L'autopsie moléculaire de la mort subite cardiaque: de la salle d'autopsie au cabinet du praticien [Molecular autopsy of sudden cardiac death: from postmortem to clinical approach]

Sudden cardiac death is one of the most prevalent cause of death in developed countries. Its aetiology varies according to the age. Some cardiac diseases may explain sudden death with minimal or no anatomic findings. However, many cardiac diseases, as for example channelopathies and hypertrophic cardiomyopathy have a genetic basis. Therefore genetic analyses (molecular autopsy) are becoming a useful tool in forensic medicine to identify the cause of sudden cardiac death and to improve the early diagnosis of asymptomatic carriers among relatives.

Comparaison des coûts du diagnostic moléculaire des rétinites pigmentaires entre le séquençage selon Sanger et un séquençage à haut débit

La rétinite pigmentaire (RP) et l'amaurose congénitale de Leber (LCA) sont deux maladies héréditaires classées dans le groupe des rétinopathies pigmentaires. Plus de 100 gènes ou loci ont étés identifiés dans les RP (comptant pour 60% des patients) et 14 gènes pour les LCA (responsables de 70% des cas). A elles-deux et en ne prenant que les plus fréquentes, ces maladies représentent 948 exons à analyser lorsqu'on recherche une mutation chez un patient. La recherche de mutations au moyen du séquençage génomique classique (séquençage selon Sanger) de tous les gènes de ces deux maladies implique des délais d'analyse importants et des coûts très élevés. La méthode de séquençage à haut débit (avec le séquenceur Roche GS Junior) permet grâce à une puce à ADN le séquençage simultané des 948 exons. Le but de mon travail de Master est de comparer ces deux approches afin de déterminer celle qui est la plus économique et la plus efficiente en temps. Pour cela, j'ai d'abord établi la liste de tous les gènes impliqués dans les RP et LCA, puis identifié tous les exons ainsi que les promoteurs et séquences 3' non traduites. J'ai ensuite calculé le coût théorique d'une analyse de tous les gènes avec chacune des méthodes. J'ai également estimé les coûts à facturer à l'assurance concernant le séquençage à haut débit sur la base des coûts facturables à l'assurance de la méthode Sanger et des bénéfices du laboratoire. Le séquençage des 948 exons par le séquençage à haut débit (avec le GS Junior) représente la technique de séquençage la plus économique et la plus efficiente en temps et constitue donc la méthode de choix dans le screening diagnostic des gènes impliqués dans les RP et LCA. Cette méthode est plus rapide, les réactifs et la machine sont moins coûteux et la laborantine peut analyser un nombre plus important d'exons en un temps moindre, donc elle coûtera moins cher au laboratoire. Cette méthode est donc d'un grand intérêt pour les patients, les assurances et le laboratoire. Cette nouvelle technique de séquençage soulève de nouvelles interrogations telles que la décision de savoir quelle information doit être donnée aux médecins, aux assurances et aux patients. Interrogations auxquelles il devient de plus en plus pressant de répondre.

Molecular modeling study of the binding and signaling properties of the TCRpMHC complex

The activation of the specific immune response against tumor cells is based on the recognition by the CD8+ Cytotoxic Τ Lymphocytes (CTL), of antigenic peptides (p) presented at the surface of the cell by the class I major histocompatibility complex (MHC). The ability of the so-called T-Cell Receptors (TCR) to discriminate between self and non-self peptides constitutes the most important specific control mechanism against infected cells. The TCR/pMHC interaction has been the subject of much attention in cancer therapy since the design of the adoptive transfer approach, in which Τ lymphocytes presenting an interesting response against tumor cells are extracted from the patient, expanded in vitro, and reinfused after immunodepletion, possibly leading to cancer regression. In the last decade, major progress has been achieved by the introduction of engineered lypmhocytes. In the meantime, the understanding of the molecular aspects of the TCRpMHC interaction has become essential to guide in vitro and in vivo studies. In 1996, the determination of the first structure of a TCRpMHC complex by X-ray crystallography revealed the molecular basis of the interaction. Since then, molecular modeling techniques have taken advantage of crystal structures to study the conformational space of the complex, and understand the specificity of the recognition of the pMHC by the TCR. In the meantime, experimental techniques used to determine the sequences of TCR that bind to a pMHC complex have been used intensively, leading to the collection of large repertoires of TCR sequences that are specific for a given pMHC. There is a growing need for computational approaches capable of predicting the molecular interactions that occur upon TCR/pMHC binding without relying on the time consuming resolution of a crystal structure. This work presents new approaches to analyze the molecular principles that govern the recognition of the pMHC by the TCR and the subsequent activation of the T-cell. We first introduce TCRep 3D, a new method to model and study the structural properties of TCR repertoires, based on homology and ab initio modeling. We discuss the methodology in details, and demonstrate that it outperforms state of the art modeling methods in predicting relevant TCR conformations. Two successful applications of TCRep 3D that supported experimental studies on TCR repertoires are presented. Second, we present a rigid body study of TCRpMHC complexes that gives a fair insight on the TCR approach towards pMHC. We show that the binding mode of the TCR is correctly described by long-distance interactions. Finally, the last section is dedicated to a detailed analysis of an experimental hydrogen exchange study, which suggests that some regions of the constant domain of the TCR are subject to conformational changes upon binding to the pMHC. We propose a hypothesis of the structural signaling of TCR molecules leading to the activation of the T-cell. It is based on the analysis of correlated motions in the TCRpMHC structure. - L'activation de la réponse immunitaire spécifique dirigée contre les cellules tumorales est basée sur la reconnaissance par les Lymphocytes Τ Cytotoxiques (CTL), d'un peptide antigénique (p) présenté à la suface de la cellule par le complexe majeur d'histocompatibilité de classe I (MHC). La capacité des récepteurs des lymphocytes (TCR) à distinguer les peptides endogènes des peptides étrangers constitue le mécanisme de contrôle le plus important dirigé contre les cellules infectées. L'interaction entre le TCR et le pMHC est le sujet de beaucoup d'attention dans la thérapie du cancer, depuis la conception de la méthode de transfer adoptif: les lymphocytes capables d'une réponse importante contre les cellules tumorales sont extraits du patient, amplifiés in vitro, et réintroduits après immunosuppression. Il peut en résulter une régression du cancer. Ces dix dernières années, d'importants progrès ont été réalisés grâce à l'introduction de lymphocytes modifiés par génie génétique. En parallèle, la compréhension du TCRpMHC au niveau moléculaire est donc devenue essentielle pour soutenir les études in vitro et in vivo. En 1996, l'obtention de la première structure du complexe TCRpMHC à l'aide de la cristallographie par rayons X a révélé les bases moléculaires de l'interaction. Depuis lors, les techniques de modélisation moléculaire ont exploité les structures expérimentales pour comprendre la spécificité de la reconnaissance du pMHC par le TCR. Dans le même temps, de nouvelles techniques expérimentales permettant de déterminer la séquence de TCR spécifiques envers un pMHC donné, ont été largement exploitées. Ainsi, d'importants répertoires de TCR sont devenus disponibles, et il est plus que jamais nécessaire de développer des approches informatiques capables de prédire les interactions moléculaires qui ont lieu lors de la liaison du TCR au pMHC, et ce sans dépendre systématiquement de la résolution d'une structure cristalline. Ce mémoire présente une nouvelle approche pour analyser les principes moléculaires régissant la reconnaissance du pMHC par le TCR, et l'activation du lymphocyte qui en résulte. Dans un premier temps, nous présentons TCRep 3D, une nouvelle méthode basée sur les modélisations par homologie et ab initio, pour l'étude de propriétés structurales des répertoires de TCR. Le procédé est discuté en détails et comparé à des approches standard. Nous démontrons ainsi que TCRep 3D est le plus performant pour prédire des conformations pertinentes du TCR. Deux applications à des études expérimentales des répertoires TCR sont ensuite présentées. Dans la seconde partie de ce travail nous présentons une étude de complexes TCRpMHC qui donne un aperçu intéressant du mécanisme d'approche du pMHC par le TCR. Finalement, la dernière section se concentre sur l'analyse détaillée d'une étude expérimentale basée sur les échanges deuterium/hydrogène, dont les résultats révèlent que certaines régions clés du domaine constant du TCR sont sujettes à un changement conformationnel lors de la liaison au pMHC. Nous proposons une hypothèse pour la signalisation structurelle des TCR, menant à l'activation du lymphocyte. Celle-ci est basée sur l'analyse des mouvements corrélés observés dans la structure du TCRpMHC.

Mécanisme moléculaire de protection des HDLs contre le stress du réticulum endoplasmique dans la cellule beta pancréatique. [Molecular mechanisms of HDLs to protect against the endoplasmic reticulum stress in pancreatic beta cell.]

Introduction: Les particules de HDL (High Density Lipoproteins) ont des fonctions très diverses notamment anti-inflamatoires, anti-apoptotiques ou anti-oxydatives. Chez les patients diabétiques, les niveaux de HDLs sont bas, les prédisposants ainsi à un risque élévé à développer une maladie cardiovasculaire. Sachant que le s HDLs ont également un effet protecteur sur la cellule beta, le but de cette étude est dinvestigué les mécanismes moléculaires de cette protection contre le stress du réticulum, stress qui contriubue au développement du diabéte de type 2. Résultats: La thapsigargine et la tunicamycine induisent lapoptose en induisant un stress dans le réticulum endoplasmique (RE) par un mauvais repliement des protéines dans le RE, ainsi que l'activation de l'UPR (Unfolded Protein Respons) avec trois voies communes de signalisation intracellulaire (IRE1, PREK et ATF6). Ces voix veillent tout d'abord à augmenter la capacité de repliement des protéines et le cas échéant à lapoptose. Nos résultats montrent que les HDLs sont capable d'inhuber lapoptose induite par la thapsigargine et la tunicamycine dans les MIN6. Dans le cas du traitement avec la thapsigargine, plusieurs marqueurs des voix UPR sont bloqués en présence des HDLs, suggérant que l'effet anti-apoptotiques des HDLs s'exerce au niveau ou en amont du RE. Les HDLS par contre ne bloquent par la sortie de calcium du RE induite par la thapsigargine ce qui indique que les HDLs n'interfèrent pas avec l'action de cette drogue sur sa cible (SERCA). Dans le cas de la la tunicamycine, les HDLs ne bloquent pas, ou très légèrement, l'activation des voix de l'UPR. La protection induite par les HDLs contre la mort engendrée par la tunicamycine s'sexerce dont apparement en aval de l'UPR et reste à être déterminer. Conclusions: Nos données suggérent que les HDLs sont capable de protéger la cellule beta contre le stress du réticulum mais apparement de façon différente selon les modalités d'inductions de ce stress.

Estime et respect de soi, justice, reconnaissance. De quelques défis actuels en éthique

L'éthique est aujourd'hui en pleine mutation (l'éthique théologique en subissant le contre-coup). Effervescence réjouissante ou valse des éthiques, progrès de la conscience morale ou fuite en avant dans ses sub-stitutions juridiques -le biodroit remplaçant la bioéthique?- relativisme moral ou quête d'une éthique commune, morale planétaire ou éthique des vertus, comment s'y retrouver dans ce carrousel tournoyant, sans perdre la tête, mais sans se laisser non plus séduire par des simplifications abusives? Mon propos sera de suggérer une ligne de crête nous permettant d'avancer au-dessus des précipices ou des abîmes et de baliser une marche plus assurée malgré les équilibres instables et fragiles qui sont de plus en plus les nôtres.

Lats2, a novel regulator of Elongin BC ubiquitin ligase

Résumé : Le Large tumor suppressor, Lats2, est une protéine humaine homologue au suppresseur de tumeur Warts (Lats) de Drosophila melanogaster, qui réprime la prolifération des cellules en altérant leur cycle au niveau des transitions Gl/S et G2/M, et en induisant l'apoptose. Pourtant, la voie moléculaire par laquelle Lats2, une sériase-thréonine kinase, déclenche l'arrêt du cycle cellulaire, est toujours inconnue. Notre équipe a d'abord déterminé que Lats2 était un gène de réponse à la protéine p53 (Kostic et al., 2000). Par la suite, nous avons identifié des protéines interagissant avec Lats2, notamment les modules de reconnaissance du substrat des ligases Colline E3 (des protéines contenant Socs box ou F box) ainsi que deux Bous-unités du Signalosome CSN: CSN4 et CSNS. En outre, Lats2 est connue pour s'associer au Super-complexe composé de CSN et des ligases Colline E3 (Rongere, thesis, 2004; Rongere, unpublished results, 2005). Le travail présenté ici sur Lats2 a confirmé que cette protéine est une kinase associée à CSN. Nous avons caractérisé les interactions spécifiques de domaines de Lats2 avec hSocs3, hWsb 1 (des protéines Socs box) et hFBX-7 (une protéine F box), ainsi que les conséquences physiologiques des interactions avec hSocs3, hWsb1 et hSocs1. Des expériences de GST pull-down ont montré que les deux domaines, N-terminal et kinase, de Lats2 interagissent avec hSocs3, hWsb1 et hFBX-7, ce qui suggère aussi que l'ensemble de la protéine Lats2 est impliqué dans ces interactions. Une étude approfondie des interactions entre Lats2 et hSocs3 indique que le domaine kinase de Lats2 interagit avec la région de hSocs3 contenant un domaine SH2, situé en amont du domaine Socs box de hSocs3. Par ailleurs, Lats2 phosphoryle des régions spécifiques entre les domaines N-terminal et SH2 (Sl), et, entre les domaines SH2 et Socs box (S3) de la protéine hSocs3. Ces résultats révèlent que hSocs3 est un.nouveau substrat de Lats2. Des modifications de l'activité kinase ont aussi révélé que la protéine sauvage Lats2 (wt Lats2) était capable de phosphoryler hSocs3, alors qu'un mutant dead du domaine kinase Lats (poche ATP délétée, Lats2OATP) non. L'analyse des mutations a permis d'identifier deux résidus sériase situés aux positions 1441145 (S3), spécifiquement phosphorylés par wt Lats2. La phosphorylation des protéines représentant un signal de dégradation protéolytique, nous avons envisagé que Lats2 pouvait cibler hSocs3 pour une dégradation protéasomale. Lorsque wt Lats2 est surexprimée dans des cellules HEK293T et COS7, la demi-vie de hSocs3, un élément de la ligase Elongine BC-Colline É3 (ligase EBC), diminue significativement, effet que n'a pas la surexpression de Lats2OATP. De plus, la stabilité de hSocs3 dépend de la phosphorylation des résidus sériase aux positions 144/145 par wt Lats2. Bien que les sites de phosphorylation ne soient pas définis pour les deux autres modules de reconnaissance du substrat de la ligase EBC: hWsb 1 et hSocsl, leurs demi-vies diminuent également quand wt Lats2 est surexprimée. Pour les tests in vivo, nous avons synthétisé des esiRNA pour diminuer l'expression du gène endogène lats2, ce qui a entraîné une augmentation d'un facteur 2 de la demi-vie de hSocs3 et de hWsbl dans les cellules HEK293T. En conclusion, nos résultats suggérent que Lats2, une kinase associée au CSN, est un nouveau régulateur de la fonction des ligases EBC, agissant sur le renouvellement des protéines hSocs3, hSocs1 et hWsb1. Ainsi, Lats2 altère la spécificité et la capacité des ligases EBC, régulant par là même la stabilité de nombreuses protéines, ciblées par les ligases EBC pour une dégradation protéasomale. D'autres études devraient révéler si la modification observée de la fonction de la ligase EBC par Lats2, associée au Super-complexe, est également responsable du renouvellement des régulateurs du cycle cellulaire et des changements dans ce même cycle observés lors de la surexpression de Lats2. Summary : The Large tumor suppressor 2 (Lats2) is a human homologue of the Drosophila melanogaster tumor suppressor Warts (Cats) who negatively regulates cell proliferation by altering cell cycle Gl/S and G2/M transition and inducing apoptosis. However, the molecular pathway by which Lats2, a serine-threonine kinase, mediates cell cycle arrest is still unknown. Lats2 was initially identified to be a p53 response gene by our group (Kostic et al., 2000). Subsequently, our group identified interacting candidates of Lats2, including substrate recognition modules of Cullin-based E3 ligases (Socs box or F-box containing proteins) as well as two subunits of the Signalosome (CSN), CSN4 and CSNS. Additionally, Lats2 was shown to associate with a Super-complex, composed of CSN and Cullin-based E3 ligases (Rongere, thesis, 2004; Rongere, unpublished results, 2005) We hypothesized that Lats2 may perform its physiological function through interaction with CSN and Cullin-based E3 ligases. The present work on Lats2 has confirmed that Lats2 is a CSN associated kinase. We defined the domain specific interactions of Lats2 with hSocs3, hWsb1 (Sots box proteins) and hFBX-7 (F box protein), as well as the physiological consequences of interaction with hSocs3, hWsb1 and hSocs1. Both the N-terminal and the kinase domains of Lats2 interact with full-length hSocs3, hWsb1 and hFBX-7, determined in GST pull-down assays suggesting that full-length Lats2 protein is involved in interactions. Refinement of the Lats2 interaction with hSocs3 indicated that the kinase domain of Lats2 interacts with a region of hSocs3 containing a SH2 domain located upstream of the Socs box domain of the hSocs3. Moreover, Lats2 phosphorylated specific regions between the N-terminal and SH2 domain (S l) as well as between the SH2 domain and Socs box domain of hSocs3 (S3).These results indicate that hSocs3 is a novel Lats2 substrate. The kinase assay has also demonstrated that wt Lats2 was able to phosphorylate hSocs3, but not Lats2 kinase dead mutant (deleted ATP pocket, Lats20ATP). Mutational analysis identified two serine residues located at positions 144/145 (S3) to be specifically phosphorylated by wt Lats2. Phosphorylation of proteins has been shown to be a signal for proteolytic degradation of many characterized proteins. Thus we hypothesized that Lats2 could target hSocs3 for proteasomal degradation. When wt Lats2 was over-expressed in HEK293T cells and COST cells, the half-life of hSocs3, as a component of Elongin BC Cullin-based E3 ubiquitin ligase (EBC ligase), decreased significantly. In contrast, aver-expression of the Lats2OATP did not alter the half-life of hSocs3. Furthermore, the stability of hSocs3 depended on phosphorylation of serine residues at positions 144/145 by wt Lats2. Although the sites of phosphorylation were not defined for two other substrate recognition modules of EBC ligasehWsbl and hSocsl, their half-lives also decreased when wt Lats2 was over-expressed. To test in vivo, we synthesized esiRNA to knock-down endogenous Lats2 and subsequently we measured the half-lives of hSocs3 and hVVsb l . Here we demonstrated that the half-lives of hSocs3 and hWsbl were increased by the factor of two in Lats2-depleted HEK293T cells. In conclusion, our findings suggest that Lats2, a CSN associated kinase, is a novel regulator of EBC ligase function by regulating the turn-over of hSocs3, hSocs1 and hWsb1. Thus, Lats2 alters the specificity and capacity of EBC ligases regulating thereby the stability of numerous proteins which are targeted by EBC ligases for proteasomal degradation. Further studies should reveal whether the observed modulation of EBC ligase function by Lats2 associated with a Super-complex is also responsible for the turn-over of cell cycle regulators and the observed alteration in cell cycle by Lats2 over-expression.

Reconnaissance d'un cas d'épicondylite comme maladie professionnelle

Le cas d'une épicondylite, atteinte musculosquelettique au coude, a été reconnu comme maladie professionnelle par le Tribunal fédéral et le Tribunal cantonal des Assurances, suite à une longue bataille juridique. Cette victoire, très encourageante pour les spécialistes de la santé au travail, a été possible grâce à une expertise qui a comparé deux situations professionnelles. Cela a permis la mise en évidence de facteurs de risque liés "de manière nettement prépondérante" aux contitions de travail.