An investigation of phenolic glycoside and condensed tannin homeostasis in Populus by salicyl alcohol feeding to cell cultures and by transgenic manipulation of the sucrose transporter, PTSUT4, in planta

Secondary metabolites play an important role in plant protection against biotic and abiotic stress. In Populus, phenolic glycosides (PGs) and condensed tannins (CTs) are two such groups of compounds derived from the common phenylpropanoid pathway. The basal levels and the inducibility of PGs and CTs depend on genetic as well as environmental factors, such as soil nitrogen (N) level. Carbohydrate allocation, transport and sink strength also affect PG and CT levels. A negative correlation between the levels of PGs and CTs was observed in several studies. However, the molecular mechanism underlying such relation is not known. We used a cell culture system to understand negative correlation of PGs and CTs. Under normal culture conditions, neither salicin nor higher-order PGs accumulated in cell cultures. Several factors, such as hormones, light, organelles and precursors were discussed in the context of aspen suspension cells’ inability to synthesize PGs. Salicin and its isomer, isosalicin, were detected in cell cultures fed with salicyl alcohol, salicylaldehyde and helicin. At higher levels (5 mM) of salicyl alcohol feeding, accumulation of salicins led to reduced CT production in the cells. Based on metabolic and gene expression data, the CT reduction in salicin-accumulating cells is partly a result of regulatory changes at the transcriptional level affecting carbon partitioning between growth processes, and phenylpropanoid CT biosynthesis. Based on molecular studies, the glycosyltransferases, GT1-2 and GT1-246, may function in glycosylation of simple phenolics, such as salicyl alcohol in cell cultures. The uptake of such glycosides into vacuole may be mediated to some extent by tonoplast localized multidrug-resistance associated protein transporters, PtMRP1 and PtMRP6. In Populus, sucrose is the common transported carbohydrate and its transport is possibly regulated by sucrose transporters (SUTs). SUTs are also capable of transporting simple PGs, such as salicin. Therefore, we characterized the SUT gene family in Populus and investigated, by transgenic analysis, the possible role of the most abundantly expressed member, PtSUT4, in PG-CT homeostasis using plants grown under varying nitrogen regimes. PtSUT4 transgenic plants were phenotypically similar to the wildtype plants except that the leaf area-to-stem volume ratio was higher for transgenic plants. In SUT4 transgenics, levels of non-structural carbohydrates, such as sucrose and starch, were altered in mature leaves. The levels of PGs and CTs were lower in green tissues of transgenic plants under N-replete, but were higher under N-depleted conditions, compared to the levels in wildtype plants. Based on our results, SUT4 partly regulates N-level dependent PG-CT homeostasis by differential carbohydrate allocation.

Populus spp : estabilidad y ganancia genética sobre la altura media dominante en tres ambientes de la pampa ondulada, Argentina

El objetivo de este trabajo fue evaluar la altura media dominante (AMD) y su estabilidad en 15 clones de álamos de 5 años de edad, implantados en tres ambientes diferentes de la pampa ondulada, Argentina. Los sitios fueron: Teodelina (Sitios 1 y 2), Santa Fe (34° 12' LS; 61° 43' W; 90 msnm) y Alberti (Sitio 3), Buenos Aires (34° 50' LS; 60° 30' W; 55 msnm) y se caracterizaron en base a variables de clima y suelo. Se realizaron los análisis de la varianza del conjunto de clones entre sitios y entre los clones por sitio. La comparación de AMD se realizó aplicando el test de Tukey. Se analizó la interacción clon-sitio. Se construyó un criterio de elección basado en parámetros genéticos de estabilidad sobre el carácter (AMD), estimándose la ganancia genética al seleccionar los mejores clones. Se realizaron los cálculos de heredabilidad en sentido amplio. Los posicionamientos en AMD fueron significativos entre clones por sitio y entre sitios. La interacción clon sitio fue significativa. Los valores de AMD y los de ecovalencia permitieron seleccionar genomas con mayor amplitud de adaptación y consecuentemente conciliar la producción con la plasticidad dentro de la disimilitud de los sitios evaluados.

Fuste comercial de clones del género Populus : relación entre volumen y densidad de la madera con nutrientes inorgánicos

El objetivo del trabajo fue determinar sobre 10 clones de álamos, provenientes de cruzamientos intraespecíficos de Populus deltoides e interespecíficos de Populus x canadensis, implantados en Teodelina, Santa Fe, Argentina (34°09' S; 61°15' W), la concentración de nutrientes inorgánicos en su corteza y leño, y sus relaciones con los volúmenes comerciales alcanzados a los 9 años de edad y la densidad básica de la madera. Se apearon ejemplares seleccionados, se calculó su volumen comercial individual y se determinaron la densidad básica y las concentraciones de Ca, Mg, P y K en fuste y corteza. Se realizó análisis de la varianza, test de comparación de medias de Tukey y correlación simple de los diferentes parámetros evaluados. Los resultados arrojaron diferentes contenidos de nutrientes por clon y concentraciones más bajas en la madera que en la corteza, en todos los casos. No hubo correlaciones significativas entre el volumen comercial obtenido, los valores de densidad básica de la madera y los nutrientes inorgánicos, indicando eficiencias individuales en el uso de los recursos inorgánicos.

Populus spp. : : supervivencia y crecimiento en clones implantados en Buenos Aires, Argentina

El objetivo de este trabajo fue evaluar la supervivencia, evolución de las alturas y áreas basales de rebrotes de clones de Populus spp. de diferentes procedencias implantados en Argiudoles típicos del borde Sur de la Pampa Ondulada, Buenos Aires, Argentina (34°55' S; 57°57' W; 15 m snm). Los clones evaluados fueron ‘Delta Gold’, ‘Stoneville 71’, ‘Catfish 2’, ‘Harvard’, ‘Onda’ e ‘I-74/51’. Se compararon, para el conjunto de clones, los comportamientos para el primero y segundo corte. Se realizó una evaluación de los resultados clonales al segundo turno de los valores dasométricos logrados. Los valores anuales en área basal individual media y las alturas totales medias observados desde el 2° al 8° año con los obtenidos al año 9, se correlacionaron año a año mediante un modelo lineal. Se observó una prevalencia de los clones de procedencia de los Estados Unidos. Las alturas logradas al primer turno fueron significativamente mayores que las del segundo turno, en tanto los valores en área basal resultaron mayores en la segunda cosecha que en la primera. Los coeficientes de correlación fueron significativos a partir del cuarto año; esta relación temprana permitiría la selección anticipada de los parámetros de crecimiento para el régimen de tallar.

Índices de calidad de sitio de Populus nigra ‘Italica’ en plantaciones lineales en el noroeste de Chubut

En el noroeste del Chubut, los álamos se encuentran establecidos en cortinas de protección en predios de pastoreo o donde se cultivan pasturas y forrajes en secano. El Populus nigra ‘Italica’ es el clon más difundido en plantaciones lineales, ubicadas en diferentes calidades de sitio. No existen antecedentes sobre crecimiento en altura e Índice de Sitio en la zona. Se seleccionaron ocho sitios de muestreo, donde fueron apeados 24 árboles dominantes, a los que se les realizó análisis fustal. Con los pares de datos de edad-altura, resultantes del análisis de fuste de los árboles muestra, se ajustó el modelo de Chapman-Richards mediante técnicas de regresión no lineal. Se construyó una familia de curvas de crecimiento en altura, según la metodología de curva guía. Las curvas de Índice de Sitio, basadas en altura y edad, se construyeron mediante deducción matemática a partir de la función de crecimiento en altura, tomándose como edad de referencia 25 años a la altura del pecho. Se definieron cinco calidades de sitio, con un rango de 4 metros, con Índices de Sitio comprendidos entre 19 y 35 m.

Nueva especie de Melampsora sobre Populus deltoides Stoneville 70 en Mendoza, Argentina

En Argentina, al igual que en otros países, las plantaciones de álamo siempre han estado sujetas a peligros fitosanitarios. La roya, causada por Melampsora spp., es una de las enfermedades más serias a nivel mundial. La clasificación de las especies de Melampsora se basa principalmente en las características morfológicas de los estados uredial y telial, y a los hospederos que poseen en su estado aecial y telial. Dada la observación de pústulas con características diferentes a las de Melampsora larici-populina (única especie citada para la provincia de Mendoza), es que el objetivo del presente trabajo fue identificar la especie de Melampsora observada en álamos del clon Stoneville 70, localizados en el distrito de San Carlos, provincia de Mendoza, Argentina. Para ello, fueron tomadas al azar, muestras de hojas sintomáticas, a partir de las cuales se realizó la descripción sintomatológica y posteriormente microscópica, registrándose la morfometría de 100 uredosporas y teliosporas. Las características analizadas concuerdan con aquellas reportadas en la bibliografía para las especies M. larici-tremulae, M. magnusiana, M. pinitorqua y M. rostrupii. Debido a la dificultad que muestran estas especies en ser distinguidas, Wilson y Henderson (1966) adoptan el nombre de M. populnea como especie colectiva. Por ello, se considera oportuno citar a la especie encontrada como M. populnea hasta aclarar con estudios más profundos la identificación definitiva del microorganismo.

Evaluación de clones de Populus spp., a los dos años de edad, en dos micrositios de la región pampeana, Argentina

La producción de álamos en la pampa ondulada de la provincia de Buenos Aires podría constituir una actividad alternativa y/o complementaria, debido a zonas ecológicas favorables para su cultivo. En este contexto es importante conocer el comportamiento de los clones en los diversos ambientes para poder definir cuáles de ellos podrían presentar mayor estabilidad para los diferentes sitios. El objetivo del trabajo fue estudiar la interacción existente entre los parámetros de crecimiento y supervivencia de 16 clones de Populus spp. en dos micrositios geomorfológicamente diferentes en la región pampeana, Argentina. Los clones en estudio provienen de cruzamientos intraespecíficos de P. deltoides e interespecíficos de P. deltoides x P. nigra (Populus x canadensis). Se plantaron en dos ensayos, uno por cada situación geomórfica: loma y bajo, y se completó con un análisis estadístico comparando los ensayos en forma individual y conjunta. Cada ensayo se instaló con un diseño de bloques completos al azar. Las variables analizadas fueron la supervivencia, la altura media y el área basal al concluir el segundo año de crecimiento. Para el sitio regional evaluado, la interacción entre los clones y los micrositios fue significativa para las variables altura y supervivencia. La mayor disponibilidad de agua en el micrositio bajo produjo mayores crecimientos clonales con diferencias significativas respecto del micrositio loma. La estabilidad de los atributos de supervivencia y crecimiento frente a los micrositios es un objetivo fundamental en las plantaciones clonales. Siendo los micrositios una realidad ambiental importante, propia como variable no controlable, la reducción de la variabilidad de respuesta ante ellos permitiría la constitución de unidades de manejo más homogéneas.

Susceptibilidad a Septoria musiva de híbridos inter e intraespecíficos de Populus spp. implantados en dos micrositios de la Pampa Húmeda Argentina

En los álamos, una de las enfermedades con mayor influencia en la cantidad y calidad de la madera producida es la cancrosis originada por Septoriamusiva Peck . El objetivo del trabajo fue determinar en clones híbridos de álamos (Populus spp.) la incidencia y la severidad de la enfermedad producida por Septoria, en dos micrositios de un mismo sitio regional, en Alberti, Buenos Aires, Argentina. Los clones utilizados fueron obtenidos de cruzamientos intraespecíficos de Populus deltoides e interespecíficos de P. deltoides x P. nigra (= P. x canadensis). Se determinó la susceptibilidad a la enfermedad para cada clon/micrositio mediante la estimación de la incidencia, del número de cancros en guías y ramas, y la severidad de daños (ID). Los híbridos inter e intraespecíficos de P. deltoides presentaron respuesta clonal diferencial en la susceptibilidad a la cancrosis en ambas situaciones geomórficas: los híbridos provenientes de cruzamientos intraespecíficos resultaron resistentes, y los provenientes de cruzamientos interespecíficos susceptibles a la enfermedad. Las diferencias significativas entre clones, determinadas para el número de lesiones totales por posición en ambas situaciones geomórficas, no determinaron ID diferentes. El número de cancros identificados en cada posición constituye una herramienta de estimación de la susceptibilidad clonal a la cancrosis más exacta, teniendo en cuenta que los mayores perjuicios ocurren cuando las lesiones se presentan en las guías.

Establishment, expansion and regeneration of aspen (Populus tremula) in the Torneträsk area, subarctic Sweden

In subarctic Sweden, recent decadal colonization and expansion of aspen (Populus tremula L.) were recorded. Over the past 100 years, aspen became c. 16 times more abundant, mainly as a result of increased sexual regeneration. Moreover, aspen now reach tree-size (>2 m) at the alpine treeline, an ecotone that has been dominated by mountain birch (Betula pubescens ssp. czerepanovii) for at least the past 4000 years. We found that sexual regeneration in aspen probably occurred seven times or more within the last century. Whereas sexual regeneration occurred during moist years following a year with an exceptionally high June-July temperature, asexual regeneration was favored by warm and dry summers. Disturbance to the birch forest by cyclic moth population outbreaks was critical in aspen establishment in the subalpine area. At the treeline, aspen colonization was less determined by these moth outbreaks, and was mainly restricted by summer temperature. If summer warming persists, aspen spread may continue in subarctic Sweden, particularly at the treeline. However, changing disturbance regimes, future herbivore population dynamics and the responses of aspen's competitors birch and pine to a changing climate may result in different outcomes.

Evaluación de la capacidad de rebrote en clones híbridos de Populus destinados a la producción de biomasa para energía.

El objetivo del presente Trabajo Fin de Carrera es evaluar la habilidad para el rebrote a nivel clonal así como la producción de biomasa en el tiempo obtenida con diferentes clones híbridos de Populus, en dos plantaciones similares ubicadas en dos diferentes ambientes. El presente Trabajo Fin de Carrera, se enmarca dentro del proyecto de investigación “Cultivo forestales para la obtención de biomasa con fines energéticos” (RTA 2008 00025.C02.01), desarrollado en el CIFOR-INIA y dirigido por la Dra. Hortensia Sixto. El interés que pretende aportar esta evaluación es ayudar en la búsqueda de los clones que mejor se adapten a nuestras territorio, siendo estos clones lo más productivos posible.

Identificación y caracterización de una deshalogenasa de Populus

Identificación en el genoma de Populus de una proteína con actividad deshalogenasa y análisis de su actividad enzimática.

Respuesta transcripcional de Populus a bifenilos policlorados: Aspectos aplicados a la fitorremediación

La degradación del suelo ha adquirido una magnitud preocupante. Los métodos tradicionales de descontaminación, son costosos e insuficientes. La fitorremediación representa una alternativa eficaz, de bajo coste, respetuosa con el medio ambiente, que además mejora las propiedades del suelo, si bien ha habido desarrollos relevantes en la última década. Desde el punto de vida científico, el reto principal es descifrar las rutas metabólicas implicadas en respuesta a contaminantes y comprender su regulación. Esta información es imprescindible si aspiramos a mejorar las capacidades naturales de algunas especies vegetales para remediar los suelos contaminados. Los estudios de esta Tesis se han centrado en Populus, el mejor modelo forestal disponible a raíz de la secuenciación de su genoma completo. Por otra parte, Populus tiene una gran capacidad natural para la degradación de contaminantes orgánicos, lo que explica su predominio en los programas forestales de fitorremediación que se desarrollan actualmente. Hemos elegido en concreto al híbrido Populus tremula x P. alba, por la facilidad con que se cultiva y su particular interés biotecnológico. La presente Tesis plantea un estudio comprehensivo de la respuesta molecular a bifenilos policlorados (PCBs), una familia de contaminantes orgánicos persistentes de particular relevancia a escala mundial. Se ha utilizado para ello una aproximación transcriptómica, basada en tecnología RNA-seq, para identificar los genes implicados en el metabolismo de los compuestos in planta y cuantificar sus niveles de activación en distintas situaciones controladas. La tesis pretende asimismo definir el control transcripcional subyacente a la respuesta bioquímica frente a este tipo de contaminantes. Resulta sorprendente que dicha respuesta sea prácticamente desconocida a nivel molecular, a pesar de su gran potencial aplicado en el contexto de la tecnología fitorremediadora. Para desarrollar este proyecto aplicamos a nuestros cultivos de chopo híbridos concentraciones diferentes de Aroclor 1221, una mezcla de PCBs muy utilizada a nivel comercial durante décadas, su uso está prohibido hoy internacionalmente. Y tomamos muestras de RNA a dos concentraciones y dos momentos distintos de exposición al contaminante, generando así una matriz de cuatro elementos con sus controles correspondientes. Con el fin de incrementar la especificidad de nuestro análisis, consideramos sobre todo los genes diferencialmente expresados más significativos según cuatro algoritmos estadísticos distintos. Por otra parte, realizamos análisis funcionales con herramientas bioinformáticas basadas en comparaciones de secuencias y en redes de co-expresión génica. La respuesta de los genes de particular interés fue validada mediante tecnología qRT-PCR (reacción de la polimerasa en cadena cuantitativa en tiempo real). Se trata del primer estudio comprehensivo de la respuesta de un organismo vegetal ante la presencia de PCBs. Este estudio nos ha permitido identificar una cantidad considerable de genes estructurales y reguladores, definiendo nuevos factores de transcripción cuya expresión es proporcional a la concentración de contaminante en el medio o al tiempo de exposición al mismo. Los análisis de correlación nos permiten afirmar en que la respuesta metabólica a PCBs, incluyendo posibles rutas degradadoras, participan en al menos quince factores de transcripción y unas cuarenta proteínas o enzimas que resultan particularmente inducidas. Entre las familias implicadas destacan los citocromos P450, la glutatión transferasas, las deshidrogenasas reductasas (short-chain dehydrogenase reductase) y las proteínas MDR (multi-drug resistance). Mientras que los factores de transcripción encontrados pertenecen a la familia de ZF-TF, MYBs, WRKYs entre otros. También identificamos proteínas de función desconocida que no se habían vinculado previamente a este tipo de respuestas en plantas, como la CSP (cold-shock domain proteins). Para estudiar su posible relación con la presencia de PCBs, se caracterizó un gen de esta familia detectado mediante espectrometría de masas en tándem (MS/MS) a partir de mapas IEF x SDS-PAGE (isoelectro focusing x sodium dodecyl sulphate- polyacrylamide gel electrophoresis) de alta resolución. Mediante qRT-PCR pudimos confirmar la inducción del gen correspondiente, ortólogo a PtCSP4 de P. trichocarpa (Potri.004g172600), en respuesta a Aroclor 1221. El análisis fenotípico de las líneas transgénicas de Arabidopsis thaliana que sobre-expresaba la proteína CSP de chopo híbrido confirmó un papel para la misma tolerancia a PCBs, posiblemente a través de mecanismos reguladores que activan proteínas MDR. Este trabajo, además de aportar datos novedosos sobre los mecanismos moleculares desencadenados por la presencia de un PCB en Populus, utilizado aquí como sistema modelo. Con ello se demuestra el potencial de las especies arbóreas no solo como agentes descontaminantes, ya explotado comercialmente, sino también como fuente potencial de genes interesantes. Entre los genes identificados en esta Tesis hay candidatos evidentes a participar en mecanismos de tolerancia al estrés inducido por la contaminación y también rutas metabólicas degradadores de PCBs. Precisamente la posibilidad de degradar al contaminante confiere particular interés a este tipo de estudios frente a la fitorremediación de metales pesados y otros contaminantes elementales. La comparación de los datos generados en este estudio con estudios análogos que se realicen en el futuro con otras especies y xenobióticos, contribuirán a definir mejor la respuesta de las plantas ante la contaminación orgánica y mejorar su potencial descontaminante. ABSTRACT Soil degradation has acquired a disturbing magnitude. Traditional methods of decontamination are expensive and insufficient. Phytoremediation represent an effective alternative, low cost, respectful of the environment, that also improves soil properties, although there have been relevant developments in the last decade. From a life scientist, the challenge is to decipher the major metabolic pathways involved in response to pollutants and understand their regulation. This information is essential if we desire to enhance the natural abilities of some plant species to remediate contaminated soils. This thesis studies have focused on Populus, the best available forestry model following the sequencing of the entire genome. Moreover, Populus has a natural ability to degrade organic pollutants, which explains its predominance in phytoremediation forestry programs currently being developed. We have chosen specifically to hybrid Populus tremula x P. alba, the ease with which it is grown and its particular biotechnological interest. This thesis presents a comprehensive study of the molecular response to polychlorinated biphenyls (PCBs), a family of persistent organic pollutants of particular relevance worldwide. It has been used for a transcriptomic approach using RNA-seq technology, to identify genes involved in the metabolism of compounds in plant and quantify their levels of activation in different controlled situations. The thesis also aims to define the underlying transcriptional control the biochemical response to these pollutants. It is surprising that the response is virtually unknown at the molecular level, despite its great potential applied in the context of phytoremediation technology. To develop this project we applied our hybrid poplar crops different concentrations of Aroclor 1221, a mixture of PCBs widely used commercially for decades, its use is now banned internationally. And we RNA samples at two different concentrations and times of exposure to the pollutant, generating an array of four elements with their corresponding controls. In order to increase the specificity of our analysis, we consider mainly the most significant differentially expressed genes in four different statistical algorithms. Moreover, functional analyzes conducted with bioinformatics tools based on sequence comparisons and networks gene co-expression. The response of genes of particular interest was validated by qRT-PCR (polymerase reaction chain in real-time quantitative. This is the first comprehensive study of the response of a plant organism in the presence of PCBs. This study allowed us to identify a considerable amount of structural and regulatory genes, defining new transcription factors whose expression is proportional to the concentration of contaminant in the middle or at the time of exposure. Correlation analyzes allow us to affirm that the metabolic response to PCBs, including possible degradative pathways, at least fifteen involved in transcription factors and forty proteins or enzymes which are particularly induced. Among the families involved include cytochromes P450, the glutathione transferases, dehydrogenases reductases (short -chain dehydrogenase reductase) and MDR proteins (multi - drug resistance). While transcription factors belong to the family found ZF-TF, MYBs, WRKYs among others. We also identify proteins of unknown function that had not been previously linked to such responses in plants such as CSP (cold- shock domain proteins). To study their possible relationship with the presence of PCBs, a gene in this family was characterized and was detected by tandem mass spectrometry (MS/MS) from maps IEF x SDS -PAGE (sodium dodecyl isoelectro x sulphate- polyacrylamide gel electrophoresis) of high resolution. By qRT -PCR could confirm the induction of the corresponding gene, ortholog to PtCSP4 of P. trichocarpa (Potri.004g172600), in response to Aroclor 1221. Phenotypic analysis of transgenic Arabidopsis thaliana lines over- expressing the protein CSP poplar hybrid confirmed a role for PCBs same tolerance, possibly through regulatory mechanisms activated MDR proteins. This work, in addition to providing new data on the molecular mechanisms triggered by the presence of PCBs in Populus, used here as a model system. Thus the potential of tree species not only as decontamination agents, and commercially exploited, but also as a potential source of interesting genes is shown. Among the genes identified in this thesis there are evident candidates to participate in tolerance mechanisms to stress induced by pollution and degrading metabolic pathways of PCBs. Precisely the possibility of degrading the pollutant attaches particular interest to this type of study off the phytoremediation of heavy metals and other elemental pollutants. The comparison of the data generated in this study with similar studies carried out in the future with other species and xenobiotics contribute to better define the response of plants to organic pollution and improve their decontamination potential.