Role and therapeutic potential of microRNAs in diabetes.

The discovery in mammalian cells of hundreds of small RNA molecules, called microRNAs, with the potential to modulate the expression of the majority of the protein-coding genes has revolutionized many areas of biomedical research, including the diabetes field. MicroRNAs function as translational repressors and are emerging as key regulators of most, if not all, physiological processes. Moreover, alterations in the level or function of microRNAs are associated with an increasing number of diseases. Here, we describe the mechanisms governing the biogenesis and activities of microRNAs. We present evidence for the involvement of microRNAs in diabetes mellitus, by outlining the contribution of these small RNA molecules in the control of pancreatic beta-cell functions and by reviewing recent studies reporting changes in microRNA expression in tissues isolated from diabetes animal models. MicroRNAs hold great potential as therapeutic targets. We describe the strategies developed for the delivery of molecules mimicking or blocking the function of these tiny regulators of gene expression in living animals. In addition, because changes in serum microRNA profiles have been shown to occur in association with different human diseases, we also discuss the potential use of microRNAs as blood biomarkers for prevention and management of diabetes.

Evolutionary origin and functions of retrogene introns.

Retroposed genes (retrogenes) originate via the reverse transcription of mature messenger RNAs from parental source genes and are therefore usually devoid of introns. Here, we characterize a particular set of mammalian retrogenes that acquired introns upon their emergence and thus represent rare cases of intron gain in mammals. We find that although a few retrogenes evolved introns in their coding or 3' untranslated regions (untranslated region, UTR), most introns originated together with untranslated exons in the 5' flanking regions of the retrogene insertion site. They emerged either de novo or through fusions with 5' UTR exons of host genes into which the retrogenes inserted. Generally, retrogenes with introns display high transcription levels and show broader spatial expression patterns than other retrogenes. Our experimental expression analyses of individual intron-containing retrogenes show that 5' UTR introns may indeed promote higher expression levels, at least in part through encoded regulatory elements. By contrast, 3' UTR introns may lead to downregulation of expression levels via nonsense-mediated decay mechanisms. Notably, the majority of retrogenes with introns in their 5' flanks depend on distant, sometimes bidirectional CpG dinucleotide-enriched promoters for their expression that may be recruited from other genes in the genomic vicinity. We thus propose a scenario where the acquisition of new 5' exon-intron structures was directly linked to the recruitment of distant promoters by these retrogenes, a process potentially facilitated by the presence of proto-splice sites in the genomic vicinity of retrogene insertion sites. Thus, the primary role and selective benefit of new 5' introns (and UTR exons) was probably initially to span the often substantial distances to potent CpG promoters driving retrogene transcription. Later in evolution, these introns then obtained additional regulatory roles in fine tuning retrogene expression levels. Our study provides novel insights regarding mechanisms underlying the origin of new introns, the evolutionary relevance of intron gain, and the origin of new gene promoters.

New insights into the role of microRNAs in pancreatic ß-cell maturation and plasticity

Le diabète est une maladie chronique caractérisée par une élévation du taux de sucre dans le sang aussi appelé « glycémie » reflétant un état pathologique. L'élévation de la glycémie au long cours a des répercussions délétères sur nombreux de nos tissus et organes d'où l'apparition de complications sévères chez les sujets diabétiques pouvant atteindre les yeux, les reins, le système nerveux, le système cardiovasculaire et les membres inférieurs. La carence en une hormone essentielle à notre organisme, l'insuline, est au coeur du développement de la maladie. L'insuline induit la captation du glucose circulant dans le sang en excès suite à une prise alimentaire riche en glucides et favorise son utilisation et éventuellement son stockage dans les tissus tels que le foie, le tissu adipeux et les muscles. Ainsi, l'insuline est vitale pour réguler et maintenir stable notre niveau de glycémie. Les cellules bêta du pancréas sont les seules entités de notre corps capables de produire de l'insuline et une perte de fonctionnalité associée à leur destruction ont été mises en cause dans le processus pathologique du diabète de type 2. Cependant la pleine fonctionnalité et la maturation des cellules bêta n'apparaissent qu'après la naissance lorsque le pancréas en développement a atteint sa masse adulte définitive. Enfin, une fois la masse des cellules bêta définitive établie, leur nombre et volume restent relativement constants au cours de la vie adulte chez un sujet sain. Néanmoins, au cours de périodes critiques les besoins en insuline sont augmentés tel qu'observé chez les femmes enceintes et les personnes obèses qui ont une perte de sensibilité à l'insuline qui se traduit par la nécessité de sécréter plus d'insuline afin de maintenir une glycémie normale. Dans l'hypothèse où la compensation n'a pas lieu ou n'est pas aboutie, le diabète se développe. Le processus de maturation postnatale ainsi que les événements compensatoires sont donc des étapes essentielles et de nombreuses questions sont encore non résolues concernant l'identification des mécanismes les régulant. Parmi les acteurs potentiels figurent de petites molécules d'ARN découvertes récemment appelées microARNs et qui ont été rapidement suggérées très prometteuses dans l'identification de nouvelles cibles thérapeutiques dans le cadre du diabète et d'autres pathologies. Les microARNs vont réguler l'expression de notre génome sans en modifier la séquence, phénomène également appelé épigénétique, ce qui résulte en des différences de comportement et de fonction cellulaires. Les microARNs sont donc susceptibles de jouer un rôle clé dans l'ensemble des processus biologiques et notre environnement associé à nos prédispositions génétiques peuvent grandement modifier leur niveau et donc leur action, qui à son tour se répercutera sur notre état physiologique. En effet nous avons identifié des changements de microARNs dans les cellules d'îlots pancréatiques de modèles animaux (rats et souris) associés à un état de résistance à l'insuline (grossesse et obésité). Par le biais d'expériences in vitro sur des cellules bêta extraites de rats et conservées en culture, nous avons pu analyser de plus près l'implication des microARNs dans la capacité des cellules bêta à sécréter de l'insuline mais aussi à se multiplier et à survivre au sein d'un environnement toxique. Ainsi, nous avons identifié des microARNs qui participent positivement à la compensation des cellules bêta, sous la direction d'hormones telles les estrogènes ou d'une hormone libérée par l'intestin au cours de la digestion (l'inerétine GLP1) et qui est largement utilisée comme agent thérapeutique dans la médication contre le diabète. Dans un second temps nous avons utilisé une stratégie similaire afin de déterminer le rôle de microARNs préalablement détectés comme étant changés au cours du développement postnatal des cellules bêta chez le rat. Cette étude a également mené à l'identification de microARNs participant à la maturation et à l'expansion de la masse des cellules bêta sous l'influence de la composition du régime alimentaire et des besoins en insuline adéquats qui en dépendent. Ces études apportent la vision de nouveaux mécanismes moléculaires impliquant les microARNs et démontrant leur importance pour le bon fonctionnement des cellules bêta et leur capacité d'adaptation à l'environnement. -- Les cellules bêta sont une composante des îlots pancréatiques de Langerhans et sont des cellules hautement différenciées qui ont l'unique capacité de sécréter de l'insuline sous l'influence des nutriments suite à une prise alimentaire. L'insuline facilite l'incorporation de glucose dans ses tissus cibles tels le foie, le tissu adipeux et les muscles. Bien que les besoins en insuline soient relativement constants au cours de la vie d'un individu sain, certaines conditions associées à un état de résistance à l'insuline, telles la grossesse ou l'obésité, requièrent une libération d'insuline majorée. En cas de résistance à l'insuline, une dysfonction des cellules bêta plus ou moins associée à leur mort cellulaire, conduisent à une sécrétion d'insuline insuffisante et au développement d'une hyperglycémie chronique, caractéristique du diabète de type 2. Jusqu'à présent, les mécanismes moléculaires sous- jacents à la compensation des cellules bêta ou encore menant à leur dysfonction restent peu connus. Découverts récemment, les petits ARNs non-codant appelés microARNs (miARNs), suscitent un intérêt grandissant de par leur potentiel thérapeutique pour la prise en charge et le traitement du diabète. Les miARNs sont de puissants régulateurs de l'expression génique qui lient directement le 3'UTR de leurs ARN messagers cibles afin d'inhiber leur traduction ou d'induire leur dégradation, ce qui leur permet de contrôler des fonctions biologiques multiples. Ainsi, nous avons pris pour hypothèse que les miARNs pourraient jouer un rôle essentiel en maintenant la fonction des cellules bêta et des processus compensatoires afin de prévenir le développement du diabète. Lors d'une première étude, une analyse transcriptomique a permis l'identification de miARNs différemment exprimés au sein d'îlots pancréatiques de rattes gestantes. Parmi eux, le miR-338-3p a démontré la capacité de promouvoir la prolifération et la survie des cellules bêta exposées à des acides gras saturés et des cytokines pro-inflammatoires, sans altérer leur propriété sécrétrice d'insuline. Nous avons également identifié deux hormones reconnues pour leurs propriétés bénéfiques pour la physiologie de la cellule bêta, l'estradiol et l'incrétine GLP1, qui régulent les niveaux du miR-338-3p. Ce miARN intègre parfaitement les voies de signalisation de ces deux hormones dépendantes de l'AMP cyclique, afin de contrôler l'expression de nombreux gènes conduisant à son action biologique. Dans un projet ultérieur, notre objectif était de déterminer la contribution de miARNs dans l'acquisition de l'identité fonctionnelle des cellules bêta en période postnatale. En effet, directement après la naissance les cellules bêta sont reconnues pour être encore immatures et incapables de sécréter de l'insuline spécifiquement en réponse à l'élévation de la glycémie. Au contraire, la réponse insulinique induite par les acides aminés ainsi que la biosynthèse d'insuline sont déjà fonctionnelles. Nos recherches ont permis de montrer que les changements de miARNs corrélés avec l'apparition du phénotype sécrétoire en réponse au glucose, sont régis par la composition nutritionnelle du régime alimentaire et des besoins en insuline qui en découlent. En parallèle, le taux de prolifération des cellules bêta est considérablement réduit. Les miARNs que nous avons étudiés coordonnent des changements d'expression de gènes clés impliqués dans l'acquisition de propriétés vitales de la cellule bêta et dans la maintenancé de son identité propre. Enfin, ces études ont permis de clairement démontrer l'importance des miARNs dans la régulation de la fonction des cellules bêta pancréatiques. -- Beta-cells are highly differentiated cells localized in the pancreatic islets and are characterized by the unique property of secreting insulin in response to nutrient stimulation after meal intake. Insulin is then in charge of facilitating glucose uptake by insulin target tissues such as liver, adipose tissue and muscles. Despite insulin needs stay more or less constant throughout life of healthy individuals, there are circumstances such as during pregnancy or obesity which are associated to insulin resistance, where insulin needs are increased. In this context, defects in beta-cell function, sometimes associated with beta-cell loss, may result in the release of inappropriate amounts of insulin leading to chronic hyperglycemia, properly defined as type 2 diabetes mellitus. So far, the mechanisms underlying beta- cell compensation as well as beta-cell failure remain to be established. The recently discovered small non-coding RNAs called microRNAs (miRNAs) are emerging as interesting therapeutic targets and are bringing new hope for the treatment of diabetes. miRNAs display a massive potential in regulating gene expression by directly binding to the 3'UTR of messenger RNAs and by inhibiting their translation and/or stability, enabling them to modify a wide range of biological functions. In view of this, we hypothesized that miRNAs may play an essential role in preserving the functional beta-cell mass and permitting to fight against beta-cell exhaustion and decompensation that can lead to diabetes development. In a first study, global profiling in pancreatic islets of pregnant rats, a model of insulin resistance, led to the identification of a set of differentially expressed miRNAs. Among them, miR-338- 3p was found to promote beta-cell proliferation and survival upon exposure of islet cells to pro- apoptotic stimuli such as saturated fatty acids or pro-inflammatory cytokines, without impairment in their capacity to release insulin. We also discovered that miR-338-3p changes are driven by two hormones, the estradiol and the incretin GLP1, both well known for their beneficial impact on beta- cell physiology. Consistently, we found that miR-338-3p integrates the cAMP-dependent signaling pathways regulated by these two hormones in order to control the expression of numerous genes and execute its biological functions. In a second project, we aimed at determining whether miRNAs contribute to the acquisition of beta-cell identity. Indeed, we confirmed that right after birth beta-cells are still immature and are unable to secrete insulin specifically in response to elevated concentrations of glucose. In contrast, amino acid-stimulated insulin release as well as insulin biosynthesis are already fully functional. In parallel, newborn beta-cells are proliferating intensively within the expanding pancreas. Interestingly, we demonstrated that the miRNA changes and the subsequent acquisition of glucose responsiveness is influenced by the diet composition and the resulting insulin needs. At the same time, beta-cell proliferation declines. The miRNAs that we have identified orchestrate expression changes of essential genes involved in the acquisition of specific beta-cell properties and in the maintenance of a mature beta-cell identity. Altogether, these studies clearly demonstrate that miRNAs play important roles in the regulation of beta-cell function.

Origins, evolution, and phenotypic impact of new genes.

Ever since the pre-molecular era, the birth of new genes with novel functions has been considered to be a major contributor to adaptive evolutionary innovation. Here, I review the origin and evolution of new genes and their functions in eukaryotes, an area of research that has made rapid progress in the past decade thanks to the genomics revolution. Indeed, recent work has provided initial whole-genome views of the different types of new genes for a large number of different organisms. The array of mechanisms underlying the origin of new genes is compelling, extending way beyond the traditionally well-studied source of gene duplication. Thus, it was shown that novel genes also regularly arose from messenger RNAs of ancestral genes, protein-coding genes metamorphosed into new RNA genes, genomic parasites were co-opted as new genes, and that both protein and RNA genes were composed from scratch (i.e., from previously nonfunctional sequences). These mechanisms then also contributed to the formation of numerous novel chimeric gene structures. Detailed functional investigations uncovered different evolutionary pathways that led to the emergence of novel functions from these newly minted sequences and, with respect to animals, attributed a potentially important role to one specific tissue--the testis--in the process of gene birth. Remarkably, these studies also demonstrated that novel genes of the various types significantly impacted the evolution of cellular, physiological, morphological, behavioral, and reproductive phenotypic traits. Consequently, it is now firmly established that new genes have indeed been major contributors to the origin of adaptive evolutionary novelties.

Isolation of a cotton NADP(H) oxidase homologue induced by drought stress

The aim of this study was to identify and isolate genes that are differentially expressed in four selected cotton (Gossypium hirsutum L.) genotypes contrasting according to their tolerance to water deficit. The genotypes studied were Siokra L-23, Stoneville 506, CS 50 and T-1521. Physiological, morphological and developmental changes that confer drought tolerance in plants must have a molecular genetic basis. To identify and isolate the genes, the mRNA Differential Display (DD) technique was used. Messenger RNAs differentially expressed during water deficit were identified, isolated, cloned and sequenced. The cloned transcript A12B15-5, a NADP(H) oxidase homologue, was up regulated only during the water deficit stress and only in Siokra L-23, a drought tolerant genotype. Ribonuclease protection assay confirmed that transcription.

Quantitative proteomics of heat-treated human cells show an across-the-board mild depletion of housekeeping proteins to massively accumulate few HSPs.

Classic semiquantitative proteomic methods have shown that all organisms respond to a mild heat shock by an apparent massive accumulation of a small set of proteins, named heat-shock proteins (HSPs) and a concomitant slowing down in the synthesis of the other proteins. Yet unexplained, the increased levels of HSP messenger RNAs (mRNAs) may exceed 100 times the ensuing relative levels of HSP proteins. We used here high-throughput quantitative proteomics and targeted mRNA quantification to estimate in human cell cultures the mass and copy numbers of the most abundant proteins that become significantly accumulated, depleted, or unchanged during and following 4 h at 41 °C, which we define as mild heat shock. This treatment caused a minor across-the-board mass loss in many housekeeping proteins, which was matched by a mass gain in a few HSPs, predominantly cytosolic HSPCs (HSP90s) and HSPA8 (HSC70). As the mRNAs of the heat-depleted proteins were not significantly degraded and less ribosomes were recruited by excess new HSP mRNAs, the mild depletion of the many housekeeping proteins during heat shock was attributed to their slower replenishment. This differential protein expression pattern was reproduced by isothermal treatments with Hsp90 inhibitors. Unexpectedly, heat-treated cells accumulated 55 times more new molecules of HSPA8 (HSC70) than of the acknowledged heat-inducible isoform HSPA1A (HSP70), implying that when expressed as net copy number differences, rather than as mere "fold change" ratios, new biologically relevant information can be extracted from quantitative proteomic data. Raw data are available via ProteomeXchange with identifier PXD001666.

Post-transcriptional regulation of circadian gene expression by miRNAs

La grande majorité des organismes vivants ont développé un système d'horloges biologiques internes, appelées aussi horloges circadiennes, contrôlant l'expression de gênes impliqués dans de nombreux processus moléculaires et comportementaux. Au cours de la dernière décennie, des analyses « microarray » et séquençages à haut débit sur divers tissus de mammifères, indiquent que jusqu'à 20% du transcriptome serait sous contrôle circadien. Il était jusqu'à présent admis que la majorité des ARNm ayant une accumulation rythmique était générée par une transcription qui était elle-même rythmique. Toutefois, de récentes études ont suggéré qu'une proportion considérable des ARNm cycliques serait en fait générée par des mécanismes post-transcriptionnelles, incluant une régulation par micro-ARN (miARN). Lorsque j'ai débuté mon travail de thèse, l'influence des miARN sur l'expression des gènes circadiens, au niveau pangénomique, était encore méconnue. Par l'utilisation d'un modèle murin, dont la biogenèse des miARN a été spécifiquement désactivée au niveau des cellules hépatiques (knockout conditionnel pour Dicer), je me suis donc intéressée au rôle que jouaient ces molécules régulatrices sur la rythmicité de l'expression génique dans le foie. Des séquençages sur l'ensemble du transcriptome révèlent que l'horloge interne du foie est étonnement résistante à la perte totale des miARN. Nous avons cependant trouvé que les miARN agissent de façon importante sur la régulation de l'expression des gènes contrôlés par l'horloge moléculaire. La corégulation par les miARN, affectant jusqu'à 30% des gènes transcrits de façon rythmiques, conduit ainsi à une modulation de phase et d'amplitude du rythme de l'abondance des ARNm. En revanche, seuls peu de transcrits dépendent uniquement des miARN pour la rythmicité de leur accumulation. Enfin, mon travail met en évidence plusieurs miARN spécifiques, qui semblent préférentiellement moduler l'expression des gènes cycliques et permet l'identification de voies hépatiques particulièrement sujettes à une double régulation par les miARN et l'horloge biologique interne. La première masse d'analyses a essentiellement porté sur le rôle que jouent les miARN au niveau de l'expression des gènes contrôlés par l'horloge interne. Dans deux études de suivi, je me suis penchée sur deux aspects supplémentaires et complémentaires de la manière dont les miARN et l'oscillation de l'expression des gènes interagissent. Dans les hépatocytes murins, spécifiquement privés de Dicer, je me suis demandée si un phénotype horloge avait pu être masqué, dû à un entraînement stable de l'horloge du foie par l'horloge maîtresse du cerveau. J'ai donc commencé une série d'expériences ambitieuses (impliquant la mesure de la rythmicité du foie in vivo, chez l'animal vivant) afin de déséquilibrer l'entrainement de l'horloge hépatique via l'utilisation d'un protocole nutritionnel spécifique. Les premiers résultats suggèrent que dans des conditions où l'animal subit une restriction alimentaire pendant la journée, les miARN sont importants dans la cinétique d'adaptation des organes périphériques à un nouvel horaire de sustentation. Dans une deuxième ligne de recherche, j'ai plus profondément étudié quels seraient les miARN responsables des rythmes post-transcriptionnels des ARNm, en utilisant le séquençage de « small » ARN sur 24h. L'analyse est en cours et se poursuivra après l'obtention de mon diplôme. De façon générale, mon travail révèle d'importants et nouveaux rôles des miARN dans la modulation de l'expression circadienne des gènes hépatiques. De plus, le set de données générées dans l'étude déjà publiée, peut dorénavant servir de ressource valable pour de prochaines investigations sur le rôle physiologique que les miARN jouent au niveau du foie. -- Most living organisms have developed internal timing systems, called circadian clocks, to drive the rhythmic expression of genes involved in many molecular and behavioral processes. Over the last decade, microarray analyses and high- throughput sequencing from various mammalian tissues have indicated that up to 20% of the transcriptome are under circadian control. It was generally assumed that the majority of rhythmic mRNA accumulation is generated by rhythmic transcription. However, recent studies have suggested that a considerable proportion of mRNA cycling may actually be generated by post-transcriptional mechanisms, including by microRNAs. When I started my thesis work, it was still unknown how miRNAs influence circadian gene expression in a genome-wide fashion. Using a mouse model in which miRNA biogenesis can be inactivated in hepatocytes (conditional Dicer knockout mouse), I have thus addressed the role that these regulatory molecules play in rhythmic gene expression in the liver. Whole transcriptome sequencing revealed that the hepatic core clock was surprisingly resilient to total miRNA loss. However, we found that miRNAs acted as important regulators of clock-controlled gene expression. Co- regulation by miRNAs, which affected up to 30% of rhythmically transcribed genes, thus led to the modulation of phases and amplitudes of mRNA abundance rhythms. By contrast, only very few transcripts were strictly dependent on miRNAs for their rhythmic accumulation. Finally, my work highlights several specific miRNAs that appear to preferentially modulate cyclic gene expression, and identifies pathways in the liver that are particularly prone to dual regulation through miRNAs and the clock. The first bulk of analyses mainly dealt with the role that miRNAs play at the level of rhythmic clock output gene expression. In two follow-up studies I further delved into two additional, complementary aspects of how miRNAs and gene expression oscillations interact. First, I addressed whether a core clock phenotype in the hepatocyte-specific Dicer knockout could have been masked due to the stable entrainment of the liver clock by the animals' master clock in the brain. I thus started a series of ambitious experiments (involving the in vivo recording of liver rhythms in live animals) to bring the stable entrainment of the liver clock out of equilibrium using specific feeding protocols. My first results suggest that under conditions when animals are challenged by food restriction to daytime, miRNAs are important for the kinetics of adapting to unusual mealtime in peripheral tissue. In a second line of research, I have more carefully investigated which miRNAs are responsible for post- transcriptional mRNA rhythms using small RNA sequencing around-the-clock. The analyses are ongoing and will be continued after my graduation. Overall, my work uncovered important and novel roles of miRNA activity in shaping hepatic circadian gene expression; moreover, the datasets collect in the published studies can serve as a valuable resource for further investigations into the physiological roles that miRNAs play in liver. -- L'alternance du jour et de la nuit dirige depuis longtemps la vie quotidienne des êtres humains et de la plupart des organismes sur terre. Ce cycle de 24 heures façonne beaucoup de changements comportementaux et physiologiques tels que la vigilance, la température corporelle et le sommeil. Les rythmes journaliers, appelés rythmes circadiens, sont dirigés par des horloges biologiques tournant dans presque chaque cellule du corps. Une structure dans le cerveau agit en tant qu'horloge maitresse pour synchroniser les horloges internes entre elles et en fonction des signaux de jour/nuit extérieurs. Dans les cellules "les gènes de l'horloge" sont activés et désactivés une fois par jour ce qui déclenche des cycles dans lesquels des protéines sont produites de manière circadienne. Ces rythmes protéiques sont spécialisés pour chaque tissu ou organe et peuvent les aider à réaliser leurs tâches quotidiennes. Les rythmes circadiens peuvent être générés d'autres manières n'impliquant pas directement les composants des gènes de l'horloge. Les ARN messagers (ARNm) sont des molécules intermédiaires dans la production de protéines à partir d'ADN. Dans le foie des souris jusqu'à 20% des molécules d'ARNm sont produites suivant des rythmes circadiens. Le foie réalise des tâches essentielles dans le contrôle du métabolisme incluant celui des hydrates de carbone, des graisses et du cholestérol. Un timing précis est important afin de traiter les substances nutritives correctement lors des repas il en résulte une variation des quantités de certains ARNm et protéines coïncidant avec les repas. Les microARNs constituent une autre classe de molécules ARN de très petite taille qui régulent l'efficacité de traduction des ARNm en protéines et la stabilité des ARNm. Lors de mon travail de thèse, j'ai exploré de manière approfondie l'influence de ces petits régulateurs sur les rythmes circadiens du foie de souris. Ces expériences qui impliquaient le "Knock-out" d'un gène essentiel à la production de microARNs montrent qu'au lieu de générer les rythmes des ARNm, les microARNs les ajustent pour répondre aux besoins spécifiques du foie comme assurer leur pic au bon moment de la journée. Le ciblage de microARNs spécifiques peut révéler de nouvelles stratégies pour rectifier ces rythmes lorsque par exemple les fonctions métaboliques ne fonctionnent plus normalement. -- The rising and setting of the sun have long driven the daily schedules of humans and most organisms on the earth. This 24-hr cycle shapes many behavioural and physiological changes, such as alertness, body temperature, and sleep. These daily rhythms, which are called circadian rhythms, are dictated by biological clocks that are ticking in almost every single cell of the body. A region in the brain acts as a master clock to synchronize the internal clocks with each other and with the outside light/dark cycles. In cells, "core clock genes" are turned on and off once per day, which triggers cycles that cause some proteins to be produced in a circadian manner. The protein rhythms are specialized to a particular tissue or organ, and may help them to carry out their designated daily tasks. However, circadian rhythms might also be produced by other ways that do not involve these core clock components. Messenger RNAs (mRNAs) are intermediate molecules in the production of proteins from DNA. In the mouse liver, up to 20% of mRNA molecules are produced in circadian cycles. The liver performs essential tasks that control metabolism-including that of carbohydrates, fats, and cholesterol. Precisely timing when certain mRNAs and proteins reach peaks and troughs in their activities to coincide with mealtimes is important for nutrients to be properly processed. Other RNA molecules called microRNAs, i.e. RNAs of very small size, regulate at which rate mRNA molecules are translated into proteins. In my thesis work, I have explored at the influence of these small regulators on circadian rhythms in the mouse liver in greater detail. These experiments, which involved "knocking out" a gene that is essential for the production of microRNAs, show that rather than generating the mRNA rhythms, the microRNAs appear to adjust them to meet the specific needs of the liver, such as ensuring that they peak at the right time-of-day. Targeting specific microRNA molecules may reveal new strategies to tweak these rhythms, which could help to improve conditions when metabolic functions go wrong.

MicroRNAs as novel regulators of skeletal homeostasis

The human skeleton is composed of bone and cartilage. The differentiation of bone and cartilage cells from their bone marrow progenitors is regulated by an intrinsic network of intracellular and extracellular signaling molecules. In addition, cells coordinate their differentiation and function through reciprocal cell‐to‐cell interactions. MicroRNAs (miRNAs) are small, single‐stranded RNA molecules that inhibit protein translation by binding to messenger RNAs (mRNAs). Recent evidence demonstrates the involvement of miRNAs in multiple biological processes. However, their role in skeletal development and bone remodeling is still poorly understood. The aim of this thesis was to elucidate miRNA‐mediated gene regulation in bone and cartilage cells, namely in osteoblasts, osteoclasts, chondrocytes and bone marrow adipocytes. Comparison of miRNA expression during osteogenic and chondrogenic differentiation of bone marrow‐derived mesenchymal stem cells (MSCs) revealed several miRNAs with substantial difference between bone and cartilage cells. These miRNAs were predicted to target genes essentially involved in MSC differentiation. Three miRNAs, miR‐96, miR‐124 and miR‐199a, showed marked upregulation upon osteogenic, chondrogenic or adipogenic differentiation. Based on functional studies, these miRNAs regulate gene expression in MSCs and may thereby play a role in the commitment and/or differentiation of MSCs. Characterization of miRNA expression during osteoclastogenesis of mouse bone marrow cells revealed a unique expression pattern for several miRNAs. Potential targets of the differentially expressed miRNAs included many molecules essentially involved in osteoclast differentiation. These results provide novel insights into the expression and function of miRNAs during the differentiation of bone and cartilage cells. This information may be useful for the development of novel stem cell‐based treatments for skeletal defects and diseases.

Conception de microARNs pour attenuer l'expression de genes

Les microARNs appartiennent à la famille des petits ARNs non-codants et agissent comme inhibiteurs des ARN messagers et/ou de leurs produits protéiques. Les mi- croARNs sont différents des petits ARNs interférants (siARN) car ils atténuent l’ex- pression au lieu de l’éliminer. Dans les dernières années, de nombreux microARNs et leurs cibles ont été découverts chez les mammifères et les plantes. La bioinforma- tique joue un rôle important dans ce domaine, et des programmes informatiques de découvertes de cibles ont été mis à la disposition de la communauté scientifique. Les microARNs peuvent réguler chacun des centaines de gènes, et les profils d’expression de ces derniers peuvent servir comme classificateurs de certains cancers. La modélisation des microARNs artificiels est donc justifiable, où l’un pourrait cibler des oncogènes surexprimés et promouvoir une prolifération de cellules en santé. Un outil pour créer des microARNs artificiels, nommé MultiTar V1.0, a été créé et est disponible comme application web. L’outil se base sur des propriétés structurelles et biochimiques des microARNs et utilise la recherche tabou, une métaheuristique. Il est démontré que des microARNs conçus in-silico peuvent avoir des effets lorsque testés in-vitro. Les sé- quences 3’UTR des gènes E2F1, E2F2 et E2F3 ont été soumises en entrée au programme MultiTar, et les microARNs prédits ont ensuite été testés avec des essais luciférases, des western blots et des courbes de croissance cellulaire. Au moins un microARN artificiel est capable de réguler les trois gènes par essais luciférases, et chacun des microARNs a pu réguler l’expression de E2F1 et E2F2 dans les western blots. Les courbes de crois- sance démontrent que chacun des microARNs interfère avec la croissance cellulaire. Ces résultats ouvrent de nouvelles portes vers des possibilités thérapeutiques.

A mechanism for co-transcriptional recruitment of mRNA localization factor on nascent mRNAs in budding yeast

Le transport et la localisation des ARN messagers permettent de réguler l’expression spatiale et temporelle de facteurs spécifiques impliqués dans la détermination du destin cellulaire, la plasticité synaptique, la polarité cellulaire et la division asymétrique des cellules. Chez S.cerevisiæ, plus de trente transcrits sont transportés activement vers le bourgeon cellulaire. Parmi ces transcrits, l’ARNm ASH1 (asymetric synthesis of HO) est localisé à l’extrémité du bourgeon pendant l’anaphase. Ce processus va entrainer une localisation asymétrique de la protéine Ash1p, qui sera importée uniquement dans le noyau de la cellule fille, où elle entraine le changement de type sexuel. La localisation asymétrique de l’ARNm ASH1, et donc de Ash1p, implique la présence de différents facteurs de localisation. Parmi ces facteurs, les protéines She (She1p/Myo4p, She2p et She3p) et les répresseurs traductionnels (Puf6p, Loc1p et Khd1p) participent à ce mécanisme. La protéine navette She2p est capable de lier l’ARNm ASH1 et va entrainer le ciblage de cet ARNm vers l’extrémité du bourgeon en recrutant le complexe She3p-Myo4p. Des répresseurs traductionnels régulent la traduction de cet ARNm et évitent l’expression ectopique de la protéine Ash1p pendant son transport. Alors que la fonction cytoplasmique de She2p sur la localisation des ARNm est connue, sa fonction nucléaire est encore inconnue. Nous avons montré que She2p contient une séquence de localisation nucléaire non classique qui est essentielle à son import nucléaire médié par l’importine α (Srp1p). L’exclusion de She2p du noyau par mutation de son NLS empêche la liaison de Loc1p et Puf6p sur l’ARNm ASH1, entrainant un défaut de localisation de l’ARNm et de la protéine. Pour étudier plus en détail l’assemblage de la machinerie de localisation des ARNm dans le noyau, nous avons utilisé des techniques d’immunoprécipitation de chromatine afin de suivre le recrutement des facteurs de localisation et des répresseurs traductionnels sur les ARNm naissants. Nous avons montré que She2p est recruté sur le gène ASH1 pendant sa transcription, via son interaction avec l’ARNm ASH1 naissant. Puf6p est également recruté sur ASH1, mais d’une manière dépendante de la présence de She2p. De façon intéressante, nous avons détecté une interaction entre She2p et la plus grande sous-unité de l’ARN polymérase II (Rpb1p). Cette interaction est détectée avec la forme active en élongation de l’ARN polymérase II. Nous avons également démontré que She2p interagit avec le complexe d’élongation de la transcription Spt4p/Spt5p. Une délétion de SPT4 ou une mutation dans SPT5 (Ts spt5) à température restrictive empêche l’interaction entre She2p et Rpb1p, et diminue le recrutement de She2p au gène ASH1, entrainant un défaut de localisation de l’ARNm et un défaut de localisation asymétrique de la protéine Ash1p. De manière globale, nos résultats montrent que les facteurs impliqués dans la localisation cytoplasmique des ARNm et dans leur contrôle traductionnel sont recrutés de façon co-transcriptionnelle sur les ARNm naissants via leur interaction avec la machinerie de transcription, suggèrant un rôle important de la machinerie transcriptionelle dans la localisation des ARNm.

Conception de miARN artificiels basée sur la caractérisation de la boucle de régulation miR-20/E2F

La biologie moléculaire et, plus spécifiquement, la régulation de l’expression génique ont été révolutionnées par la découverte des microARN (miARN). Ces petits ARN d’une vingtaine de nucléotides sont impliqués dans la majorité des processus cellulaires et leur expression est dérégulée dans plusieurs maladies, comme le cancer. Un miARN reconnaît ses cibles principalement par son noyau, ce qui lui permet de réguler simultanément la traduction de centaines d’ARN messagers. Nos travaux ont montré l’existence d’une boucle de rétro-activation négative, entre deux miARN du polycistron miR-17-92 et trois facteurs de transcription de la famille E2F. E2F1, 2 et 3 induisent la transcription de miR-20 et miR-17 qui par la suite inhibent leur traduction. Nos résultats suggèrent l’implication de cette boucle dans la résistance à l’apoptose induite par E2F1 dans les cellules du cancer de la prostate, ce qui expliquerait en partie le potentiel oncogénique du polycistron miR-17-92. L’étude de ce motif de régulation nous a donc permis de réaliser le potentiel incroyable qu’ont les miARN à inhiber la traduction de plusieurs gènes. Basé sur les règles de reconnaissance des miARN, nous avons développé et validé MultiTar. Cet outil bioinformatique permet de trouver la séquence d’un miARN artificiel ayant le potentiel d’inhiber la traduction de gènes d’intérêts choisis par l’utilisateur. Afin de valider MultiTar, nous avons généré des multitargets pouvant inhiber l’expression des trois E2F, ce qui nous a permis de comparer leur efficacité à celle de miR-20. Nos miARN artificiels ont la capacité d’inhiber la traduction des E2F et de neutraliser leur fonction redondante de la progression du cycle cellulaire de façon similaire ou supérieur à miR-20. La fonctionnalité de notre programme, ouvre la voie à une stratégie flexible pouvant cibler le caractère multigénique de différents processus cellulaires ou maladies complexes, tel que le cancer. L’utilisation de miARN artificiels pourrait donc représenter une alternative intéressante aux stratégies déjà existantes, qui sont limitées à inhiber des cibles uniques. En plus d’élucider un réseau de régulation complexe impliquant les miARN, nous avons pu tirer profit de leur potentiel d’inhibition par la conception de miARN artificiels.

Identification de modifications post-traductionnelles de Staufen1 et étude de leur fonction régulatrice

La régulation post-transcriptionnelle joue un rôle de premier plan dans le contrôle fin de l’expression génique en permettant une modulation de la synthèse de protéines dans le temps et l’espace, en fonction des besoins de la cellule. Ainsi, des protéines reconnaissant des éléments d’ARN présents sur des transcrits peuvent influencer toutes les étapes de leur existence, soit leur épissage, leur export nucléaire, leur localisation subcellulaire, leur traduction et leur dégradation. Staufen1 (Stau1) est un membre de la famille des protéines liant l’ARN double-brin qui contribue à la régulation post-transcriptionnelle par son implication dans des mécanismes qui vont promouvoir l’épissage alternatif, le transport, la dé-répression de la traduction et l’induction de la dégradation d’ARN messagers (ARNm) spécifiques. L’identité des cibles potentielles de Stau1 est maintenant connue puisqu’une étude à l’échelle du génome a montré que la protéine s’associe à près de 7% du transcriptome des cellules HEK293T. Ces ARNm se classent dans un large éventail de catégories fonctionnelles, mais il est tout de même intéressant de noter qu’une grande proportion d’entre eux code pour des protéines reliées au métabolisme cellulaire et à la régulation de processus cellulaires. En considérant toutes ces informations, nous avons émis l’hypothèse que les différentes activités de Stau1 puissent être modulées afin de contrôler adéquatement l’expression des transcrits liés par la protéine. Dans la mesure où certains ARNm faisant partie des complexes définis par la présence de Stau1 codent pour des régulateurs clés de la prolifération cellulaire, nous avons voulu examiner si l’expression de la protéine varie au cours du cycle de division cellulaire. Nous avons montré que l’abondance de Stau1 est maximale en début de mitose et qu’elle diminue ensuite lorsque les cellules complètent la division cellulaire. Nous avons ensuite découvert que cette baisse d’expression de Stau1 en sortie de mitose dépend du complexe promoteur d’anaphase/cyclosome (APC/C). En soutien à l’idée que Stau1 soit une cible de cette ubiquitine ligase de type E3, nous avons de plus démontré que Stau1 est ubiquitiné et dégradé par le protéasome. Ce contrôle des niveaux de Stau1 semble important puisque la surexpression de la protéine retarde la sortie de mitose et entraîne une diminution importante de la prolifération cellulaire. Par ailleurs, nous avons supposé que les différentes fonctions de Stau1 puissent également être sujettes à une régulation. Compte tenu que les activités de nombreuses protéines liant l’ARN peuvent être contrôlées par des modifications post-traductionnelles telles que la phosphorylation, nous avons voulu tester la possibilité que Stau1 soit phosphorylé. L’immunopurification de Stau1 et son analyse par spectrométrie de masse nous a permis d’identifier trois phosphosites dans la protéine. L’évaluation du rôle de ces événements de phosphorylation à l’aide de mutants phoshomimétiques ou non-phoshorylables a révélé que la modification de Stau1 pourrait compromettre son association à la protéine UPF1. Comme cette interaction est nécessaire pour déstabiliser les transcrits liés par Stau1, nos résultats suggèrent fortement que la fonction de Stau1 dans la dégradation d’ARNm est régulée négativement par sa phosphorylation. Toutes ces données mettent en lumière l’importance des modifications post-traductionnelles telles que l’ubiquitination et la phosphorylation dans la modulation de l’expression et des fonctions de Stau 1. Somme toute, il est vraisemblable que ces mécanismes de contrôle puissent avoir un impact significatif sur le destin des ARNm liés par Stau1, particulièrement dans un contexte de progression dans le cycle cellulaire.

The non-coding RNA BC1 is down-regulated in the hippocampus of Wistar Audiogenic Rat (WAR) strain after audiogenic kindling

The aim of this study was to identify molecular pathways involved in audiogenic seizures in the epilepsy-prone Wistar Audiogenic Rat (WAR). For this, we used a suppression-subtractive hybridization (SSH) library from the hippocampus of WARs coupled to microarray comparative gene expression analysis, followed by Northern blot validation of individual genes. We discovered that the levels of the non-protein coding (npc) RNA BC1 were significantly reduced in the hippocampus of WARs submitted to repeated audiogenic seizures (audiogenic kindling) when compared to Wistar resistant rats and to both naive WARs and Wistars. By quantitative in situ hybridization, we verified lower levels of BC1 RNA in the GD-hilus and significant signal ratio reduction in the stratum radiatum and stratum pyramidale of hippocampal CA3 subfield of audiogenic kindled animals. Functional results recently obtained in a BC1-/- mouse model and our current data are supportive of a potential disruption in signaling pathways, upstream of BC1, associated with the seizure susceptibility of WARs. (C) 2010 Elsevier B.V. All rights reserved.

Mechanism of acetylcholine-induced calcium signaling during neuronal differentiation of P19 embryonal carcinoma cells in vitro

Muscarinic (mAChRs) and nicotinic acetylcholine receptors (nAChRs) are involved in various physiological processes, including neuronal development. We provide evidence for expression of functional nicotinic and muscarinic receptors during differentiation of P19 carcinoma embryonic cells, as an in vitro model of early neurogenesis. We have detected expression and activity alpha(2)-alpha(7), beta(2), beta(4) nAChR and M1-M5 mAChR subtypes during neuronal differentiation. Nicotinic alpha(3) and beta(2) mRNA transcription was induced by addition of retinoic acid to P19 cells. Gene expression Of alpha(2), alpha(4)-alpha(7), beta(4) nAChR subunits decreased during initial differentiation and increased again when P19 cells underwent final maturation. Receptor response in terms of nicotinic agonist-evoked Ca2+, flux was observed in embryonic and neuronal-differentiated cells. Muscarinic receptor response, merely present in undifferentiated P19 cells, increased during neuronal differentiation. The nAChR-induced elevation of intracellular calcium ([Ca2+](i)) response in undifferentiated cells was due to Ca2+ influx. In differentiated P19 neurons the nAChR-induced [Ca2+](i) response was reduced following pretreatment with ryanodine, while the mAChR-induced response was unaffected indicating the contribution of Ca2+ release from ryanodine-sensitive stores to nAChR- but not mAChR-mediated Ca2+ responses. The presence of functional nAChRs in embryonic cells suggests that these receptors are involved in triggering Ca2+ waves during initial neuronal differentiation. (C) 2007 Elsevier Ltd. All rights reserved.

Effects of electroacupuncture on experimental periodontitis in rats

Background: Acupuncture has shown the capability of modulating the immuno-inflammatory response of the host. This study aims to evaluate the effects of electroacupuncture (EA) on ligature-induced periodontitis in rats. Methods: Thirty-two animals were divided into four groups: 1) control; 2) experimental periodontitis (EP); 3) sham-treated (EP/EA-sham); and 4) treated with EA (EP/EA). For the EP groups, a ligature was placed around the right mandibular first molars at day 1. Sessions of EA or EA-sham were assigned every other day. For EA treatment, large intestine meridian points LI4 and LI11 and stomach meridian points ST36 and ST44 were used. EA-sham was performed in off-meridian points. Animals were euthanized at day 11. Histomorphometric and microtomographic analyses were performed. Immunolabeling patterns for the receptor activator of nuclear factor kappa B ligand (RANKL), osteoprotegerin (OPG), and tartrate-resistant acid phosphatase (TRAP) were assessed. Expressions of interleukin (IL)-1 beta, matrix metalloproteinase (MMP)-8, IL-6, and cyclooxygenase (COX)-2 messenger RNAs (mRNAs) were evaluated by quantitative reverse transcription-polymerase chain reaction. Data were analyzed statistically (P < 0.05, analysis of variance). Results: Histomorphometric and microtomographic analyses demonstrated that group EP/EA presented reduced alveolar bone loss when compared to group EP (P < 0.05). Reduced RANKL immunolabeling and fewer TRAP-positive multinucleated cells were observed in the EA-treated group in relation to group EP. No differences were observed in OPG expression among groups. EA treatment decreased the genic expression of IL-1 beta and MMP-8 (P < 0.05), increased the mRNA expression of IL-6 (P < 0.05), and did not modify the genic expression of COX-2 in animals with EP (P > 0.05). Conclusion: It can be concluded that EA reduced periodontal tissue breakdown and the expression of some proinflammatory mediators and a proresorptive factor in EP in rats.