Transformação genética em cevada por bombardeamento de partículas

A presente Tese de Doutorado objetivou: (1) definir um método eficiente de transformação genética, por bombardeamento de partículas, para a obtenção de plantas transgênicas de cultivares brasileiras de cevada e (2) identificar gene(s) codificante(s) de quitinase(s) potencialmente capaz(es) de conferir resistência ao fungo patogênico de cevada Bipolaris sorokiniana. Culturas de calos obtidos a partir de escutelos imaturos das cultivares Brasileiras de cevada MN-599 e MN-698 (Cia. de Bebidas das Américas, AMBEV) foram bombardeadas com partículas de tungstênio e avaliadas quanto à expressão do gene repórter gusA através de ensaios histoquímicos de GUS e quanto ao efeito dos bombardeamentos na indução estruturas embriogênicas e regeneração de plantas. As condições de biobalística analisadas incluíram a região promotora regulando a expressão de gusA, tipo e pressão de gás hélio de dois aparelhos de bombardeamento, distância de migração das partículas, número de tiros e a realização de pré e pós-tratamento osmótico dos tecidos-alvo. No presente trabalho foram obtidos um número bastante alto de pontos azuis por calo, a indução de calos embriogênicos e embriões somáticos em uma freqüência de até 58,3% e a regeneração de 60 plantas, sendo 43 de calos bombardeados. As melhores condições observadas foram o promotor e primeiro íntron do gene Adh de milho (plasmídeo pNGI), o aparelho de bombardeamento “ Particle Inflow Gun” (PIG) utilizando-se a distância de migração de partículas de 14,8 cm, dois tiros disparados por placa e a realização de tratamento osmótico dos explantes com 0,2 M de manitol e 0,2 M de sorbitol 4-5 horas antes e 17-19 horas depois dos bombardeamentos. Das 43 plantas obtidas de calos bombardeadas, 3 apresentaram atividade de GUS na base das suas folhas. A utilização de primers sintéticos definidos a partir de genes de quitinases descritos na literatura em PCRs resultou na amplificação de dois fragmentos de aproximadamente 700 e 500 pb a partir de DNA total das cvs. MN-599 e MN-698 de cevada e um fragmento, com aproximadamente 500 pb, a partir do DNA total do isolado A4c de Trichoderma sp. Estes fragmentos foram purificados dos géis de agarose e diretamente seqüenciados de forma manual e automática. Os fragmentos de 700 e 500 pb amplificados do genoma da cultivar MN-599 foram identificados como genes de quitinases de cevada e o fragmento de 500 pb do isolado A4c de Trichoderma sp. não apresentou homologia com seqüências conhecidas de quitinases depositadas no EMBL/GenBank. A utilização de novos pares de primers, representando seqüências conservadas de quitinases do fungo Metarhizium anisopliae, resultou na amplificação de 3 fragmentos a partir do DNA total do isolado A4b de Trichoderma sp., que estão sendo purificados para realização de seqüenciamento.

Expressão de uma quitinase de Metarhizium anisopliae em Nicotiana tabacum : obtenção de plantas transgênicas resistentes a doenças fúngicas

A resistência a doenças em plantas transgênicas tem sido obtida por meio da expressão de genes isolados de bactérias, fungos micoparasitas e plantas. Neste trabalho, relatamos a utilização de um gene do fungo entomopatogênico Metarhizium anisopliae como modo de gerar resistência a doenças fúngicas em plantas. O gene chit1 codifica a quitinase CHIT42 (EC 3.2.1.14), pertencente a uma classe de glicosil-hidrolases capazes de converter quitina em oligômeros de N-acetil-glicosamina (NAcGlc). Quando presentes em tecidos vegetais, supõese que as quitinases ataquem especificamente a parede celular de fungos invasores, provocando danos às hifas e causando a morte por lise das células fúngicas. Deste modo, dois diferentes grupos de plantas transgênicas de Nicotiana tabacum foram produzidos: no primeiro deles, denominado chitplus, os indivíduos possuem o gene chit1 sob o controle do promotor CaMV 35S. O segundo grupo, demoninado chitless, consiste de plantas transformadas com um T-DNA não contendo o gene do fungo. Trinta e quatro plantas transgênicas resistentes à canamicina (17 de cada grupo) foram regeneradas a partir de discos de folhas infectados por Agrobacterium tumefaciens. A produção da quitinase em extratos protéicos de folhas foi analisada por zimogramas em SDS-PAGE contendo glicol-quitina e corados por calcoflúor branco, na forma de um screening dos transgênicos primários. As plantas transgênicas foram testadas, ainda, por meio de ensaios colorimétricos empregando oligômeros sintéticos de NAcGlc como substratos específicos, além de immunoblot e Western blot com soro anti-quitinase. A quantidade de enzima recombinante nas plantas chitplus variou desde nenhuma atividade detectável a elevados níveis de expressão da enzima. A hibridização de Southern blot demonstrou que o número de cópias do gene chit1 integradas no genoma vegetal foi estimado entre uma e quatro. A primeira geração de plantas transgênicas geradas por autofecundação de parentais portadores de duas cópias do transgene foi testada com relação à estabilidade da herança do transgene e em 43 de um total de 67 descendentes, originados de quatro cruzamentos independentes, o padrão de segregação não diferiu das proporções Mendelianas esperadas. Ensaios de resistência, desafiando as plantas transgênicas com o basidiomiceto Rhizoctonia solani foram realizados e uma evidente diminuição da área foliar contendo lesões fúngicas foi observada entre as linhagens transgênicas, embora variações na atividade quitinolítica tenham influenciado o nível de resistência. Nossos resultados sugerem uma relação direta entre a atividade específica de quitinase e ao aumento nos níveis de resistência às lesões causadas pela infecção por R. solani.

Validação de conteúdo de instrumentos sobre conhecimento e habilidade em sondagem nasogástrica

Este estudo teve como objetivo construir e validar conteúdo de instrumentos avaliativos sobre conhecimento e habilidade de enfermagem no procedimento de sondagem nasogástrica. Trata-se de um estudo metodológico realizado na Universidade Federal do Rio Grande do Norte (UFRN) e na Universidade do Estado do Rio Grande do Norte (UERN). A amostra foi composta por 23 juízes, selecionados a partir dos critérios de inclusão: serem enfermeiros, docentes nas disciplinas de Semiologia e/ou Semiotécnica de Enfermagem, ter no mínimo um ano de experiência nestas disciplinas e ser das instituições selecionadas para o estudo. A pesquisa se desenvolveu em três etapas: (A) construção de dois instrumentos com base na revisão da literatura que resultou em um roteiro de observação da habilidade estruturado composto por 28 itens e um questionário sobre o conhecimento com 12 questões; (B) submissão dos instrumentos aos juízes, no período de junho a setembro de 2012, os quais deveriam julgar cada item como adequado , adequado com alterações ou inadequado , além de fazer uma avaliação geral de cada instrumento baseada em 10 critérios adaptados do referencial metodológico de Pasquali; e (C) validação com a verificação do nível de concordância entre os juízes, por meio da aplicação do Índice de Validade de Conteúdo (IVC) e do Índice Kappa. Utilizou-se o nível de consenso maior que 0,75 para o IVC e maior que 0,61 (bom) para o Índice Kappa. Estudo aprovado pelo Comitê de Ética em Pesquisa do Hospital Universitário Onofre Lopes (CEP/HUOL), sob CAAE nº 0002.0.294.000-10. Após serem codificados e tabulados, os dados foram analisados por meio de estatística descritiva. Dos 23 juízes, 87% eram do sexo feminino, com média de idade de 36,5 anos, 73,9% atuavam na UFRN, 78,3% possuíam mestrado acadêmico e 69,6% atuavam exclusivamente na docência. A média de tempo de experiência na docência foi de 7,9 anos e nas disciplinas de Semiologia e/ou Semiotécnica de Enfermagem foi de 5,6 anos. No julgamento do roteiro de observação estruturado e do questionário sobre o conhecimento, nenhum item/questão considerou-se inadequado, uma vez que todos obtiveram nível de concordância dentro dos índices estabelecidos (IVC > a 0,75 e Kappa > 0,61). Em relação ao roteiro estruturado para avaliar habilidade, dos 28 itens presentes, 13 apresentaram índice de concordância perfeito (IVC=1,00; Kappa= 1,00) e outros 15 foram considerados adequados com alterações, principalmente no que diz respeito à sequência instrucional dos tópicos, clareza e vocabulário. No questionário sobre o conhecimento, dentre as 12 questões que o compunham, 03 apresentaram índice de concordância perfeito e as demais adequadas com alterações quanto aos critérios vocabulário, clareza, atualização e precisão. Em relação à avaliação geral dos instrumentos, o roteiro estruturado de habilidade obteve IVC de 0,95 e Kappa de 0,91 e o questionário do conhecimento, IVC de 0,97 e Kappa de 0,94. Os dois instrumentos mostraram-se válidos quanto ao seu conteúdo, e constituem ferramentas para fomentar a qualidade da assistência de enfermagem em relação ao conhecimento e à habilidade em sondagem nasogástrica

Desempenho da mamoneira IAC 2028 em função do espaçamento entre fileiras e população de plantas na safrinha

Fundação de Amparo à Pesquisa do Estado de São Paulo (FAPESP)

Análise das provas objetivas de química dos vestibulares da UFRN de 1997 a 2010: uma caracterização a partir das mudanças

Las pruebas de vestibular, en los últimos años en el Brasil, han sido objeto de diversas investigaciones, considerando que ese proceso selectivo es una de las vias para ingresar en las universidades públicas y termina por influenciar la enseñanza en las escuelas. De esa forma, algunos vestibulares han pasado por cambios, de un simple proceso selectivo clasificatorio a un proceso fundamentado en reflexiones sociológica, pedagógica y crítica, lo que ha promovido cuestionamientos respecto del aprendizaje y de su papel en la escuela. Delante de esa realidad, la Universidad Federal de Rio Grande del Norte (UFRN) ha implementado cambios en sus vestibulares procurando una aproximación a las Orientaciones Curriculares Nacionales, como los PCNEM, los PCN+ y las OCEM. Siendo así, el objetivo de este estudio fue caracterizar el avance cualitativo en las pruebas de preguntas objetivas a partir de los cambios ocurridos en el vestibular de la UFRN en el periodo de 1997 a 2010, definiéndose las siguientes cuestiones de estudio: ¿Cuáles son los tipos de preguntas que caracterizan las pruebas objetivas de Química del vestibular? ¿Cuáles cuestiones presentan las mayores dificultades para los candidatos? ¿Cuáles son los contenidos conceptuales privilegiados? ¿En qué tipo de preguntas los candidatos presentan mayores índices de éxitos? ¿Qué diferencias pueden ser establecidas entre las preguntas antes y después del periodo que establece los cambios en el vestibular de la UFRN? Las discusiones teóricas del estudio están fundamentadas en las siguientes referencias: PCNEM (BRASIL, 1999), PCN+ (BRASIL, 2001), OCEM (BRASIL, 2006), Zabala (1999), Jiménez Aleixandre et al. (2003), Pozo (1999), Álvarez de Zayas (1992), Núñez (2009), Relatorios Comperve/UFRN (1997 a 2010), e en relación a las evaluaciones: Pasquali et al. (2003), Silva y Núñez (2008), Marín y Benarrouch (2009). Para el estudio fueran construidas las siguientes categorías que permitieran el análisis de las cuestiones: contextualización de la cuestión, temas conceptuales, problema, representación semiótica, cálculo matemático, pertinencia de la cuestión e índice de acierto. Los resultados muestran un avance cualitativo de las preguntas de Química, en los cuales se observa un modelo de prueba que prioriza el uso de verdaderos problemas, de situaciones contextualizadas, de pocos cálculos, dándose prioridad al razonamiento que implica la comprensión, la aplicación y la interpretación de los conocimientos conceptuales, todo lo que puede estimular una enseñanza más adecuada en relación a las exigencias actuales de la Educación en Química

Repetitive DNA probe linked to sex chromosomes in hybrids between Neotropical fish Leporinus macrocephalus and Leporinus elongatus (Characiformes, Anostomidae)

Fundação de Amparo à Pesquisa do Estado de São Paulo (FAPESP)

Genetic structure of the ornamental tetra fish species Piabucus melanostomus Holmberg, 1891 (CHARACIDAE, IGUANODECTINAE) in the Brazilian Pantanal wetlands inferred by mitochondrial DNA sequences

Fundação de Amparo à Pesquisa do Estado de São Paulo (FAPESP)

Cytogenetic mapping of the W chromosome in the genus Leporinus (Teleostei, Anostomidae) using a highly repetitive DNA sequence

Fundação de Amparo à Pesquisa do Estado de São Paulo (FAPESP)

Cytogenetic characterisation of the ornamental freshwater fish, Piabucus melanostomus (Iguanodectinae) from Brazilian wetlands and its relation with species of Characidae basal group

Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior (CAPES)

Trends in the karyotypic evolution of the Neotropical catfish family Heptapteridae Bockmann 1998 (Teleostei: Siluriformes)

Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e Tecnológico (CNPq)

Effectiveness of estradiol valerate on sex reversion in Astyanax altiparanae (Characiformes, Characidae)

Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior (CAPES)

Characterization and genome organization of a repetitive element associated with the nucleolus organizer region in leporinuselongatus (anostomidae: Characiformes)

Chromosome mapping and studies of the genomic organization of repetitive DNA sequences provide valuable insights that enhance our evolutionary and structural understanding of these sequences, as well as identifying chromosomal rearrangements and sex determination. This study investigated the occurrence and organization of repetitive DNA sequences in Leporinus elongatus using restriction enzyme digestion and the mapping of sequences by chromosomal fluorescence in situ hybridization (FISH). A 378-bp fragment with a 54.2% GC content was isolated after digestion with the SmaI restriction enzyme. BLASTN search found no similarity with previously described sequences, so this repetitive sequence was named LeSmaI. FISH experiments were conducted using L. elongatus and other Anostomidae species, i.e. L. macrocephalus,L. obtusidens, L. striatus, L. lacustris, L. friderici, Schizodon borellii, S. isognathus, and Abramites hypselonotus which detected signals that were unique to male and female L. elongatus individuals. Double-FISH using LeSmaI and 18S rDNA showed that LeSmaI was located in a nucleolus organizer region (NOR) in the male and female metaphases of L. elongatus. This report also discusses the role of repetitive DNA associated with NORs in the diversification of Anostomidae species karyotypes. Copyright © 2012 S. Karger AG, Basel.

Chromosome mapping of repetitive sequences in Anostomidae species: Implications for genomic and sex chromosome evolution

Background: Members of the Anostomidae family provide an interesting model system for the study of the influence of repetitive elements on genome composition, mainly because they possess numerous heterochromatic segments and a peculiar system of female heterogamety that is restricted to a few species of the Leporinus genus. The aim of this study was to isolate and identify important new repetitive DNA elements in Anostomidae through restriction enzyme digestion, followed by cloning, characterisation and chromosome mapping of this fragment. To identify repetitive elements in other Leporinus species and expand on studies of repetitive elements in Anostomidae, hybridisation experiments were also performed using previously described probes of LeSpeI repetitive elements. Results: The 628-base pair (bp) LeSpeII fragment was hybridised to metaphase cells of L. elongatus individuals as well as those of L. macrocephalus, L. obtusidens, L. striatus, L. lacustris, L. friderici, Schizodon borellii and S. isognathus. In L. elongatus, both male and female cells contained small clusters of LeSpeII repetitive elements dispersed on all of the chromosomes, with enrichment near most of the terminal portions of the chromosomes. In the female sex chromosomes of L. elongatus (Z2,Z2/W1W 2), however, this repeated element was absent. In the remaining species, a dispersed pattern of hybridisation was observed on all chromosomes irrespective of whether or not they were sex chromosomes. The repetitive element LeSpeI produced positive hybridisations signals only in L. elongatus, L. macrocephalus and L. obtusidens, i.e., species with differentiated sex chromosomes. In the remaining species, the LeSpeI element did not produce hybridisation signals. Conclusions: Results are discussed in terms of the effects of repetitive sequences on the differentiation of the Anostomidae genome, especially with respect to sex chromosome evolution. LeSpeII showed hybridisation patterns typical of Long Interspersed Elements (LINEs). The differential distribution of this element may be linked to sex chromosome differentiation in L. elongatus species. The relationship between sex chromosome specificity and the LeSpeI element is confirmed in the species L. elongatus, L. macrocephalus and L. obtusidens. © 2012 da Silva et al.; licensee BioMed Central Ltd.

Cytogenetic analysis in Thoracocharax stellatus (Kner, 1858) (Characiformes, Gasteropelecidae) from Paraguay river basin, Mato Grosso, Brazil

Thoracocharax stellatus (Characiformes, Gasteropelecidae) is a small Neotropical species of fish, widely distributed in several rivers of South America. Evidence for karyotype heteromorphysm in populations from different geographical regions has been reported for this species. In this way, populations of T. stellatus from the Paraguay River basin were cytogenetically characterized and the results were compared with other studies performed in the same species but from different basins. The results showed a diploid number of 2n = 54 for T. stellatus, with chromosomes arranged in 6 metacentric (m), 6 submetacentric (sm), 2 subtelocentric (st) and 40 acrocentric (a), for both sexes, with a simple Nucleolus Organiser Region (NOR) system reported by the techniques of silver nitrate impregnation and fluorescent in situ hybridisation (FISH) using 18S rDNA sequences as probe. The distribution of constitutive heterochromatin, observed by the C-band technique and Chromomycin A3 staining showed great similarity among the analyzed populations and consists mainly of discrete blocks in the pericentromeric and telomeric regions of most chromosomes. The presence of female heterogamety was alsoobserved indicating a ZZ/ZW system with W chromosome almost totally heterochromatic. The results also show cytogenetic diversity of the group and are useful to understand the mechanisms of karyotype evolution of the family. © Edson Lourenço da Silva et al.