Caractérisation fonctionnelle chez le poisson zèbre de l'isoforme protéique WNK1/HSN2 mutée dans la neuropathie héréditaire sensitive et autonome de type 2

La neuropathie humaine sensitive et autonome de type 2 (NHSA 2) est une pathologie héréditaire rare caractérisée par une apparition précoce des symptômes et une absence d’affectation motrice. Cette pathologie entraîne la perte de perception de la douleur, de la chaleur et du froid ainsi que de la pression (toucher) dans les membres supérieurs et inférieurs et est due à des mutations autosomales récessives confinées à l’exon HSN2 de la protéine kinase à sérine/thréonine WNK1 (with-no-lysine protein kinase 1). Cet exon spécifique permettrait de conférer une spécificité au système nerveux à l’isoforme protéique WNK1/HSN2. La kinase WNK1 est étudiée en détails, en particulier au niveau du rein, mais son rôle au sein du système nerveux demeure inconnu. Considérant le début précoce de la neuropathie et le manque d’innervation sensorielle révélé par des biopsies chez les patients NHSA2, notre hypothèse de recherche est que les mutations tronquantes menant à la NHSA de type 2 causent une perte de fonction de l’isoforme WNK1/HSN2 spécifique au système nerveux entraînant un défaut dans le développement du système nerveux sensoriel périphérique. Chez l’embryon du poisson zèbre, WNK1/HSN2 est exprimé au niveau des neuromastes de la ligne latérale postérieure, un système mécanosensoriel périphérique. Nous avons obtenu des embryons knockdown pour WNK1/HSN2 par usage d’oligonucléotides morpholino antisens (AMO). Nos trois approches AMO ont révélé des embryons présentant des défauts d’établissement au niveau de la ligne latérale postérieure. Afin de déterminer la voie pathogène impliquant l’isoforme WNK1/HSN2, nous nous sommes intéressés à l’interaction rapportée entre la kinase WNK1 et le co-transporteur neuronal KCC2. Ce dernier est une cible de phosphorylation de WNK1 et son rôle dans la promotion de la neurogenèse est bien connu. Nous avons détecté l’expression de KCC2 au niveau de neuromastes de la ligne latérale postérieure et observé une expression accrue de KCC2 chez les embryons knockdown pour WNK1/HSN2 à l’aide de RT-PCR semi-quantitative. De plus, une sur-expression d’ARN humain de KCC2 chez des embryons a produit des défauts dans la ligne latérale postérieure, phénocopiant le knockdown de WNK1/HSN2. Ces résultats furent validés par un double knockdown, produisant des embryons n’exprimant ni KCC2, ni WNK1/HSN2, dont le phénotype fut atténué. Ces résultats nous mènent à suggérer une voie de signalisation où WNK1/HSN2 est en amont de KCC2, régulant son activation, et possiblement son expression. Nous proposons donc que la perte de fonction de l’isoforme spécifique cause un débalancement dans les niveaux de KCC2 activée, menant à une prolifération et une différenciation réduites des progéniteurs neuronaux du système nerveux périphérique. Les défauts associés à la NHSA de type 2 seraient donc de nature développementale et non neurodégénérative.

Génération de lignées de poissons zébrés exprimant le gène muté TARDBP

La sclérose latérale amyotrophique (SLA) est une maladie neurodégénérative due à une dégénérescence des motoneurones. Plus de 40 mutations du gène TARDBP ont été identifiées chez des patients SLA. Les défauts biochimiques de ces mutations étant encore inconnus, les modèles animaux sont présentement la seule mesure possible d’un phénotype. Pour étudier les conséquences physiopathologiques d’une de ces mutations, nous avons développé deux lignées transgéniques de poisson zébré, exprimant le gène humain TARDBP soit de type sauvage, soit avec la mutation G348C liée à la SLA, sous le contrôle d’un promoteur de choc thermique. Ces lignées ont été étudiées sur trois générations, après avoir établi un protocole de choc thermique induisant une expression ubiquitaire du transgène. Les embryons transgéniques de la génération F2 de la lignée exprimant la mutation développent un phénotype moteur suite à un choc thermique de 38.5°C pendant 30 minutes lorsque les embryons sont à 18 heures post-fertilisation. 60% des embryons ont une réponse anormale au toucher. De plus, une réduction de 28% de la longueur de pré-branchement des axones des motoneurones est observée. Ces résultats indiquent que notre lignée exprimant la protéine mutante TDP-43 est un modèle génétique de la SLA prometteur, qui ouvre des perspectives pour la compréhension de la physiopathologie de la maladie et la découverte de molécules thérapeutiques.

Découverte d'un gène causant une ataxie spastique héréditaire dominante dans la population de Terre-Neuve

Les ataxies spastiques héréditaires forment une famille hétérogène de désordres qui ont des points communs avec les ataxies héréditaires et les paraplégies spastiques héréditaires. Un de ces éléments est une ataxie, soit une difficulté de coordination des membres souvent due à un dommage au cervelet. L’autre est une spasticité des membres inférieurs, souvent due à des dommages à la voie cortico-spinale. Une seule ataxie spastique à hérédité autosomique dominante a été rapportée dans la littérature, et il s’agit de SPAX1. À l’aide de trois familles de Terre-Neuve présentant ce phénotype, le locus a été identifié en 2002. Dans ce mémoire, c’est de la découverte du gène causal dont il est question. La mutation a été trouvée dans le gène VAMP1, qui encode la protéine synaptobrévine 1, une protéine synaptique impliquée dans l’exocytose des neurotransmetteurs. Il est aussi question de la caractérisation fonctionnelle de la mutation sur l’ARN et des conséquences possibles sur la protéine, concordant avec les symptômes de la maladie.

Caractérisation clinique et moléculaire de nouvelles translocations chromosomiques ciblant le gène RUNX1 dans les leucémies aiguës de l’adulte

La leucémie aiguë myéloïde est une hémopathie maligne génétiquement hétérogène caractérisée par de fréquents réarrangements impliquant la bande chromosomique 21q22 et le gène RUNX1. Dans ce groupe d’anomalies, les translocations t(8;21)(q22;q22) et t(3;21)(q26;q22), associées respectivement à un pronostic favorable et défavorable, sont les mieux étudiées. Or, plus de la moitié des réarrangements ciblant RUNX1 ne sont toujours pas caractérisés au niveau clinique et moléculaire. Les principaux objectifs de cette thèse sont de caractériser quatre nouvelles translocations ciblant RUNX1 et d’étudier la dérégulation transcriptionnelle associée à ces anomalies au niveau de cibles plus spécifiques ayant un rôle dans l’auto-renouvellement ou dans la différenciation hématopoïétique. À l’aide des techniques de cytogénétique et de biologie moléculaire, deux nouveaux partenaires de RUNX1, soit CLCA2 et SV2B, ont été identifiés au sein des t(1;21)(p22.3;q22) et t(15;21)(q26.1;q22) et la récurrence des partenaires USP42 et TRPS1 a été démontrée suite à l’étude des t(7;21)(p22.1;q22) et t(8;21)(q23.3;q22). Ce travail a permis de confirmer l’existence de divers modes de dérégulation de RUNX1 dans les leucémies aiguës. L’expression présumée de protéines chimériques et/ou d’isoformes tronquées de RUNX1, un dosage aberrant des transcrits de RUNX1 et la surexpression des gènes partenaires sont des conséquences révélées par l’étude de ces fusions. Le séquençage et l’analyse des jonctions génomiques des fusions récurrentes RUNX1-USP42/USP42-RUNX1 et RUNX1-TRPS1/TRPS1-RUNX1 ont démontré la présence de signatures moléculaires caractéristiques du mode de recombinaison non-homologue de type NHEJ. En raison de la structure et de la composition différente des jonctions, l’implication de composantes distinctes du mécanisme NHEJ a été proposée. Enfin, des analyses par PCR quantitative en temps réel nous ont permis de démontrer l’existence de cibles de dérégulation partagées par les fusions récurrentes et plus rares de RUNX1. Nous avons démontré que CEBPA est moins exprimé dans la majorité des spécimens étudiés présentant une fusion de RUNX1 par rapport aux spécimens avec un caryotype normal alors que JUP, une composante effectrice de la voie Wnt, est plutôt surexprimé. Malgré l’activation transcriptionnelle de JUP dans l’ensemble de ces spécimens, certaines cibles de la voie Wnt telles que CCND1 et MYC sont différemment exprimées dans ces cellules, appuyant l’hétérogénéité décrite dans ce groupe de leucémies. Malgré l’implication de partenaires variés, nos données d’expression démontrent que les chimères et les protéines tronquées de RUNX1 partagent des cibles communes d’activation et de répression transcriptionnelle et établissent, pour la première fois, des évidences moléculaires suggérant l’existence de similitudes entre la fusion récurrente RUNX1-RUNX1T1 et quatre fusions plus rares de RUNX1. Puisque des rechutes surviennent fréquemment dans ce groupe génétique, l’inhibition de JUP pourrait être une option thérapeutique intéressante et ceci est appuyé par les bénéfices observés lors de l’inhibition de la voie Wnt dans d’autres groupes génétiques de leucémies aiguës.

Autogreffe de cellules stromales de moelle osseuse de chien transduites pour le gène de l'érythropoïetine canine

Mémoire numérisé par la Division de la gestion de documents et des archives de l'Université de Montréal

Étude des isoformes PPAR-y1 et PPAR-y2 dans la régulation transcriptionnelle du gène pitx1 : implication dans l'étiopathogenèse de l'arthrose

Mémoire numérisé par la Division de la gestion de documents et des archives de l'Université de Montréal.

Du gène égoïste à la physiologie du phénotype étendu : vers une redéfinition des frontières de l'individualité biologique

Mémoire numérisé par la Division de la gestion de documents et des archives de l'Université de Montréal

HCaRG "Hypertension-related Calcium Regulated Gene", un gène candidat de la réparation rénale : caractérisation de son interaction avec le cytosquelette et son expression génique

Mémoire numérisé par la Division de la gestion de documents et des archives de l'Université de Montréal.

Étude d'association entre l'asthme et le gène plasminogen activator, urokinase dans la population du Saguenay-Lac-Saint-Jean

Mémoire numérisé par la Division de la gestion de documents et des archives de l'Université de Montréal.

Le co-activateur T1F1b[beta] dans la transcription du gène de la pro-opiomélanocortine

Mémoire numérisé par la Division de la gestion de documents et des archives de l'Université de Montréal.

Étude de la régulation transcriptionnelle du gène Indian Hedgehog et de son rôle dans l'ostéoarthrose

L’Ostéoarthrose (OA) est une maladie articulaire entrainant une dégénérescence du cartilage et une ossification de l’os sous-chondral. Elle touche un Canadien sur 10 et pourtant l’origine de cette pathologie est encore inconnue. Dans le cadre de ce projet, la contribution de deux facteurs de transcription, NFAT1 et PITX1, dans la régulation transcriptionnelle du promoteur d’IHH a été examiné compte tenu de l’implication potentielle de la voie hedgehog (Hh) et de ces facteurs dans la pathogenèse de l’OA. La voie de signalisation Hh régule la croissance et la différenciation des chondrocytes. Indian hedgehog (IHH), l’un des trois membres de la famille Hh, contrôle leur prolifération et leur différenciation.

Études génétiques moléculaires du gène de la polarité planaire SCRIBBLE1 chez les anomalies du tube neural

Les anomalies du tube neural (ATN), incluant l'anencéphalie et le spina-bifida, représentent un groupe de malformations congénitales très fréquentes chez l'homme. Ces anomalies sont causées par un défaut partiel ou complet de la fermeture du tube neurale au cours de l'embryogenèse. Les ATN ont une étiologie complexe et multifactorielle impliquant des facteurs environnementaux et génétiques. La voie de signalisation non-canonique du Frizzled (Fz)/Dishevelled (Dvl) contrôle la polarité cellulaire planaire (PCP) et le processus morphogénétique appelé l’extension convergente qui est essentiel pour la gastrulation et la fermeture du tube neural. Très important, des mutations des gènes de cette voie étaient fortement associées aux ATN chez la souris et l’humain. Scribble est un gène de la voie PCP qui cause une sévère ATN chez la souris Circletail. Notre étude vise à analyser le rôle de SCRIBBLE1 dans les ATN humains par des analyses de séquence de son cadre de lecture et ses jonctions exon-introns. Notre étude comporte 396 patients recrutés au Centre Spina Bifida de l’hôpital Gaslini en Gènes, Italie et 83 patients recrutés au Centre Spina Bifida de l’hôpital Sainte Justine. Les patients sont affectés par plusieurs formes d’ATN. Nous avons identifié neuf mutations rares et non synonymes chez 10 patients, p.Asp93Ala (c. 435G>A), p.Gly145Arg (c. 278A>C), p.Gly263Ser (c. 786C>A), p.Gly469Ser (c. 1405G>A), p.Pro649His (c. 1946C>A), p.Gln808His (c. 2424G>T), p.Val1066Met (c. 3196G>A), p.Arg1150Gln (c. 3480G>A) et p.Thr1422Met (c. 4266C>T). Cinque mutations, p.Gly263Ser, p.Pro649His, p.Gln808His, p.Arg1150Gln, p.Thr1422Met, étaient absentes dans les contrôles analysés et prédites d’être pathogéniques in silico. Cette étude montre que des mutations rares dans SCRIB1 pourraient augmenter le risque des ATN dans une fraction des patients. L’identification des gènes prédisposant aux ATN nous aidera à mieux comprendre les mécanismes pathogéniques impliqués dans ces maladies.

Régulation transcriptionnelle du gène de la protéine de liaison de la chlorophylle-a et de la péridinine chez le dinoflagellé Lingulodinium polyedrum

Les dinoflagellés jouent un rôle très important dans l’écologie des océans en y réalisant une grande partie de la production primaire, en formant une association symbiotique avec les coraux et en ayant la capacité de produire des fleurs d’algues potentiellement toxiques pour les communautés côtières humaines et animales. Malgré tout, la biologie moléculaire des dinoflagellés n’a que très peu été étudiée dans les dernières années, les connaissances de processus de base comme la régulation de la transcription y étant fortement limitées. Une tentative pour élucider ce mécanisme a été réalisée chez les dinoflagellés photosynthétiques Lingulodinium polyedrum et Amphidinium carterae. Une expérience d’induction de la transcription du gène de la Peridinin chlorophyll-a binding protein, le complexe majeur de collecte de lumière, a été réalisée par une baisse de l’intensité lumineuse et a montré une faible augmentation (moins de 2 fois) du transcrit à court et long terme. Des expériences de simple-hybride et de retard sur gel (EMSA) ont été faits pour identifier de potentielles interactions protéine-ADN dans la région intergénique du gène PCP organisé en tandem. Ces essais ont été infructueux pour identifier de telles protéines. Une analyse du transcriptome de L. polyedrum a été effectuée, montrant une importante sous-représentation de domaines de liaison à l’ADN classique (comme Heat-shock factor, bZIP ou Myb) et une surreprésentation du domaine d’origine bactérienne Cold shock en comparaison avec d’autres eucaryotes unicellulaires. Ce travail suggère que les mécanismes de régulation transcriptionnelle des dinoflagellés pourraient différer substantiellement de ceux des autres eucaryotes.

Effet de la surexpression du gène Hoxb4 sur la prolifération homéostatique des cellules T mémoires

Les cellules T mémoires (Tm) protègent l’organisme contre les réinfections de pathogènes qu’il a déjà combattu. Les Tm possèdent plusieurs propriétés en commun avec les cellules souches hématopoïétiques (CSH), notamment la capacité de se différencier, de s’auto-renouveler et de maintenir une population relativement constante au sein de l’organisme via des mécanismes homéostatiques. Il a été démontré que Hoxb4, un membre de la famille des facteurs de transcription Hox, était capable d’induire l’expansion des CSH in vivo et in vitro de façon rapide. Au vu de ces parallèles, nous avons posé l’hypothèse que la surexpression de Hoxb4 pourrait induire l’expansion de populations de Tm. Nous avons analysé les populations de Tm et lymphocytes T naïfs (Tn) dans les organes lymphoïdes de souris transgéniques surexprimant Hoxb4 et les avons comparées à des souris de type sauvage (wt). Alors que la fréquence des cellules T matures Hoxb4 diminuait avec l’âge, leur phénotype ainsi que leur viabilité demeuraient inchangés. Ensuite, nous avons procédé à des transplantations en compétition de Tm (CD4+CD44hi) Hoxb4 et wt chez des hôtes dépourvus de lymphocytes T (CD3-/-) dans le but d’évaluer leur contribution à la reconstitution du compartiment T après 2 mois. Au final, les Tm wt avait contribué un peu plus que les Tm Hoxb4 à la reconstitution (~60%). Des analyses fonctionnelles et phénotypiques ont montré que les Tm Hoxb4 possédaient une fonctionnalité normale, mais se distinguaient des Tm wt par la présence d’une faible population qui présentait un phénotype « mémoire central » (Tcm), conférant habituellement une longévité accrue. Les cellules des ganglions lymphatiques totaux des hôtes furent transplantées de façon sérielle chez trois générations de nouveaux hôtes. Le phénotype Tcm observés chez les Tm Hoxb4 était récapitulé chez les hôtes secondaires uniquement. Les ratios sont demeurés en faveur des Tm wt lors des deux transplantations suivantes, mais les Tm Hoxb4 ont commencé à montrer un avantage compétitif chez certains hôtes quaternaires. Une transplantation en compétition à court terme de Tm Hoxb4 et wt marqués avec un marqueur cytoplasmique ont démontré la présence chez les Tm Hoxb4 seulement d’une faible population CD62Lhi proliférant lentement. Ainsi, l’expansion préférentielle de Tcm CD4 par le biais d’une sélection ou d’une différenciation induite par la surexpression de Hoxb4 pourrait potentiellement leur permettre de maintenir un état de quiescence leur permettant de persister plus longtemps suite à des transplantations sérielles.

Analyse génétique de la fonction du gène Polycomb Bmi1 dans le développement et la survie des photorécepteurs chez la souris.

La rétine est constituée de plusieurs types de neurones incluant les cellules amacrines, ganglionnaires, bipolaires et les photorécepteurs. Les photorécepteurs, qui englobent les cônes et les bâtonnets, sont des neurones sensoriels hautement spécialisés qui permettent la conversion de la lumière en signaux électriques par le mécanisme de phototransduction. Les mécanismes moléculaires par lesquels les progéniteurs rétiniens (RPCs) se différencient en différents neurones spécialisés comme les photorécepteurs sont encore peu connus. Le gène Polycomb Bmi1 appartient à la famille des gènes Polycomb qui forment des complexes multimériques impliqués dans la répression de l’expression génique via le remodelage de la chromatine. Au niveau biologique, le gène Bmi1 régule, entre autre, le contrôle de la prolifération cellulaire, le métabolisme des radicaux libres, et la réparation de l’ADN. Récemment, il a été démontré que Bmi1 joue un rôle critique dans la prolifération et l’auto-renouvellement d’un groupe de RPCs immatures. De plus, Bmi1 est essentiel au développement post-natal de la rétine. L'objectif de cette étude est d'analyser le rôle de Bmi1 dans le développement et la survie des photorécepteurs chez la souris. Nos résultats révèlent un phénotype de dégénérescence des photorécepteurs de types cônes chez notre modèle de souris déficiente pour Bmi1. Les bâtonnets sont insensibles à la mutation. De plus, Bmi1 est exprimé de façon prédominante dans les cônes. Nos expériences de culture de cellules rétiniennes suggèrent que le phénotype est cellule-autonome. Par ailleurs, la co-délétion du gène Chk2, membre de la réponse aux dommages à l'ADN, permet de ralentir la progression du phénotype. Les rétines Bmi1-/- et Bmi1-/-Chk2-/- présentent une augmentation importante des dommages oxydatifs à l'ADN. Ces résultats suggèrent que le stress oxydatif pourrait jouer un rôle important dans la survie des cônes. L'étude du rôle du gène Polycomb Bmi1 dans les photorécepteurs est importante pour une meilleure compréhension des mécanismes contribuant à la survie des cônes et pourrait mener à la découverte de nouveaux traitements des maladies dégénératives des cônes.