, 2IA, 3 IA e 4 ou mais IA. A eficiência de prenhez foi de 4,29; 5,04; 5,67; e 3,43, para 1, 2, 3 e 4 ou mais IA, respectivamente. As características foliculares diferiram em relação à freqüência de inseminações com os maiores valores observados no grupo de éguas inseminadas quatro ou mais vezes. Concluiu-se que menor velocidade de crescimento folicular e maior diâmetro do folículo ovulatório estiveram associados a maior número de inseminações artificiais/ciclo. Na presença de uma concentração espermática adequada, o número de inseminações/ciclo não exerceu influência sobre a fertilidade.

Efeito do intervalo das duas últimas inseminações sobre a fertilidade de éguas inseminadas com sêmen fresco diluído

Sessenta e duas fêmeas eqüinas foram distribuídas ao acaso em dois grupos experimentais de acordo com o intervalo da penúltima à última inseminação artificial de cada ciclo (48h ou 72h). As éguas foram rufiadas e inseminadas às segundas, quartas e sextas-feiras, a partir do momento em que apresentavam um folículo de 3,0 a 3,5 cm de diâmetro, com sêmen de apenas um garanhão de fertilidade comprovada, diluído para um volume inseminante de 10 mL com diluidor de mínima contaminação. As taxas de concepção referentes ao primeiro ciclo, para os intervalos de 48h e 72h foram de 66,67% (24/36) e 65,22% (15/23), respectivamente, sendo as taxas de concepção/ciclo de 53,45% (31/58) e 56,76% (21/37), na mesma ordem anterior. Com base nos resultados obtidos, recomendam-se inseminações às segundas, quartas e sextas-feiras, sem perda da fertilidade.

Relação da taxa de gestação com sêmen bovino congelado e testes de avaliação espermática in vitro

Avaliou-se a relação entre os testes complementares (teste hiposmótico, teste de termorresistência lento e teste de reação acrossômica) e os testes de avaliações convencionais (aspectos físicos e morfológicos) de sêmen bovino congelado/descongelado e os índices de prenhez. Os valores médios da motilidade espermática progressiva retilínea avaliados pelo teste de termorresistência foram de 53,48 (pós-descongelamento), 43,69 (60 minutos), 35,88 (120 minutos) e 33,04% (180 minutos) e a porcentagem de células reativas ao teste hiposmótico foi de 37,89%. Correlação positiva e de média intensidade foi encontrada para a motilidade espermática progressiva retilínea pós-descongelamento e o teste hiposmótico (0,21). Entretanto, a correlação da motilidade aos 180 minutos com o teste hiposmótico foi alta (0,64). A porcentagem de células que tiveram acrossoma reagido pós-descongelamento foi de 9,85%, apresentando correlações negativas de média e alta intensidade (-0,25 e -0,46, respectivamente) com a motilidade espermática progressiva retilínea pós-descongelamento e após 3 horas de incubação. Não houve correlação dos testes complementares e da motilidade pós-descongelamento com a taxa de gestação. Nenhum parâmetro considerado isoladamente serviu para avaliar a capacidade fertilizante do sêmen congelado/descongelado.

Estimativa da concentração espermática do sêmen de peixe pelo método de espermatócrito

Um experimento foi realizado com o objetivo de estimar a concentração espermática das espécies dourado (Salminus brasiliensis), curimba (Prochilodus lineatus), jundiá (Rhamdia quelen), cascudo-preto (Rhinelepis aspera) e tilápia-do-nilo (Oreochromis niloticus) pelo método de espermatócrito. Utilizaram-se 19, 58, 51, 43 e 85 reprodutores de dourado, curimba, jundiá, cascudo-preto e tilápia-do-nilo, respectivamente. Com exceção da tilápia-do-nilo, os reprodutores foram submetidos ao processo de indução hormonal e posteriormente submetidos a coleta de sêmen. Foram comparadas as técnicas de mensuração da concentração espermática do sêmen por contagem em câmara hematimétrica de Neubauer e por espermatócrito. Os resultados obtidos foram submetidos à análise de regressão a 5% de probabilidade. As concentrações espermáticas mensuradas por ambas as técnicas apresentaram relação linear, para curimbas, jundiás e tilápias-do-nilo, com equações y = 6,6624 × 10(9) + 3,68553 × 10(8)x; y = 2,153 × 10(9) + 4,426 × 10(8)x e y = -9,0897 × 10(8) + 6,0167 × 10(8), respectivamente. O método de espermatócrito pode ser utilizado para estimar a concentração espermática do sêmen de curimbas, jundiás e tilápias-do-nilo.

Fertilidade do sêmen eqüino diluído, resfriado e transportado

Objetivou-se neste experimento estudar o efeito do transporte de sêmen equino, entre haras, sobre a fertilidade de éguas inseminadas. Setenta e seis fêmeas da raça Mangalarga Marchador foram distribuídas, ao acaso, com número desigual de repetições, para se estudarem os efeitos do sêmen in natura, transportado ou não, e do sêmen diluído, resfriado e transportado, sobre a fertilidade de éguas e diferentes características reprodutivas. O sêmen foi diluído no diluidor lactose-gema de ovo sem glicerina. As fêmeas foram inseminadas, em dias alternados, com sêmen de apenas um garanhão, com volumes/dose inseminante variáveis dependendo do número de fêmeas a serem inseminadas por dia com determinado ejaculado. Utilizou-se para o transporte do sêmen um contêiner especialmente projetado para este fim (MSP-1). As taxas de concepção ao primeiro ciclo e totais, a eficiência de prenhez, o número de ciclos/égua, ciclos/égua gestante, ciclo/prenhez e prenhez/ciclo, o número de IA/égua, o número de IA/égua gestante e o número de IA/égua vazia não foram influenciados pelos tratamentos. O diluidor de lactose gema, modificado pela retirada do glicerol de sua formulação, constitui uma opção para a diluição do sêmen a ser resfriado e transportado. O suceso do transporte do sêmen, diluído e resfriado, a pequenas distâncias, por período de tempo curto, depende mais de um bom diluídor que de um sofisticado contêiner de transporte.