Microbe-associated molecular pattern (MAMP) signatures, synergy, size and charge: influences on perception or mobility and host defence responses

Triggering of defences by microbes has mainly been investigated using single elicitors or microbe-associated molecular patterns (MAMPs), but MAMPs are released in planta as complex mixtures together with endogenous oligogalacturonan (OGA) elicitor. We investigated the early responses in Arabidopsis of calcium influx and oxidative burst induced by non-saturating concentrations of bacterial MAMPs, used singly and in combination: flagellin peptide (flg22), elongation factor peptide (elf18), peptidoglycan (PGN) and component muropeptides, lipo-oligosaccharide (LOS) and core oligosaccharides. This revealed that some MAMPs have additive (e.g. flg22 with elf18) and even synergistic (flg22 and LOS) effects, whereas others mutually interfere (flg22 with OGA). OGA suppression of flg22-induced defences was not a result of the interference with the binding of flg22 to its receptor flagellin-sensitive 2 (FLS2). MAMPs induce different calcium influx signatures, but these are concentration dependent and unlikely to explain the differential induction of defence genes [pathogenesis-related gene 1 (PR1), plant defensin gene 1.2 (PDF1.2) and phenylalanine ammonia lyase gene 1 (PAL1)] by flg22, elf18 and OGA. The peptide MAMPs are potent elicitors at subnanomolar levels, whereas PGN and LOS at high concentrations induce low and late host responses. This difference might be a result of the restricted access by plant cell walls of MAMPs to their putative cellular receptors. flg22 is restricted by ionic effects, yet rapidly permeates a cell wall matrix, whereas LOS, which forms supramolecular aggregates, is severely constrained, presumably by molecular sieving. Thus, MAMPs can interact with each other, whether directly or indirectly, and with the host wall matrix. These phenomena, which have not been considered in detail previously, are likely to influence the speed, magnitude, versatility and composition of plant defences.

Aspectos fenotípicos e moleculares de isolados de Acinetobacter baumannii relacionados à infecção nosocomial

Acinetobacter baumannii, com sua capacidade de acumular resistência aos antibióticos e o seu potencial de formar biofilme, é uma das principais ameaças para infecções em ambiente hospitalar, chegando a se constituir problema de saúde pública. A resistência aos carbapenêmicos geralmente ocorre devido à expressão de oxacilinases e metalo-β- lactamases e a formação de biofilme pode estar relacionada à presença dos genes bap e blaPER-1. Focando estas características, foram analisados 67 isolados de A. baumannii relacionados à infecção nosocomial provenientes de hospital da rede pública de saúde em Pernambuco. Foram obtidas informações através da amplificação e sequenciamento dos genes 16S rDNA, dos genes codificadores de oxacilinases e de metalo-β-lactamases e de genes relacionados à produção de biofilme As sequências do 16S rDNA confirmaram a identificação de 66 dos isolados; o outro isolado apresentou limitação em sua identificação. O gene blaOXA-143-like foi encontrado em 34 isolados (50,7%), blaOXA-23-like em 12 isolados (17,9%), blaOXA-24-like em 10 isolados (14,9%) e o gene, blaOXA-51-like, intrínseco, foi encontrado em 66 isolados (98,5%) e apresentou polimorfismo, indicando-o como potencial marcador para tipagem molecular. Os genes blaOXA-58-like, vim, spm, imp e blaPER-1 não foram encontrados. O gene bap foi encontrado em 58 isolados (86,5%), destes, 18 isolados (31%) apresentaram um produto de amplificação maior que o esperado. A análise das sequências mostrou que nestes isolados havia uma inserção do gene dacD, relacionado a proteína ligadora de penicilina (PBP), o qual pode ter inativado o gene bap e causado diminuição na produção de biofilme observada no teste fenotípico. O teste fenotípico para avaliar a formação de biofilme apresentou aderência positiva e moderada em 37 isolados (55,2%). Estes achados apontam a necessidade de um monitoramento acurado do A. baumannii para orientar o tratamento e controle no ambiente hospitalar.

Análise da variabilidade imunológica e da expressão dos genes FREPs entre as espécies Biomphalaria glabrata e B. straminea com diferentes perfis de suscetibilidade ao parasito Schistosoma mansoni

Algumas espécies do gênero Biomphalaria se apresentam como potenciais hospedeiras ao parasito Schistosoma mansoni, estando a suscetibilidade a este parasito, neste gênero, ligada ao sistema interno de defesa de cada espécie de Biomphalaria. Um dos componentes importantes no sistema imune de invertebrados é a enzima fenoloxidase, que ainda apresenta muitos aspectos desconhecidos no sistema de defesa do gênero Biomphalaria. Foi relatado também que os genes de proteínas relacionadas ao fibrinogênio (FREPs) possuem importância na resposta imune de Biomphalaria glabrata, entre esses, as subfamílias dos FREPs 3 e 4 são diferencialmente expressas em linhagens susceptíveis e resistentes frente a infecção com trematódeos. No entanto os trabalhos existentes em sua maioria estudam a espécie Biomphalaria glabrata, excluindo a espécie Biomphalaria straminea, amplamente distribuída no Brasil e principal responsável pela disseminação da esquistossomose. Tendo em vista a falta de conhecimento sobre a resposta imune destes moluscos hospedeiros, principalmente em relação à expressão de genes imune relevantes e ao tipo de resposta, o presente trabalho se propôs a estudar a variação do número de hemócitos, da produção de fenoloxidase e da expressão dos genes dos FREP 3 e FREP 4 envolvidos com a ligação a antígenos de trematódeos, nas espécies Biomphalaria glabrata, Biomphalaria straminea pós-infecção com S. mansoni, bem como em caramujos pré-expostos a antígenos de S. mansoni. Para isso, os caramujos de cada espécie foram divididos em 2 grupos: pré-expostos e não expostos a antígenos de S. mansoni. Esses grupos foram divididos em sadios e infectados com a cepa LE de S. mansoni. Em B. glabrata não houve alteração no número de hemócitos, porém B. straminea mostrou uma queda após duas horas de infecção. A atividade da fenoloxidase variou após a sensibilização na espécie menos susceptível (B. straminea) e não variou em B. glabrata, também foi identificado que os hemócitos produtores da fenoloxidase são os granulócitos e hialinócitos. Quanto à expressão dos genes, o FREP 3 e 4 apresentaram níveis basais de expressão aumentados após a sensibilização, com perfil de expressão diferente entre as espécies estudadas. Esses resultados confirmam que a resposta imune varia em diversos aspectos entre as espécies do gênero Biomphalaria, e que nas espécies estudadas a enzima fenoloxidase não parece ter o mesmo papel que no sistema de defesa de insetos, diferindo apenas após a sensibilização, que tem influência na expressão dos genes imuno relevantes do FREPs

Avaliação do potencial terapêutico de inibidores da Galectina-3 em modelo experimental de lesão hepática crônica

As lesões crônicas do fígado são resultantes de agressões persistentes, onde a desorganização e destruição do tecido podem desencadear processos de regeneração e fibrose. Para que a integridade e homeostase do órgão sejam restauradas, várias vias intracelulares e intercelulares são ativadas. Uma delas é a através da liberação de moléculas pró-fibrogênicas, a exemplo da lectina solúvel bgalactosídea, a galectina-3 (Gal-3). A alta expressão dessa lectina tem sido associada a fibrogênese no fígado. A descoberta de moléculas capazes de se ligar à Gal-3 e inibir a sua ação são importantes no desenvolvimento de terapias antifibrosantes. A pectina cítrica modificada (PCM) e a N-acetilactosamina (LacNAc) demonstraram ação benéfica no tratamento de doenças fibróticas, incluindo renais e cardíacas, contudo, pouco se sabe sobre suas eficácias na fibrose hepática. Diante disso, o objetivo deste estudo foi investigar os efeitos das administrações da PCM e LacNAc quanto aos níveis de Gal-3 e fibrose em modelo experimental de lesão hepática crônica. Inicialmente, a fibrose hepática foi induzida em camundongos C57BL/6 pela administração de tetracloreto de carbono a 20 por cento diluído em azeite de oliva. Grupos de camundongos com dois ou quatro meses de lesão foram tratados com PCM (1 por cento e 5 por cento, fornecida ad libitum) e com LacNAc, por via intraperitoneal. Adicionalmente, camundongos knockouts para o gene da Gal-3 (Gal-3-/-) foram utilizados como um controle. Subsequentemente às intervenções, análises morfométricas, bioquímicas, imunológicas e de biologia molecular foram realizadas. Na análise morfométrica, não se verificou alteração no percentual de tecido fibroso entre os grupos tratados com PCM (1 por cento e 5 por cento) ou LacNAc quando comparados com seus respectivos controles, o que foi confirmado pela dosagem dos níveis de hidroxiprolina. Adicionalmente, não foi observada alteração dos níveis de Gal-3, MMP-9 e TIMP-1 após tratamento com os inibidores. Os resultados obtidos indicaram que a PCM e a LacNAc não foram capazes de inibir a Gal-3 no fígado, e portanto, não interferiram na deposição de tecido fibroso nesse modelo experimental

Avaliação das quimiocinas e da expressão de seus receptores em células mononucleares de pacientes portadores da doença de Chagas submetidas à infecção in vitro com Trypanosoma cruzi e tratamento com benzonidazol

Atualmente o Brasil apresenta 3 milhões de indivíduos portadores da cardiomiopatia chagásica. Porém, tratamento etiológico com o fármaco Benzonidazol (BZ) na fase crônica da doença ainda não está elucidado. Acredita-se que a recomendação do BZ nessa fase, pode prevenir ou retardar a evolução clínica da cardiomiopatia na Doença Chagas (DC). Assim o objetivo do estudo é avaliar a produção de quimiocinas e expressão de seus receptores em Células mononucleares do sangue periférico - PBMC (de portadores crônicos da doença de Chagas) submetidas in vitro ao tratamento com BZ, após a infecção com T.cruzi. Foram selecionados 11 pacientes na fase crônica da doença. Amostras de sangue desses pacientes foram coletadas para obtenção de PBMC, em que foram cultivadas em placas de cultivo na concentração de 106 células/ml por poço. Após a adesão das células aderentes (principalmente macrófagos), as células não aderentes (principalmente linfócitos) foram removidas e as formas tripomastigotas foram adicionadas ao cultivo para infecção das células aderentes. Subsequente a incubação, as células não aderentes foram adicionadas novamente ao cultivo juntamente com o fármaco Bz (1µg/mL), ficando um co-cultivo de células aderentes infectadas com T.cruzi, células não aderentes e o BZ (C+T+BZ). As placas de cultura foram incubadas por períodos de 24h e 5 dias. Para uma análise fidedigna da ação do BZ nas células aderentes e não aderentes foi necessário a criação dos controles: células (C), células e tripomastigotas (C+T) e células e o BZ (C+BZ). Após o cultivo, foram coletados os sobrenadantes das culturas, para avaliação da produção de quimiocinas (CCL2, CXL9, CXL10, CCL5 e CXCL8) por CBA (Cytometric Bead Array). Posteriormente foi realizada a imunofenotipagem, avaliando a expressão dos receptores CCR3, CCR4, CXCR3, CXCR5, CCR1, CXCR4, CXCR2 e CCR5, em linfócitos T CD3+ e monócitos CD14+. Os resultados obtidos na avaliação dos linfócitos mostraram que o receptor CXCR5 esteve aumentado na condição C+T+BZ; e os receptores CCR4 e CCR1 estavam diminuídos nessa mesma condição. Nos monócitos observamos uma diminuição de CCR4 e um aumento do CCR5 nas mesmas condições. Com relação a dosagem de quimiocinas no sobrenadante, foi evidenciado que CCL2 e CXCL8 apresentaram uma diminuição na condição C+T+BZ. Assim podemos concluir que devido ao caráter inflamatório modulado, que o BZ conduziu, podemos afirmar que o fármaco demonstrou benefícios relevantes na expressão de receptores e na produção de quimiocinas

Avaliação da α-glicosidase Cqm1 de Culex quinquefasciatus e o impacto de suas mutações na fisiologia de larvas

Lysinibacillus sphaericus (Lsp) é uma bactéria entomopatógena que produz a toxina Bináriav(Bin) com atividade larvicida para culicídeos. A sua ação em Culex quinquefasciatus depende da ligação da toxina Bin à α-glicosidase (Aglu) Cqm1, que atua como receptor no epitélio intestinal de larvas. Na colônia R2362, foram caracterizados dois alelos de resistência ao Lsp: cqm1REC e cqm1REC-2, cujas mutações impedem a expressão da Aglu Cqm1. O objetivo deste trabalho foi avaliar a atividade catalítica da Cqm1 e comparar a atividade α-glicosidase e o desenvolvimento pré-imaginal de larvas de indivíduos susceptíveis (S) e resistentes (R) para cada alelo. Para isto, foram avaliados os seguintes parâmetros: atividade catalítica da Cqm1 recombinante; padrão de transcrição de outras Aglus parálogas à Cqm1; atividade de Aglus nativas em larvas; sobrevivência de indivíduos frente a diferentes dietas. A Aglu Cqm1 mostrou atividade enzimática ótima à 37o C, pH 7,5-8,0 e utilizando o substrato sintético pNαG. A atividade α-glicosidase total em larvas S e R foi similar, apesar da ausência de expressão da Cqm1 nas larvas R. A investigação in silico revelou 18 proteínas parálogas à Cqm1 e, dentre 11 investigadas, nove são expressas em larvas S e R. A análise quantitativa de três parálogas demonstrou que duas tem um padrão de transcrição mais elevado em larvas resistentes, sugerindo a existência de um mecanismo de compensação de expressão de α-glicosidases. O desenvolvimento pré-imaginal de larvas S foi decrescente nas seguintes dietas: ração de gatos, ração de peixes, leite desnatado, extrato de levedura e sacarose. De uma forma global, a taxa de sobrevivência de larvas R foi inferior à S em todas as dietas testadas. Os dados obtidos mostram que as mutações ligadas aos alelos cqm1REC e cqm1REC-2 não parecem impactar a atividade Aglu nas larvas e que o custo biológico observado poderia estar relacionado a outros genes e vias metabólicas.

Caracterização funcional do gene da Glutationa-S-Transferase Epsilon 2 (GSTE2) em Aedes aegypti

As Glutationa-S-Transferases (GSTs) em insetos desempenham um papel fundamental na metabolização de inseticidas químicos, e provavelmente estão envolvidas na proteção contra o estresse oxidativo decorrente da exposição a xenobióticos. O objetivo do trabalho foi a caracterização funcional do gene GSTE2 em linhagens de Aedes aegypti com diferentes perfis de susceptibilidade ao temephos. Foram usadas uma colônia susceptível (RecLab) e outra resistente, (RecR). Larvas de ambas as linhagens foram divididas em dois grupos: exposto ao temephos com concentrações subletais e não exposto. Os indivíduos sobreviventes foram usados em ensaios enzimáticos para medir a atividade das GSTs totais contra os substratos CDNB (padrão) e o 4-HNE, um produto endógeno resultante da peroxidação de lipídeos. Adicionalmente, foi feito o sequenciamento do cDNA deste gene em amostras das duas linhagens e a sua expressão foi investigada. A GSTE2 das duas linhagens foi expressa em sistema heterólogo e purificada para avaliação da atividade metabólica contra o 4-HNE, através de testes de biocatálise. Os resultados revelaram que a atividade enzimática da GST usando o CDNB foi normal para RecLab, em ambas as condições estudadas, porém, para RecR houve alteração na atividade de GST, para os dois grugo estudados . Usando o 4-HNE como substrato, as duas linhagens apresentaram um perfil enzimático alterado para GST em relação à Rock, com uma resposta aumentada após a exposição ao temephos. Foram identificados polimorfismos que diferenciam as duas linhagens. Os resultados de expressão gênica indicaram que as larvas resistentes apresentam níveis de expressão significativamente maiores do que as susceptíveis, e em RecR a expressão caiu após a exposição, sugerindo o envolvimento dessa enzima nos processos de resistência metabólica na linhagem RecR. Esses dados abrem novas perspectivas de monitoramento da resistência metabólica em Ae. aegypti

Avaliação do efeito do benzonidazol sobre linfócitos, de portadores crônicos da doença de Chagas, submetidos experimentalmente à exposição ao Trypanosoma cruzi

O único medicamento disponível para o tratamento da doença de Chagas (DC) no Brasil é o benzonidazol (Bz). O beneficio da medicação aos portadores crônicos da doença ainda demonstra controvérsias, mas seu uso nessa fase pode ter a finalidade de prevenir/retardar a evolução da DC para formas mais graves. Os fenômenos imunológicos que ocorrem após a terapia com o Bz ainda não estão elucidados. Assim, este estudo propôs avaliar o efeito do Bz sobre o perfil imunológico de linfócitos T e a produção de citocinas por células da resposta imune expostas in vitro ao T. cruzi. Amostras de sangue de portadores crônicos da DC foram coletadas para obtenção de células mononucleares de sangue periférico com posterior infecção com tripomastigotas de T. cruzi, seguida de adição do Bz às culturas. Após o tempo de cultivo, os sobrenadantes foram estocados para posterior análise das citocinas IFN-gama, TNF, IL-10, IL-6, IL-4 e IL-2 por CBA e as células foram avaliadas por citometria de fluxo, quanto à expressão das moléculas CD28+ e CTLA-4+ e a produção de citocinas (IL-10 e IFN-gama) em linfócitos T CD4+ e CD8+. Nossos resultados mostraram que o tratamento com o Bz aumentou a expressão da molécula CTLA-4+ em linfócitos T CD8+, indicando que o Bz pode induzir uma modulação da resposta imune e, consequentemente, diminuir a ativação exacerbada dessas células. Além disso, verificamos uma diminuição da produção da citocina IL-10 por linfócitos T CD4+ na presença do Bz. Com relação à produção global de citocinas por células aderentes e não aderentes, observamos que o Bz causou uma diminuição da citocina pró-inflamatória TNF e da citocina anti-inflamatória IL-10, enquanto que as outras citocinas (IFN-gama, IL-6, IL4 e IL-2) permaneceram com níveis elevados de produção na presença desse fármaco. Nossos resultados sugerem que o Bz induz uma regulação da ativação de linfócitos T CD8+ e a produção de citocinas do perfil Th1 modulado por citocinas do perfil Th2, em células de portadores crônicos da DC. Assim, acreditamos que a administração do Bz aos portadores de formas clínicas brandas da DC pode ser benéfica a esses pacientes, visto que o Bz não promoveu um perfil inflamatório exacerbado