A novel mucosal orthotopic murine model of human papillomavirus-associated genital cancers.

Cervical cancer results from infection with high-risk type human papillomaviruses (HPV). Therapeutic vaccines aiming at controlling existing genital HPV infections and associated lesions are usually tested in mice with HPV-expressing tumor cells subcutaneously implanted into their flank. However, effective vaccine-induced regression of these ectopic tumors strongly contrasts with the poor clinical results of these vaccines produced in patients with HPV-associated genital neoplasia. To assess HPV therapeutic vaccines in a more relevant setting, we have, here, established an orthotopic mouse model where tumors in the genital mucosa (GM) develop after an intravaginal instillation of HPV16 E6/E7-expressing tumor cells transduced with a luciferase-encoding lentiviral vector for in vivo imaging of tumor growth. Tumor take was 80-90% after nonoxynol-9 induced damage of the epithelium. Tumors remained localized in the genital tract, and histological analysis showed that most tumors grew within the squamous epithelium of the vaginal wall. Those tumors induced (i) E7-specific CD8 T cells restricted to the GM and draining lymph nodes, in agreement with their mucosal location and (ii) high Foxp3+ CD4+ infiltrates, similarly to those found in natural non-regressing HPV lesions. This novel genital HPV-tumor model by requiring GM homing of vaccine-induced immune responses able to overcome local immuno-suppression may be more representative of the situation occurring in patients upon therapeutic vaccination.

Gene therapy regenerates protein expression in cone photoreceptors in Rpe65(R91W/R91W) mice.

Cone photoreceptors mediate visual acuity under daylight conditions, so loss of cone-mediated central vision of course dramatically affects the quality of life of patients suffering from retinal degeneration. Therefore, promoting cone survival has become the goal of many ocular therapies and defining the stage of degeneration that still allows cell rescue is of prime importance. Using the Rpe65(R91W/R91W) mouse, which carries a mutation in the Rpe65 gene leading to progressive photoreceptor degeneration in both patients and mice, we defined stages of retinal degeneration that still allow cone rescue. We evaluated the therapeutic window within which cones can be rescued, using a subretinal injection of a lentiviral vector driving expression of RPE65 in the Rpe65(R91W/R91W) mice. Surprisingly, when applied to adult mice (1 month) this treatment not only stalls or slows cone degeneration but, actually, induces cone-specific protein expression that was previously absent. Before the intervention only part of the cones (40% of the number found in wild-type animals) in the Rpe65(R91W/R91W) mice expressed cone transducin (GNAT2); this fraction increased to 64% after treatment. Correct S-opsin localization is also recovered in the transduced region. In consequence these results represent an extended therapeutic window compared to the Rpe65(-/-) mice, implying that patients suffering from missense mutations might also benefit from a prolonged therapeutic window. Moreover, cones are not only rescued during the course of the degeneration, but can actually recover their initial status, meaning that a proportion of altered cones in chromophore deficiency-related disease can be rehabilitated even though they are severely affected.

Crohn's disease-associated polymorphism within the PTPN2 gene affects muramyl-dipeptide-induced cytokine secretion and autophagy.

BACKGROUND: The single nucleotide polymorphism (SNP) rs2542151 within the gene locus region encoding protein tyrosine phosphatase non-receptor type 2 (PTPN2) has been associated with Crohn's disease (CD), ulcerative colitis (UC), type-I diabetes, and rheumatoid arthritis. We have previously shown that PTPN2 regulates mitogen-activated protein kinase (MAPK) signaling and cytokine secretion in human THP-1 monocytes and intestinal epithelial cells (IEC). Here, we studied whether intronic PTPN2 SNP rs1893217 regulates immune responses to the nucleotide-oligomerization domain 2 (NOD2) ligand, muramyl-dipeptide (MDP). MATERIALS AND METHODS: Genomic DNA samples from 343 CD and 663 non-IBD control patients (male and female) from a combined German, Swiss, and Polish cohort were genotyped for the presence of the PTPN2 SNPs, rs2542151, and rs1893217. PTPN2-variant rs1893217 was introduced into T(84) IEC or THP-1 cells using a lentiviral vector. RESULTS: We identified a novel association between the genetic variant, rs1893217, located in intron 7 of the PTPN2 gene and CD. Human THP-1 monocytes carrying this variant revealed increased MAPK activation as well as elevated mRNA expression of T-bet transcription factor and secretion of interferon-γ in response to the bacterial wall component, MDP. In contrast, secretion of interleukin-8 and tumor necrosis factor were reduced. In both, T(84) IEC and THP-1 monocytes, autophagosome formation was impaired. CONCLUSIONS: We identified a novel CD-associated PTPN2 variant that modulates innate immune responses to bacterial antigens. These findings not only provide key insights into the effects of a functional mutation on a clinically relevant gene, but also reveal how such a mutation could contribute to the onset of disease.

The neuronal monocarboxylate transporter MCT2: its regulation by BDNF and its role in learning and memory

Glucose has been considered the major, if not the exclusive, energy substrate for the brain. But under certain physiological and pathological conditions other substrates, namely monocarboxylates (lactate, pyruvate and ketone bodies), can contribute significantly to satisfy brain energy demands. These monocarboxylates need to be transported across the blood-brain barrier or out of astrocytes into the extracellular space and taken up into neurons. It has been shown that monocarboxylates are transported by a family of proton-linked transporters called monocarboxylate transporters (MCTs). In the central nervous system, MCT2 is the predominant neuronal isoform and little is known about the regulation of its expression. Noradrenaline (NA), insulin and IGF-1 were previously shown to enhance the expression of MCT2 in cultured cortical neurons via a translational mechanism. Here we demonstrate that the well known brain neurotrophic factor BDNF enhances MCT2 protein expression in cultured cortical neurons and in synaptoneurosome preparations in a time- and concentrationdependent manner without affecting MCT2 mRNA levels. We observed that BDNF induced MCT2 expression by activation of MAPK as well as PI3K/Akt/mTOR signaling pathways. Furthermore, we investigated the possible post-transcriptional regulation of MCT2 expression by a neuronal miRNA. Then, we demonstrated that BDNF enhanced MCT2 expression in the hippocampus in vivo, in parallel with some post-synaptic proteins such as PSD95 and AMPA receptor GluR2/3 subunits, and two immediate early genes Arc and Zif268 known to be expressed in conditions related to synaptic plasticity. In the last part, we demonstrated in vivo that a downregulation of hippocampal MCT2 via silencing with an appropriate lentiviral vector in mice caused an impairment of working memory without reference memory deficit. In conclusion, these results suggest that regulation of neuronal monocarboxylate transporter MCT2 expression could be a key event in the context of synaptic plasticity, allowing an adequate energy substrate supply in situations of altered synaptic efficacy. - Le glucose représente le substrat énergétique majeur pour le cerveau. Cependant, dans certaines conditions physiologiques ou pathologiques, le cerveau a la capacité d'utiliser des substrats énergéiques appartenant à la classe des monocarboxylates (lactate, pyruvate et corps cétoniques) afin de satisfaire ses besoins énergétiques. Ces monocarboxylates doivent être transportés à travers la barrière hématoencéphalique mais aussi hors des astrocytes vers l'espace extracellulaire puis re-captés par les neurones. Leur transport est assuré par une famillle de transporteurs aux monocarboxylates (MCTs). Dans le système nerveux central, les neurones expriment principalement l'isoforme MCT2 mais peu d'informations sont disponibles concernant la régulation de son expression. Il a été montré que la noradrénaline, l'insuline et l'IGF-1 induisent l'expression de MCT2 dans des cultures de neurones corticaux par un mécanisme traductionnel. Dans cette étude nous démontrons dans un premier temps que le facteur neurotrophique BDNF augmente l'expression de MCT2 à la fois dans des cultures de neurones corticaux et dans les préparations synaptoneurosomales selon un décours temporel et une gamme de concentrations propre. Aucun changement n'a été observé concernant les niveaux d'ARNm de MCT2. Nous avons observé que le BDNF induisait l'expression de MCT2 par l'activation simultanée des voies de signalisation MAPK et PI3K/Akt/mTOR. De plus, nous nous sommes intéressés à une potentielle régulation par les micro-ARNs de la synthèse de MCT2. Ensuite, nous avons démontré que le BDNF induit aussi l'expression de MCT2 dans l'hippocampe de la souris en parallèle avec d'autres protéines post-synaptiques telles que PSD95 et GluR2/3 et avec deux « immediate early genes » tels que Arc et Zif268 connus pour être exprimés dans des conditions de plasticité synaptique. Dans un dernier temps, nous avons démontré qu'une diminution d'expression de MCT2 induite par le biais d'un siRNA exprimé via un vecteur lentiviral dans l'hippocampe de souris générait des déficits de mémoire de travail sans affecter la mémoire de référence. En conclusion, ces résultats nous suggèrent que le transporteur aux monocarboxylates neuronal MCT2 serait essentiel pour l'apport énergétique du lactate pour les neurones dans des conditions de haute activité neuronale comme c'est le cas pendant les processus de plasticité synaptique.

The JAK/STAT3 Pathway Is a Common Inducer of Astrocyte Reactivity in Alzheimer's and Huntington's Diseases.

Astrocyte reactivity is a hallmark of neurodegenerative diseases (ND), but its effects on disease outcomes remain highly debated. Elucidation of the signaling cascades inducing reactivity in astrocytes during ND would help characterize the function of these cells and identify novel molecular targets to modulate disease progression. The Janus kinase/signal transducer and activator of transcription 3 (JAK/STAT3) pathway is associated with reactive astrocytes in models of acute injury, but it is unknown whether this pathway is directly responsible for astrocyte reactivity in progressive pathological conditions such as ND. In this study, we examined whether the JAK/STAT3 pathway promotes astrocyte reactivity in several animal models of ND. The JAK/STAT3 pathway was activated in reactive astrocytes in two transgenic mouse models of Alzheimer's disease and in a mouse and a nonhuman primate lentiviral vector-based model of Huntington's disease (HD). To determine whether this cascade was instrumental for astrocyte reactivity, we used a lentiviral vector that specifically targets astrocytes in vivo to overexpress the endogenous inhibitor of the JAK/STAT3 pathway [suppressor of cytokine signaling 3 (SOCS3)]. SOCS3 significantly inhibited this pathway in astrocytes, prevented astrocyte reactivity, and decreased microglial activation in models of both diseases. Inhibition of the JAK/STAT3 pathway within reactive astrocytes also increased the number of huntingtin aggregates, a neuropathological hallmark of HD, but did not influence neuronal death. Our data demonstrate that the JAK/STAT3 pathway is a common mediator of astrocyte reactivity that is highly conserved between disease states, species, and brain regions. This universal signaling cascade represents a potent target to study the role of reactive astrocytes in ND.

MARCH1 : new insights in the activation of B cells

L’implication des cellules B dans le développement de l’auto-immunité ne cesse d’être illustrée par de récentes publications. Les cellules présentent des peptides du soi aux cellules T auto-réactives ce qui mène à la production de cytokines pro-inflammatoires et d’anticorps auto-réactifs. Dans le présent document, nous explorons la présentation antigénique et la modification post-traductionnelle du complexe majeur d’histocompatibilité II (CMH-II). MARCH1 est une E3 ubiquitine ligase qui cible le CMH-II et le relocalise le complexe vers les endosomes de recyclage. Ainsi, MARCH1 est un inhibiteur de la présentation d’antigènes exogènes. Ici, nous démontrons que MARCH1 est exprimé seulement dans la sous-population des cellules B folliculaires et que cette expression est perdue lors de l’entrée dans les centres germinatifs. Nous proposons que MARCH1 établie une barrière de formation de centres germinatifs. Nous démontrons le lien entre MARCH1 et la hausse de CMH-II à la surface des cellules B à la suite d’un traitement à l’IL-10. De plus, nous avons testé plusieurs stimuli activateurs des cellules B et démontrons que MARCH1 est régulé à la baisse dans tous les cas. De plus, nous mettons en valeurs le rôle de la voie canonique d’activation de NF-κB dans cette régulation de MARCH1. Finalement, nous avons développé un système de lentivirus exprimant MARCH1 qui nous permet de forcer l’expression de MARCH1 dans des cellules réfractaires à la transfection. Nous discutons de l’implication de cette régulation du CMH-II par MARCH1 dans le développement de maladies auto-immunes.

Stress oxydatif, fonction mitochondriale et maladie inflammatoire de l'intestin

CONTEXTE: Bien que la dysfunction mitochondriale et le stress oxydant jouent des rôles prépondérants dans plusieurs conditions pathologiques, ils n’ont pas été étudiés de façon extensive au niveau du tube digestif qui est constamment exposé aux oxydants (provenant de l’alimentation) et à divers agents pathogènes. L’ingestion simultanée de sels ferreux et d’acide ascorbique peut causer le dommage des macromolécules par oxydation. Le ‘’Nuclear factor erythroid 2 related factor’’ (Nrf2) est un important facteur de transcription sensible au potentiel redox et qui protège contre le stress oxydant en induisant des gènes anti-oxydants et de detoxification par sa liaison à l’élément de réponse antioxydante (ARE). Les fonctions anti-oxydantes et anti-inflammatoires de Nrf2 ont été décrites dans une variété de types cellulaires et de tissus. Cependant son rôle est très peu connu au niveau du tube digestif. OBJECTIFS: Les objectifs sont d’évaluer comment la peroxydation lipidique médiée par le fer/ascorbate (FE/ASC) affecte les fonctions mitochondriales dans les cellules Caco-2/15, et de déterminer l’ampleur de l’implication de Nrf2. MÉTHODES: Le stress oxydant a été induit dans les cellules Caco2/15 en les traitant avec 0.2mm/2mm de FE/ASC. L’augmentation de l’expression de Nrf2 a été obtenue suite au prétraitement des cellules Caco2/15 avec 50 μM d’Olitpraz (OPZ), un puissant activateur. L’invalidation du gène de Nrf2 a été réalisée dans les cellules par transfection avec un vecteur lentiviral contenant un shRNA contre Nrf2. RÉSULTATS: Nos résultats montrent que le traitement des cellules Caco-2/15 avec du FE/ASC (0.2 mm/2 mm) augmente les niveaux du malondialdehyde (MDA), réduit la production d’ATP, entraîne une surcharge mitochondriale de calcium, active l’expression protéique du cytochrome C et de l’AIF (apoptotic inducing factor), réduit l’activité des complexes I, II, 2 III et IV de la chaîne respiratoire mitochondriale, augmente les niveaux de 8-OHdG, un marqueur des dommages à l’ADN mitochondrial, diminue la DNA glycosylase, et altère les expressions génique et protéique des facteurs de transcription mitochondriaux (mtTFA, mtTFB1, mtTFB2). De plus, nos observations montrent que l’induction et l’activation de Nrf2 dans les cellules Caco-2/15 résultent en: une augmentation des enzymes anti-oxydantes endogènes (catalase, glutathion peroxydase, et superoxyde dismutase), une réduction du facteur nucléaire NFκβ et de TNF-α, une augmentation de la production d’ ATP et de l’activité des complexes respiratoires (I, II, III, IV) et de PGC-1α, et une régulation des niveaux de la prohibitine mitochondriale, du Bcl-2 anti-apoptotique et de l’occludine. CONCLUSION: Dans l’ensemble, nos résultats montrent que l’exposition aigüe des cellules Caco-2/15 à la peroxydation par le FE/ASC entraîne des effets pathologiques sur les fonctions mitochondriales et l’intégrité de l’ADN, qui sont abolis par l’induction de Nrf2. Il en ressort que Nrf2 joue un rôle majeur dans la protection de l’épithélium intestinal contre le stress oxydant.

Optimisation du vecteur adénoviral pour la thérapie génique de la dystrophie musculaire de Duchenne

La dystrophie musculaire de Duchenne (DMD) est une maladie très sévère, progressive et sans traitement vraiment efficace. Elle est caractérisée par l’absence fonctionnelle de la dystrophine, une protéine essentielle au maintien des muscles squelettiques. La thérapie génique est actuellement envisagée comme approche thérapeutique pour livrer la dystrophine dans les muscles. Les vecteurs adénoviraux de troisième génération (Helper-dependent adenoviral vector, HD) sont des véhicules de transfert génique très prometteurs pour traiter la DMD. Puisque les gènes adénoviraux ont été enlevés complètement du HD, ils sont peu toxiques, faiblement immunogéniques et ils possèdent un espace cargo suffisant pour transporter l’ADN codant complet de la dystrophine. Bien que le HD puisse fournir la dystrophine de façon thérapeutique chez des souris dystrophiques (mdx), l’expression du gène thérapeutique est progressivement perdue plusieurs mois suivant l’injection intramusculaire. Deux stratégies innovantes furent explorées dans cette thèse dans le but de stabiliser l’expression de la dystrophine. La première stratégie vise à l’intégration de l’ADN du HD dans les chromosomes cellulaires, ce qui pourrait le protéger contre son élimination progressive des muscles. Une intégrase site-spécifique issue du phage ΦC31 a été utilisée pour catalyser l’intégration d’un HD transportant un marqueur de sélection. Dans les cellules humaines et les myoblastes murins, l’activité de l’intégrase a été évaluée d’après son efficacité d’intégration (après sélection) et sa spécificité (dans les clones résistants). L’efficacité atteint jusqu’à 0,5 % par cellule et jusqu’à 76 % des événements d’intégration ont été réalisés de façon site-spécifique. Bien que des délétions aient été trouvées aux extrémités du vecteur, 70 % des clones analysés montraient une seule copie du vecteur intégré (le nombre attendu). Seulement une petite augmentation du nombre de brisures double-brin a été mesurée dans les myoblastes exprimant l’intégrase. En conclusion, l’intégration du HD est relativement efficace, spécifique et sécuritaire. Cette méthode est très prometteuse, car la dystrophine peut être livrée dans le muscle avec l’aide du HD et l’intégration de l’ADN du HD pourrait stabiliser son expression in vivo. La deuxième stratégie implique l’utilisation d’un nouveau promoteur musculospécifique (ΔUSEx3) pour réduire la toxicité induite liée à une expression trop étendue de la dystrophine. Dans cette étude, nous avons investigué l’effet du contexte viral sur l’activité du promoteur. Un HD et un vecteur lentiviral (LV) ont été construits avec le promoteur ΔUSEx3 pour contrôler l’expression d’un gène rapporteur. Les résultats démontrent que ΔUSEx3 confère une expression puissante, musculospécifique et stable (via le LV) in vitro. L’injection intramusculaire du HD a conduit à une expression puissante du transgène. Ces résultats contrastent avec ceux du LV, car après l’injection de ce dernier, l’expression était faible. La livraison du HD dans le muscle, mais aussi dans plusieurs organes démontre la musculospécificité de ΔUSEx3. Par conséquent, le contexte du vecteur et l’environnement musculaire modulent tous les deux l’activité de ΔUSEx3. Bien que ΔUSEx3 soit musculospécifique, d’autres études sont requises pour déterminer si le promoteur peut stabiliser l’expression de la dystrophine in vivo.

Expression, Purification, Bioactivity, and Partial Characterization of a Recombinant Human Bone Morphogenetic Protein-7 Produced in Human 293T Cells

Bone morphogenetic protein-7 (BMP-7) is a secreted multifunctional growth factor of the TGF-beta superfamily, which is predominantly known for its osteoinductive properties and emerging potential for treatment of kidney diseases. The mature 34-38 kDa disulfide-linked homodimer protein plays a key role in the differentiation of mesenchymal cells into bone and cartilage. In this study, the full-length sequence of hBMP-7 was amplified and, then, cloned, expressed, and purified from the conditioned medium of 293T cells stably transfected with a lentiviral vector. The mature protein dimer form was properly secreted and recognized by anti-BMP-7 antibodies, and the protein was shown to be glycosilated by treatment with exoglycosidase, followed by western blotting. Moreover, the activity of the purified protein was demonstrated both in vitro, by alkaline phosphatase activity in C2C12 cells, and in vivo by induction of ectopic bone formation in Balb/c Nude mice after 21 days, respectively. This recombinant protein platform may be very useful for expression of different human cytokines and other proteins for medical applications.

Transcription Factor CREB3L1 Regulates Vasopressin Gene Expression in the Rat Hypothalamus

Fundação de Amparo à Pesquisa do Estado de São Paulo (FAPESP)

Cloning and characterization of a novel alternatively spliced transcript of the human CHD7 putative helicase

Abstract Background The CHD7 (Chromodomain Helicase DNA binding protein 7) gene encodes a member of the chromodomain family of ATP-dependent chromatin remodeling enzymes. Mutations in the CHD7 gene are found in individuals with CHARGE, a syndrome characterized by multiple birth malformations in several tissues. CHD7 was identified as a binding partner of PBAF complex (Polybromo and BRG Associated Factor containing complex) playing a central role in the transcriptional reprogramming process associated to the formation of multipotent migratory neural crest, a transient cell population associated with the genesis of various tissues. CHD7 is a large gene containing 38 annotated exons and spanning 200 kb of genomic sequence. Although genes containing such number of exons are expected to have several alternative transcripts, there are very few evidences of alternative transcripts associated to CHD7 to date indicating that alternative splicing associated to this gene is poorly characterized. Findings Here, we report the cloning and characterization by experimental and computational studies of a novel alternative transcript of the human CHD7 (named CHD7 CRA_e), which lacks most of its coding exons. We confirmed by overexpression of CHD7 CRA_e alternative transcript that it is translated into a protein isoform lacking most of the domains displayed by the canonical isoform. Expression of the CHD7 CRA_e transcript was detected in normal liver, in addition to the DU145 human prostate carcinoma cell line from which it was originally isolated. Conclusions Our findings indicate that the splicing event associated to the CHD7 CRA_e alternative transcript is functional. The characterization of the CHD7 CRA_e novel isoform presented here not only sets the basis for more detailed functional studies of this isoform, but, also, contributes to the alternative splicing annotation of the CHD7 gene and the design of future functional studies aimed at the elucidation of the molecular functions of its gene products.

Glykolytische Aktivität von Ovarialkarzinomzelllinien in vitro und in vivo und die Bedeutung von HIF-1alpha

Ovarialkarzinome stellen eine schwer zu therapierende onkologische Erkrankung mit im Durchschnitt sehr schlechter Prognose dar. Die Notwendigkeit einer weiteren Verbesserung der Therapie dieser Erkrankung ist sehr offensichtlich. Studien an anderen Tumorentitäten haben die große Bedeutung des Glukosestoffwechsels, speziell des Laktats, in der Erken- nung, Kategorisierung und Therapie von onkologischen Erkrankungen gezeigt. In der Kon- trolle des Glukosestoffwechsels, aber auch vieler anderer Funktionen, wie z. B. des Tumor- wachstums und des Zellüberlebens, hat sich der Hypoxia Inducible Factor (HIF) als beson- ders wichtig herausgestellt. In der vorliegenden Arbeit wurde daher der Glukosestoffwechsel in Ovarialkarzinomen und seine Beeinflussung durch eine Herunterregulierung von HIF-1α untersucht. Hierzu wurden die Ovarialkarzinomzelllinien OC 316 und IGROV1 (Wildtyp) und die Zelllinie OC 316 mit einem lentiviralen Vektor zur Herunterregulierung von HIF-1α ver- wendet. Das Wachstumsverhalten, die Laktatproduktion und der Glukoseverbrauch wurden bei diesen Zelllinien in vitro untersucht. Darüber hinaus wurden mithilfe der bildgebenden Biolumineszenz ATP, Laktat, Pyruvat und Glukose in Xenotransplantaten dieser Zelllinien gemessen. Diese in unserer Arbeitsgruppe entwickelte Methode erlaubt die quantitative Er- fassung von Metaboliten in selektiven Gewebsarealen, wie z. B. in vitalen Tumorregionen, in stomatösen Arealen oder im tumornahen Normalgewebe.rnIn dieser Arbeit kann gezeigt werden, dass die glykolytische Aktivität von Ovarialkarzinom- zelllinien mit dem Wachstumsverhalten positiv korreliert ist. Eine Herunterregulierung von HIF-1α führt zu einer deutlichen Verlangsamung des Zellwachstums, wobei allerdings alle HIF-Zielgene betroffen sein können. Des Weiteren wird mit den hier gezeigten Daten die prognostische Bedeutung des Laktats bestätigt. Hohe Laktatwerte in vitro waren mit schnel- lerem Wachstum korreliert. Zusätzlich zeigen die vorliegenden Daten, dass die gewonnenen Befunde in vitro nur näherungsweise auf die in vivo Situation übertragbar sind. Eine Herun- terregulierung von HIF-1α zeigt keine signifikant unterschiedlichen Laktatwerte in den Xe- notransplantaten. Allerdings spiegeln sich zelllinienspezifische Unterschiede in der metabo- lischen Aktivität in vitro im metabolischen Verhalten der entsprechenden Xenografttumoren recht gut wider.rnDie gewonnenen Ergebnisse weisen zum einen auf die prognostische Bedeutung einer Bestimmung von Laktatkonzentrationen aus Tumorbiopsien hin und bestätigen zum anderen die klinische Aussagekraft metabolischer Aktivitätsmessungen mittels PET. Solche Daten könnten dazu dienen Patienten einer individualisierten Therapie zuzuführen. Außerdem wur- de die Effektivität, aber auch die Komplexität einer gegen HIF-1α gerichteten Therapie auf Protein- und Genebene bestätigt. Somit zeigen die erzielten Resultate einerseits Möglichkei- ten einer individualisierten Therapie auf, andererseits unterstreichen sie die große Notwen- digkeit weiterer Grundlagenforschung auf diesem Gebiet.

Homeodomain-only protein HOP is a novel modulator of late differentiation in keratinocytes

The homeodomain-only protein (HOP) contains an atypical homeodomain which is unable to bind to DNA due to mutations in residues important for DNA binding. Recently, HOP was reported to regulate proliferation/differentiation homeostasis in different cell types. In the present study, we performed transcriptional profiling of cultured primary human keratinocytes and noted a robust induction of HOP upon calcium-induced cell differentiation. Immunohistochemistry of human skin localized HOP to the granular layer in the epidermis. Overexpression of HOP using a lentiviral vector up-regulated FLG and LOR expression during keratinocyte differentiation. Conversely, decreasing HOP expression using small interfering RNA markedly reduced the calcium-induced expression of late markers of differentiation in vitro, with the most prominent effect on profilaggrin (FLG) mRNA. Moreover, mRNA levels of profilaggrin and loricrin were downregulated in the epidermis of HOP knockout mice. Analysis of skin disorders revealed altered HOP expression in lichen planus, psoriasis and squamous cell carcinoma (SCC). Our data indicate that HOP is a novel modulator of late terminal differentiation in keratinocytes.

The death-associated protein kinase 2 is up-regulated during normal myeloid differentiation and enhances neutrophil maturation in myeloid leukemic cells

The death-associated protein kinase 2 (DAPK2) belongs to a family of Ca(2+)/calmodulin-regulated serine/threonine kinases involved in apoptosis. During investigation of candidate genes operative in granulopoiesis, we identified DAPK2 as highly expressed. Subsequent investigations demonstrated particularly high DAPK2 expression in normal granulocytes compared with monocytes/macrophages and CD34(+) progenitor cells. Moreover, significantly increased DAPK2 mRNA levels were seen when cord blood CD34(+) cells were induced to differentiate toward neutrophils in tissue culture. In addition, all-trans retinoic acid (ATRA)-induced neutrophil differentiation of two leukemic cell lines, NB4 and U937, revealed significantly higher DAPK2 mRNA expression paralleled by protein induction. In contrast, during differentiation of CD34(+) and U937 cells toward monocytes/macrophages, DAPK2 mRNA levels remained low. In primary leukemia, low expression of DAPK2 was seen in acute myeloid leukemia samples, whereas chronic myeloid leukemia samples in chronic phase showed intermediate expression levels. Lentiviral vector-mediated expression of DAPK2 in NB4 cells enhanced, whereas small interfering RNA-mediated DAPK2 knockdown reduced ATRA-induced granulocytic differentiation, as evidenced by morphology and neutrophil stage-specific maturation genes, such as CD11b, G-CSF receptor, C/EBPepsilon, and lactoferrin. In summary, our findings implicate a role for DAPK2 in granulocyte maturation.

Inhibition of HIV-1 multiplication by a modified U7 snRNA inducing Tat and Rev exon skipping

The HIV-1 regulatory proteins Tat and Rev are encoded by multiply spliced mRNAs that differ by the use of alternative 3' splice sites at the beginning of the internal exon. If these internal exons are skipped, the expression of these genes, and hence HIV-1 multiplication, should be inhibited. We have previously developed a strategy, based on antisense derivatives of U7 small nuclear RNA, that allows us to induce the skipping of an internal exon in virtually any gene. Here, we have successfully applied this approach to induce a partial skipping of the Tat, Rev (and Nef) internal exons. Three functional U7 constructs were subcloned into a lentiviral vector. Two of them strongly reduced the efficiency of lentiviral particle production compared to vectors carrying either no U7 insert or unrelated U7 cassettes. This defect could be partly or fully compensated by coexpressing Rev from an unspliced mRNA in the producing cell line. Upon stable transduction into CEM-SS or CEM T-lymphocytes, the most efficient of these constructs inhibits HIV-1 multiplication. Although the inhibition is not complete, it is more efficient in combination with another mechanism inhibiting HIV multiplication. Therefore, this new approach targeting HIV-1 regulatory genes at the level of pre-mRNA splicing, in combination with other antiviral strategies, may be a useful new tool in the fight against HIV/AIDS. Copyright (c) 2007 John Wiley & Sons, Ltd