Expression des nétrines dans la rétine de souris adulte

Les nétrines sont une petite famille de protéines de guidage axonal qui peuvent attirer des axones ou en repousser d’autres lors du développement neuronal. Lors du développement de la rétine, les axones des cellules ganglionnaires de la rétine (CGR) sont attirés vers une source de nétrines au niveau du disque optique leur permettant de quitter la rétine et de former le nerf optique. Afin de pouvoir caractériser le rôle des nétrines dans le système visuel adulte, nous avons investigué l’expression des nétrines et leurs récepteurs dans la rétine de souris adulte. Alors qu’aucune expression de la nétrine-1 n’a été détectée dans la rétine adulte, l’expression de la nétrine-3 a été abondamment détectée au niveau des CGR et des cellules amacrines. Nous démontrons aussi que les récepteurs des nétrines sont exprimés dans la rétine adulte. Alors que DCC semble être confiné au niveau des axones des CGR, néogénine est retrouvé dans les dendrites des CGR et des cellules horizontales. Quant aux protéines de la famille des récepteurs homologues à UNC-5, UNC5B a été détecté dans les somas des CGR et UNC5C dans les cellules de Müller. La découverte que nétrine-3 et ses récepteurs sont abondamment exprimés dans plusieurs types cellulaires de la rétine adulte leur suggère un rôle dans le fonctionnement du système visuel mature.

Étude des gènes d'Actinobacillus pleuropneumoniae exprimés en conditions d'infection

Actinobacillus pleuropneumoniae est l’agent étiologique de la pleuropneumonie porcine. La bactérie se transmet par voies aériennes et contacts directs. Plusieurs facteurs de virulence ont été identifiés, nommément les polysaccharides capsulaires, les lipopolysaccharide, les exotoxines ApxI à IV et de nombreux mécanismes d’acquisition du fer. Aucun vaccin efficace contre tous les sérotypes de la bactérie n’a encore été élaboré. Afin de mieux comprendre de quelle façon A. pleuropneumoniae régule la transcription de ses nombreux facteurs de virulence et de découvrir de nouvelles cibles potentielles pour l’élaboration de vaccins efficaces, le profil transcriptomique de la bactérie a été étudié dans des conditions simulant l’infection ainsi qu’à la suite d’une infection naturelle aiguë chez l’animal. Des biopuces de première et de seconde génération (AppChip1 et AppChip2) comportant respectivement 2025 cadres de lecture ouverts (ORF) de la version préliminaire du génome d’A. pleuropneumoniae sérotype 5b souche L20 et 2033 ORF de la version finale annotée du même génome ont été utilisées. Dans un premier temps, des expériences réalisées dans des conditions de concentration restreinte en fer ont permis d’identifier 210 gènes différentiellement exprimés, dont 92 étaient surexprimés. Plusieurs nouveaux mécanismes d’acquisition du fer ont pu être identifiés, incluant un système homologue au système YfeABCD de Yersinia pestis, impliqué dans l’acquisition du fer chélaté, ainsi que des gènes homologues aux composantes du système HmbR de Neisseria meningitidis impliqué dans l’acquisition du fer à partir de l’hémoglobine. Dans des conditions de culture permettant la formation de biofilms, les gènes tadC et tadD d’un opéron tad (« tight adherence locus ») putatif, les gènes pgaBC impliqués dans la synthèse d’un polysaccharide de la matrice du biofilm ainsi que deux gènes présentant de fortes homologies avec un gène codant pour l’adhésine auto-transporteur Hsf retrouvée chez Haemophilus influenzae ont montré une surexpression significative. Plusieurs de ces gènes ont également été retrouvés lors d’expériences réalisées avec des cellules épithéliales d’origine pulmonaire en culture, qui ont permis d’identifier 170 gènes différentiellement exprimés après la croissance planctonique au-dessus des cellules, et 131 autres suite à l’adhésion à ces cellules. Parmis les gènes surexprimés, les gènes tadB et rcpA de l’opéron tad putatif, les gènes pgaBC ainsi que le gène codant pour l’homologue d’Hsf ont été retrouvés. En présence de liquide de lavage broncho-alvéolaire (BALF), 156 gènes ont montré un profil d’expression modifié, et le gène apxIVA, identifié comme étant surexprimé, a pu être détecté pour la première fois dans des conditions de croissance in vitro. Finalement, des expériences visant à déterminer les gènes utilisés directement chez l’animal en phase aiguë de la pleuropneumonie porcine ont permis d’identifier 150 gènes qui étaient différentiellement exprimés. En plus d’identifier des gènes d’un possible opéron codant pour un fimbriae de type IV, 3 des 72 gènes surexprimés sont conservés chez tous les sérotypes d’A. pleuropneumoniae et codent pour des protéines ou lipoprotéines de surface. Nos expériences ont permis d’identifier plusieurs nouveaux facteurs de virulence potentiels chez A. pleuropneumoniae ainsi que plusieurs nouvelles cibles potentielles pour l’élaboration de vaccins efficaces contre tous les sérotypes.

Étude fonctionnelle des protéines G inhibitrices dans la signalisation de la mélatonine au niveau osseux : implication dans l'étiopathogenèse de la scoliose idiopathique

Mémoire numérisé par la Direction des bibliothèques de l'Université de Montréal.

Isolement de protéines liant les phospholipides à partir de tissus et du sérum bovins : évidences pour l'implication dans le transport inverse du cholestérol

Mémoire numérisé par la Direction des bibliothèques de l'Université de Montréal.

Étude fonctionnelle des protéines G inhibitrices dans la signalisation de la mélatonine au niveau osseux : implication dans l'étiopathogenèse de la scoliose idiopathique

Mémoire numérisé par la Direction des bibliothèques de l'Université de Montréal.

Isolement de protéines liant les phospholipides à partir de tissus et du sérum bovins : évidences pour l'implication dans le transport inverse du cholestérol

Mémoire numérisé par la Direction des bibliothèques de l'Université de Montréal.

Développement, validation et nouvelles applications d’un modèle d’analyse des modes normaux basé sur la séquence et la structure de protéines

Les protéines existent sous différents états fonctionnels régulés de façon précise par leur environnement afin de maintenir l‘homéostasie de la cellule et de l‘organisme vivant. La prévalence de ces états protéiques est dictée par leur énergie libre de Gibbs alors que la vitesse de transition entre ces états biologiquement pertinents est déterminée par le paysage d‘énergie libre. Ces paramètres sont particulièrement intéressants dans un contexte thérapeutique et biotechnologique, où leur perturbation par la modulation de la séquence protéique par des mutations affecte leur fonction. Bien que des nouvelles approches expérimentales permettent d‘étudier l‘effet de mutations en haut débit pour une protéine, ces méthodes sont laborieuses et ne couvrent qu‘une fraction de l‘ensemble des structures primaires d‘intérêt. L‘utilisation de modèles bio-informatiques permet de tester et générer in silico différentes hypothèses afin d‘orienter les approches expérimentales. Cependant, ces méthodes basées sur la structure se concentrent principalement sur la prédiction de l‘enthalpie d‘un état, alors que plusieurs évidences expérimentales ont démontré l‘importance de la contribution de l‘entropie. De plus, ces approches ignorent l‘importance de l‘espace conformationnel protéique dicté par le paysage énergétique cruciale à son fonctionnement. Une analyse des modes normaux peut être effectuée afin d‘explorer cet espace par l‘approximation que la protéine est dans une conformation d‘équilibre où chaque acide aminé est représenté par une masse régie par un potentiel harmonique. Les approches actuelles ignorent l‘identité des résidus et ne peuvent prédire l‘effet de mutations sur les propriétés dynamiques. Nous avons développé un nouveau modèle appelé ENCoM qui pallie à cette lacune en intégrant de l‘information physique et spécifique sur les contacts entre les atomes des chaînes latérales. Cet ajout permet une meilleure description de changements conformationnels d‘enzymes, la prédiction de l‘effet d‘une mutation allostérique dans la protéine DHFR et également la prédiction de l‘effet de mutations sur la stabilité protéique par une valeur entropique. Comparativement à des approches spécifiquement développées pour cette application, ENCoM est plus constant et prédit mieux l‘effet de mutations stabilisantes. Notre approche a également été en mesure de capturer la pression évolutive qui confère aux protéines d‘organismes thermophiles une thermorésistance accrue.

Development of metabolic labeling strategies to study changes in protein expression

Résumé : Les progrès techniques de la spectrométrie de masse (MS) ont contribué au récent développement de la protéomique. Cette technique peut actuellement détecter, identifier et quantifier des milliers de protéines. Toutefois, elle n'est pas encore assez puissante pour fournir une analyse complète des modifications du protéome corrélées à des phénomènes biologiques. Notre objectif était le développement d'une nouvelle stratégie pour la détection spécifique et la quantification des variations du protéome, basée sur la mesure de la synthèse des protéines plutôt que sur celle de la quantité de protéines totale. Pour cela, nous volions associer le marquage pulsé des protéines par des isotopes stables avec une méthode d'acquisition MS basée sur le balayage des ions précurseurs (precursor ion scan, ou PIS), afin de détecter spécifiquement les protéines ayant intégré les isotopes et d'estimer leur abondance par rapport aux protéines non marquées. Une telle approche peut identifier les protéines avec les plus hauts taux de synthèse dans une période de temps donnée, y compris les protéines dont l'expression augmente spécifiquement suite à un événement précis. Nous avons tout d'abord testé différents acides aminés marqués en combinaison avec des méthodes PIS spécifiques. Ces essais ont permis la détection spécifique des protéines marquées. Cependant, en raison des limitations instrumentales du spectromètre de masse utilisé pour les méthodes PIS, la sensibilité de cette approche s'est révélée être inférieure à une analyse non ciblée réalisée sur un instrument plus récent (Chapitre 2.1). Toutefois, pour l'analyse différentielle de deux milieux de culture conditionnés par des cellules cancéreuses humaines, nous avons utilisé le marquage métabolique pour distinguer les protéines d'origine cellulaire des protéines non marquées du sérum présentes dans les milieux de culture (Chapitre 2.2). Parallèlement, nous avons développé une nouvelle méthode de quantification nommée IBIS, qui utilise des paires d'isotopes stables d'acides aminés capables de produire des ions spécifiques qui peuvent être utilisés pour la quantification relative. La méthode IBIS a été appliquée à l'analyse de deux lignées cellulaires cancéreuses complètement marquées, mais de manière différenciée, par des paires d'acides aminés (Chapitre 2.3). Ensuite, conformément à l'objectif initial de cette thèse, nous avons utilisé une variante pulsée de l'IBIS pour détecter des modifications du protéome dans des cellules HeLa infectée par le virus humain Herpes Simplex-1 (Chapitre 2.4). Ce virus réprime la synthèse des protéines des cellules hôtes afin d'exploiter leur mécanisme de traduction pour la production massive de virions. Comme prévu, de hauts taux de synthèse ont été mesurés pour les protéines virales détectées, attestant de leur haut niveau d'expression. Nous avons de plus identifié un certain nombre de protéines humaines dont le rapport de synthèse et de dégradation (S/D) a été modifié par l'infection virale, ce qui peut donner des indications sur les stratégies utilisées par les virus pour détourner la machinerie cellulaire. En conclusion, nous avons montré dans ce travail que le marquage métabolique peut être employé de façon non conventionnelle pour étudier des dimensions peu explorées en protéomique. Summary : In recent years major technical advancements greatly supported the development of mass spectrometry (MS)-based proteomics. Currently, this technique can efficiently detect, identify and quantify thousands of proteins. However, it is not yet sufficiently powerful to provide a comprehensive analysis of the proteome changes correlated with biological phenomena. The aim of our project was the development of ~a new strategy for the specific detection and quantification of proteomé variations based on measurements of protein synthesis rather than total protein amounts. The rationale for this approach was that changes in protein synthesis more closely reflect dynamic cellular responses than changes in total protein concentrations. Our starting idea was to couple "pulsed" stable-isotope labeling of proteins with a specific MS acquisition method based on precursor ion scan (PIS), to specifically detect proteins that incorporated the label and to simultaneously estimate their abundance, relative to the unlabeled protein isoform. Such approach could highlight proteins with the highest synthesis rate in a given time frame, including proteins specifically up-regulated by a given biological stimulus. As a first step, we tested different isotope-labeled amino acids in combination with dedicated PIS methods and showed that this leads to specific detection of labeled proteins. Sensitivity, however, turned out to be lower than an untargeted analysis run on a more recent instrument, due to MS hardware limitations (Chapter 2.1). We next used metabolic labeling to distinguish the proteins of cellular origin from a high background of unlabeled (serum) proteins, for the differential analysis of two serum-containing culture media conditioned by labeled human cancer cells (Chapter 2.2). As a parallel project we developed a new quantification method (named ISIS), which uses pairs of stable-isotope labeled amino acids able to produce specific reporter ions, which can be used for relative quantification. The ISIS method was applied to the analysis of two fully, yet differentially labeled cancer cell lines, as described in Chapter 2.3. Next, in line with the original purpose of this thesis, we used a "pulsed" variant of ISIS to detect proteome changes in HeLa cells after the infection with human Herpes Simplex Virus-1 (Chapter 2.4). This virus is known to repress the synthesis of host cell proteins to exploit the translation machinery for the massive production of virions. As expected, high synthesis rates were measured for the detected viral proteins, confirming their up-regulation. Moreover, we identified a number of human proteins whose synthesis/degradation ratio (S/D) was affected by the viral infection and which could provide clues on the strategies used by the virus to hijack the cellular machinery. Overall, in this work, we showed that metabolic labeling can be employed in alternative ways to investigate poorly explored dimensions in proteomics.

Development of a bifunctional CD1d-anti-HER2 scFv fusion molecule to redirect the iNKT cell-mediated immune response to the tumor site

Abstract : Invariant natural killer T lymphocytes (iNKT) are a unique subpopulation of T lymphocytes recognizing glycolipid antigens in the context of the MHC class I-like molecule CD1d. Upon activation with the high affinity ligand α-galactosylceramide (αGalCer), iNKT cells rapidly produce large amounts of the pro-inflammatory cytokine interferon gamma (IFN-γ) and potently activate cells of the innate and adaptive immune response, such as dendritic cells (DCs), NK and T cells. In this context, iNKT cells have been shown to efficiently mediate antitumor activity, and recent research has focused on the manipulation of these cells for antitumor therapies. However, a major drawback of αGalCer as a free drug is that a single injection of this ligand leads to a short-lived iNKT cell activation followed by a long-term anergy, limiting its therapeutic use. In contrast, we demonstrate here that when αGalCer is loaded on a recombinant soluble CD1d molecule (αGalCer/sCD1d), repeated injections lead to a sustained iNKT and NK cell activation associated with IFN-γ secretion as well as with DC maturation. Most importantly, when the αGalCer/sCD1d is fused to an anti-HER2 scFv antibody fragment, potent inhibition of experimental lung metastasis and established subcutaneous tumors is obtained when systemic treatment is started two to seven days after the injection of HER2-expressing B16 melanoma cells, whereas at this time free αGalCer has no effect. The antitumor activity of the sCD1d-anti-HER2 fusion protein is associated with HER2-specific tumor localization and accumulation of iNKT, NK and T cells at the tumor site. Importantly, active T cell immunization combined with the sCD1d-anti-HER2 treatment leads to the accumulation of antigen-specific CD8 T cells exclusively in HER2-expressing tumors, resulting in potent tumor inhibition. In conclusion, sustained activation and tumor targeting of iNKT cells by recombinant αGalCer/sCD1d molecules thus may promote a combined innate and adaptive immune response at the tumor site that may prove to be effective in cancer immunotherapy. RESUME : Les lymphocytes «invariant Natural Killer T » (iNKT) forment une sous-population particulière de lymphocytes T reconnaissant des antigènes glycolipidiques présentés sur la molécule non-polymorphique CD1d, analogue aux protéines du complexe majeur d'histocompatibilité de classe I. Après activation avec le ligand de haute affinité α-galactosylceramide (αGalCer), les cellules iNKT produisent des grandes quantités de la cytokine pro-inflammatoire interferon gamma (IFN-γ) et activent les cellules du système immunitaire inné et acquis, telles que les cellules dendritiques (DC), NK et T. En conséquence, on a montré que les cellules iNKT exercent des activités anti-tumorales et la recherche s'est intéressée à la manipulation de ces cellules pour développer des thérapies anti-tumorales. Néanmoins, le désavantage majeur de l'αGalCer, injecté seul, est qu'une seule dose de ce ligand aboutit à une activation des cellules iNKT de courte durée suivie par un état anergique prolongé, limitant l'utilisation thérapeutique de ce glycolipide. En revanche, l'étude présentée ici démontre que, si l'αGalCer est chargé sur des molécules récombinantes soluble CD1d (αGalCer/sCDld), des injections répétées aboutissent à une activation prolongée des cellules iNKT et NK associée avec la sécrétion d'IFN-γ et la maturation des cellules DC. Plus important, si on fusionne la molécule αGalCer/sCD1d avec un fragment single-chain (scFv) de l'anticorps anti-HER2, on observe une importante inhibition de métastases expérimentales aux poumons et de tumeurs sous-cutanées même lorsque le traitement systémique est commencé 2 à 7 jours après la greffe des cellules de mélanome B16 transfectées avec l'antigène HER2. Dans les mêmes conditions le traitement avec l'αGalCer seul est inefficace. L'activité anti-tumorale de la protéine sCDld-anti-HER2 est associée à son accumulation spécifique dans des tumeurs exprimant le HER2 ainsi qu'avec une accumulation des cellules iNKT, NK et T à la tumeur. De plus, une immunisation active combinée avec le traitement sCD1d-anti-HER2 aboutit à une accumulation des lymphocytes T CD8 spécifiques de l'antigène d'immunisation, ceci exclusivement dans des tumeurs qui expriment l'antigène HER2. Cette combinaison résulte dans une activité anti-tumeur accrue. En conclusion, l'activation prolongée des cellules iNKT redirigées à la tumeur par des molécules recombinantes αGalCer/sCDld conduit à l'activation de la réponse innée et adaptative au site tumoral, offrant une nouvelle stratégie prometteuse d'immunothérapie contre le cancer. RESUME POUR UN LARGE PUBLIC : Le cancer est une cause majeure de décès dans le monde. Sur un total de 58 millions de décès enregistrés au niveau mondial en 2005, 7,6 millions (soit 13%) étaient dus au cancer. Les principaux traitements de nombreux cancers sont la chirurgie, en association avec la radiothérapie et la chimiothérapie. Néanmoins, ces traitements nuisent aussi aux cellules normales de notre corps et parfois, ils ne suffisent pas pour éliminer définitivement une tumeur. L'immunothérapie est l'une des nouvelles approches pour la lutte contre le cancer et elle vise à exploiter la spécificité du système immunitaire qui peut distinguer des cellules normales et tumorales. Une cellule exprimant un marqueur tumoral (antigène) peut être reconnue par le système immunitaire humoral (anticorps) et/ou cellulaire, induisant une réponse spécifique contre la tumeur. L'immunothérapie peut s'appuyer alors sur la perfusion d'anticorps monoclonaux dirigés contre des antigènes tumoraux, par exemple les anticorps dirigés contre les protéines oncogéniques Her-2/neu dans le cancer du sein. Ces anticorps ont le grand avantage de spécifiquement se localiser à la tumeur et d'induire la lyse ou d'inhiber la prolifération des cellules tumorales exprimant l'antigène. Aujourd'hui, six anticorps monoclonaux non-conjugés sont approuvés en clinique. Cependant l'efficacité de ces anticorps contre des tumeurs solides reste limitée et les traitements sont souvent combinés avec de la chimiothérapie. L'immunothérapie spécifique peut également être cellulaire et exploiter par immunisation active le développement de lymphocytes T cytotoxiques (CTL) capables de détruire spécifiquement les cellules malignes. De telles «vaccinations »sont actuellement testées en clinique, mais jusqu'à présent elles n'ont pas abouti aux résultats satisfaisants. Pour obtenir une réponse lymphocytaire T cytotoxique antitumorale, la cellule T doit reconnaître un antigène associé à la tumeur, présenté sous forme de peptide dans un complexe majeur d'histocompatibilité de classe I (CHM I). Cependant les cellules tumorales sont peu efficace dans la présentation d'antigène, car souvent elles se caractérisent par une diminution ou une absence d'expression des molécules d'histocompatibilité de classe I, et expriment peu ou pas de molécules d'adhésion et de cytokines costimulatrices. C'est en partie pourquoi, malgré l'induction de fortes réponses CTL spécifiquement dirigés contre des antigènes tumoraux, les régressions tumorales obtenus grâce à ces vaccinations sont relativement rares. Les lymphocytes «invariant Natural Killer T » (iNKT) forment une sous-population particulière de lymphocytes T reconnaissant des antigènes glycolipidiques présentés sur la molécule non-polymorphique CD1d, analogue aux protéines CMH I. Après activation avec le ligand de haute affinité α-galactosylceramide (αGalCer), les cellules iNKT produisent des grandes quantités de la cytokine pro-inflammatoire interferon gamma (IFN-γ) et activent les cellules du système immunitaire inné et acquis, telles que les cellules dendritiques (DC), NK et T. En conséquence, on a montré que les cellules iNKT exercent des activités anti-tumorales et la recherche s'est intéressée à la manipulation de ces cellules pour développer des thérapies anti-tumorales. Néanmoins, le désavantage majeur de l'αGalCer, injecté seul, est qu'une seule dose de ce ligand aboutit à une activation des cellules iNKT de courte durée suivie par un état anergique prolongé, limitant l'utilisation thérapeutique de ce glycolipide. Notre groupe de recherche a donc eu l'idée de développer une nouvelle approche thérapeutique où la réponse immunitaire des cellules iNKT serait prolongée et redirigée vers la tumeur par des anticorps monoclonaux. Concrètement, nous avons produit des molécules récombinantes soluble CD1d (sCD1d) qui, si elles sont chargés avec l'αGalCer (αGalCer/sCDld), aboutissent à une activation prolongée des cellules iNKT et NK associée avec la sécrétion d'IFN-γ et la maturation des cellules DC. Plus important, si la molécule αGalCer/sCD1d est fusionnée avec un fragment single-chain (scFv) de l'anticorps anti-HER2, la réponse immunitaire est redirigée à la tumeur pour autant que les cellules cancéreuses expriment l'antigène HER2. Les molécules αGalCer/sCDld ainsi présentées activent les lymphocytes iNKT. Avec cette stratégie, on observe une importante inhibition de métastases expérimentales aux poumons et de tumeurs sous-cutanées, même lorsque le traitement systémique est commencé 2 à 7 jours après la greffe des cellules de mélanome B16 transfectées avec l'antigène HER2. Dans les mêmes conditions le traitement avec l'αGalCer seul est inefficace. L'activité anti-tumorale de la protéine sCDld-anti-HER2 est associée à son accumulation spécifique dans des tumeurs exprimant le HER2 ainsi qu'avec une accumulation des cellules iNKT, NK et T à la tumeur. En conclusion, l'activation prolongée des cellules iNKT redirigées à la tumeur par des molécules récombinantes αGalCer/sCD1d conduit à l'activation de la réponse innée et adaptative au site tumoral, offrant une nouvelle stratégie prometteuse d'immunothérapie contre le cancer.

Étude des mécanismes moléculaires menant à la migration cellulaire associée à Rac1 et ARF6.

Le facteur de l’ADP-ribosylation 6 (ARF6) et Rac1 sont des petites protéines liant le GTP qui régulent plusieurs voies de signalisation comprenant le trafic de vésicules, la modification des lipides membranaires et la réorganisation du cytosquelette d’actine. Cependant, les mécanismes moléculaires par lesquels ARF6 et Rac1 agissent de concert afin de contrôler ces différents processus cellulaires restent méconnus. Dans cette étude, nous montrons que, dans les cellules HEK293, ARF6 et Rac1 sont retrouvées en complexe suite à la stimulation du récepteur à l’angiotensine. Des expériences réalisées in vitro nous indiquent que ces deux GTPases interagissent ensemble directement, et que ARF6 s’associe préférentiellement avec la forme inactive de Rac1. L’inhibition de l’expression de ARF6 par interférence à l’ARN entraîne une activation marquée en cellule de Rac1 via le facteur PIX, indépendamment de la stimulation d’un récepteur, ce qui provoque la migration non contrôlée des cellules. Les arrestines, protéines de régulation de la désensibilisation des récepteurs couplés aux protéines G, servent de protéines d’échafaudage pour Rac1 et ARF6, en interagissant directement avec les GTPases et en augmentant leur association stimulée par l’angiotensine. De plus, les arrestines permettent l’activation, en s’en dissociant, de la MAP Kinase p38 qui régule l’activité de ARF6 et son interaction précoce avec les arrestines. Mis ensemble, ces résultats montrent que les arrestines contrôlent l’activité de ARF6, en influençant p38. ARF6 joue un rôle inhibiteur sur l’activation basale de Rac1 pour permettre ensuite son recrutement et son activation dépendante de l’angiotensine. Cette étude nous a permis de préciser le mode de régulation mis en jeu dans l’initiation de la migration cellulaire, suite à l’activation d’un récepteur couplé aux protéines G. Par le fait même, nous avons identifié certains des acteurs impliqués dans ce processus, offrant ainsi de nouvelles cibles pour le traitement des déséquilibres pathophysiologiques de la migration cellulaire.

Optimisation de la domiciliation des cellules CD34+ de sang de cordon ombilical: élucider les mécanismes en cause dépendant du CXCR4.

Le sang provenant d’un cordon ombilical (SCO) représente une bonne source de cellules souches hématopoïétiques (CSH) pour des transplantations. Cependant, le nombre de cellules souches contenues dans ce sang est souvent insuffisant pour greffer un adulte. Le mécanisme intervenant dans la domiciliation de ces cellules au sein de la moelle osseuse (MO) est encore mal compris. On sait que l’interaction entre la chimiokine SDF-1 et le récepteur CXCR4, présent sur les cellules CD34+ de SCO, mène à la migration de ces cellules en direction de la MO. Nous pensons que l’augmentation de la proportion de cellules qui réussit à se greffer pourra pallier au problème du nombre. Les produits de dégradation, C3a et le C3desarg,, issus du système du complément, sont connus pour favoriser la réponse de cellules exprimant CXCR4 vers SDF-1. Nous avons analysé l’effet du C3adesarg, molécule non anaphylatoxique, sur la migration cellulaire vers SDF-1, de même que sur la prise de greffe des cellules CD34+ issues de SCO suite à une transplantation sur des souris NOD/SCIDyC-. Nos expériences ont démontré que le C3a ainsi que le C3adesarg augmentaient tous les deux la réponse des cellules CD34+ vers SDF-1. Toutefois, nous n’avons pas pu démontrer que ces molécules liaient directement le récepteur CXCR4. Par contre, le composé C3adesarg favorise la prise de greffe des cellules CD34+ de SCO. Il serait donc un bon candidat pour poursuivre une optimisation de ses propriétés. Nous avons également constaté que suite à une transplantation chez la souris, les cellules CD34+ de SCO subissent une hausse d’expression transitoire de leur CXCR4 environ quatre jours après la greffe. Cette hausse d’expression coïncide avec la multiplication des cellules CD34+ dans la MO. Nous avons également confirmé qu’une cellule CD34+ avec une forte expression de CXCR4 était dans un état prolifératif. Nos données suggèrent que l’interaction directe avec les cellules stromales soit responsable de cette hausse d’expression de CXCR4.

Modulation allostérique de la fonction des récepteurs FP et PAF

Les récepteurs couplés aux protéines-G (RCPGs) constituent la première étape d’une série de cascades signalétiques menant à la régulation d’une multitude de processus physiologiques. Dans le modèle classique connu, la liaison du ligand induit un changement de conformation du récepteur qui mène à sa forme active. Une fois activés, les RCPGs vont réguler l’activité d’une protéine membranaire cible qui peut être tant une enzyme qu’un canal ionique. L’interaction entre le récepteur et la cible nécessite l’intermédiaire d’une protéine hétérotrimérique appelée « protéine G », qui est activée pour favoriser l’échange du GDP (guanosine diphosphate) pour un GTP (guanosine triphosphate) et assurer la transduction du signal du récepteur à l’effecteur. Les mécanismes moléculaires menant à l’activation des effecteurs spécifiques via l’activation des RCPGs par les protéines G hétérotrimériques sont encore plutôt méconnus. Dans notre étude nous nous sommes intéressés aux récepteurs FP et PAF, à leurs ligands naturels, la PGF2α et le Carbamyl-PAF respectivement, et à des ligands à action antagoniste sur ces récepteurs. Des ligands considérés comme agonistes, sont des molécules qui interagissent avec le récepteur et induisent les mêmes effets que le ligand naturel. Les antagonistes, par contre, sont des molécules qui interagissent avec le récepteur et bloquent l’action du ligand naturel en prévenant le changement conformationnel du complexe, et ils peuvent avoir une action compétitive ou non-compétitive. Nous avons étudié aussi des ligands orthostériques et allostériques du récepteur FP des prostaglandines et du récepteur PAF. Un ligand orthostérique peut se comporter comme agoniste ou antagoniste en se fixant au site de liaison du ligand (agoniste) naturel. Un ligand allostérique est un agoniste ou antagoniste se fixant à un site autre que celui du ligand naturel entraînant un changement de conformation ayant pour conséquence soit une augmentation (effecteur positif), soit une diminution (effecteur négatif) de l'activité du ligand naturel.

Effet de chaperones pharmacologiques sur les formes mutantes du récepteur mélanocortine de type 4 responsables de l'obésité morbide précoce

Le récepteur mélanocortine de type 4 (MC4R) est un récepteur couplé aux protéines G impliqué dans la régulation de la prise alimentaire et de l’homéostasie énergétique. Quatre-vingt pour cent des mutants du MC4R reliés à l’obésité morbide précoce (OMP) sont retenus à l’intérieur de la cellule. Le système de contrôle de qualité (SCQ) est probablement responsable de cette rétention, par la reconnaissance d’une conformation inadéquate des mutants. Le rétablissement de l’expression à la surface cellulaire et de la fonctionnalité de ces mutants est donc d’intérêt thérapeutique. Dans cette optique, des composés lipophiles spécifiques pour le MC4R ont été sélectionnés sur la base de leur sélectivité. Nous avons démontré qu’ils agissent à titre de chaperone pharmacologique (CP) en rétablissant l’expression à la surface cellulaire et la fonctionnalité des récepteurs mutants S58C et R165W, et qu’ils favorisent leur N-glycosylation complexe (maturation). Le suivi par BRET du site d’action des CP du MC4R suggère une action en aval de l’interaction calnexine-MC4R. De manière générale, une CP peut avoir un effet différent selon le mutant traité en induisant des conformations distinctes du récepteur plus ou moins aptes à se dissocier du SCQ et à activer la voie de signalisation, et un mutant peut répondre différemment selon la CP utilisée par des différences d’affinité pour le ligand, la CP et les effecteurs. Une meilleure compréhension du mode d’action des CP pourrait aider au développement de nouvelles approches thérapeutiques non seulement pour l’OMP, mais aussi pour d’autres maladies conformationnelles causées par le mauvais repliement de protéines.

Rôle des GTPases ARF dans la migration des cellules endothéliales et la sécrétion du NO

ARF6 et ARF1 sont des petites GTPases de la famille des ARF(s) qui régulent plusieurs voies de signalisation comprenant, la formation et le mouvement des vésicules, la transformation des lipides membranaires et la réorganisation du cytosquelette d’actine. À ce jour, le rôle de la protéine ARF6 et de la protéine ARF1 dans la signalisation des récepteurs couplés aux protéines G (RCPG) et des récepteurs à activité tyrosine kinase (RTK) dans les cellules endothéliales est encore très peu étudié. Le but de cette étude a été de caractériser le rôle de la protéine ARF6 dans la migration des cellules endothéliales induite par l’endothéline-1, ainsi que le rôle de la protéine ARF1 dans la sécrétion du monoxyde d’azote (NO) stimulées par le VEGF. Dans cette étude, nous montrons qu’ARF6 est essentielle à la migration des cellules endothéliales induite par l’endotheline-1. L’inhibition de l’expression d’ARF6 par interférence à l’ARN entraîne une activation marquée de la kinase FAK et son association constitutive avec Src. Par ailleurs, cette inhibition affecte l’association entre GIT1 et la kinase FAK. Ceci se traduit par une inhibition du désassemblage des contacts focaux et une augmentation de l’adhésion cellulaire menant à une diminution de la motilité. De plus, nos résultats montrent que la protéine ARF1 est essentielle à l’activation d’eNOS et à la sécrétion du NO suite à l’activation du VEGFR2 dans les cellules endothéliales BAEC. En effet, l’inhibition de l’expression d’ARF1 par interférence à l’ARN entraîne une inhibition du recrutement de la kinase Akt à la membrane plasmique et une inhibition de son activation induite par le VEGF. L’inhibition de l’activation de la kinase Akt par le VEGF conduit à une inhibition de l’activation de eNOS et de la sécrétion du NO. Dans l’ensemble, nos résultats montrent que les protéines ARF6 et ARF1 sont essentielles à la signalisation de l’ETB et du VEGFR2 pour les processus menant à la migration cellulaire et à la sécrétion du NO respectivement, deux évènements essentiels à l’angiogenèse.

Rôle du dimère Gbetagamma dans l’organisation des systèmes de signalisation cellulaire

Selon le modèle classique, le signal reçu par les récepteurs couplés aux protéines G (RCPG) se propage suite à des interactions transitoires et aléatoires entre les RCPGs, les protéines G et leurs effecteurs. Par les techniques de transfert d’énergie de résonance de bioluminescence (BRET), de complémentation bimoléculaire de protéines fluorescentes (BiFC) et de co-immunoprécipitation, nous avons observé que les récepteurs, les protéines G et les effecteurs forment un complexe stable, avant et après l’activation des récepteurs. L’interaction entre l’effecteur Kir3 et le dimère Gbetagamma se produit initialement au réticulum endoplasmique et est sensible à un agoniste liposoluble des récepteurs beta2-adrénergiques. Bien que peu de spécificité pour les nombreux isoformes des sous-unités Gbetagamma ait été observée pour l’activation du canal Kir3, les interactions précoces au RE sont plus sensibles aux différentes combinaisons de Gbetagamma présentes. En plus de son rôle dans la régulation des effecteurs, le dimère Gbetagamma peut interagir avec de nombreuses protéines possédant des localisations cellulaires autres que la membrane plasmique. Nous avons identifié une nouvelle classe de protéines interagissant avec la sous-unité Gbeta, autant en système de surexpression que dans des extraits de cerveaux de rats, soit les protéines FosB et cFos, qui forment le complexe de transcription AP-1, suite à leur dimérisation avec les protéines de la famille des Jun. La coexpression du dimère Gbetagamma réduit l’activité transcriptionnelle du complexe AP-1 induit par le phorbol 12-,myristate 13-acetate (PMA), sans toutefois interférer avec la formation du complexe Fos/Jun ou son interaction avec l’ADN. Toutefois, le dimère Gbetagamma colocalise au noyau avec le complexe AP-1 et recrute les protéines histones déacétylases (HDAC) afin d’inhiber l’activité transcriptionnelle du complexe AP-1.