Pathogenic variation in Colletotrichum gloeosporioides infecting Stylosanthes spp. in a center of diversity in Brazil

Pathogenic variation in Colletotrichum gloeosporioides infecting species of the tropical pasture legume Stylosanthes at its center of diversity was determined from 296 isolates collected from wild host population and selected germ plasm of S. capitata, S. guianensis, S. scabra, and S. macrocephala in Brazil. A putative host differential set comprising 11 accessions was selected from a bioassay of 18 isolates on 19 host accessions using principal component analysis. A similar analysis of anthracnose severity data for a subset of 195 isolates on the 11 differentials indicated that an adequate summary of pathogenic variation could be obtained using only five of these differentials. of the five differentials, S. seabrana 'Primar' was resistant and S. scabra 'Fitzroy' was susceptible to most isolates. A cluster analysis was used to determine eight natural race clusters using the 195 isolates. Linear discriminant functions were developed for eight race clusters using the 195 isolates as the training data set, and these were applied to classify a test data set of the remaining 101 isolates. All except 11 isolates of the test data set were classified into one of the eight race clusters. Over 10% of the 296 isolates were weakly pathogenic to all five differentials and another 40% were virulent on just one differential. The unclassified isolates represent six new races with unique virulence combinations, of which one isolate is virulent on all five differentials. The majority of isolates came from six field sites, and Shannon's index of diversity indicated considerable variation between sites. Pathogenic diversity was extensive at three sites where selected germ plasm were under evaluation, and complex race clusters and unclassified isolates representing new races were more prevalent at these sites compared with sites containing wild Stylosanthes populations.

Genetic diversity in Colletotrichum gloeosporioides from Stylosanthes spp. at Centers of origin and utilization

Using molecular markers, this work compares the genetic diversity in Colletotrichum gloeosporioides infecting species of the tropical forage legume Stylosanthes at the center of origin in Brazil and Colombia with that of Australia, China, and India, where Srylosanthes spp. have been introduced for commercial use. There was extensive diversity in the pathogen population from Brazil, Colombia, China, and India. The Australian pathogen population was least diverse probably due to its geographical isolation and effective quarantine. The extensive diversity in China and India means that threats from exotic pathogen races to Stylosanthes pastures can potentially come from countries outside the South American center of origin. In Brazil and India, both with native Stylosanthes populations, a high level of genetic differentiation in the pathogen population was associated with sites where native or naturalized host population was widely distributed. There was limited genetic diversity at germplasm evaluation sites, with a large proportion of isolates having identical haplotypes. This contrasts recent pathogenicity results for 78 of the Brazilian isolates that show hot spots of complex races are more common around research stations where host germplasm are tested, but few are found at sites containing wild host populations. For a pathogen in which the same races arise convergently from different genetic backgrounds, this study highlights the importance of using both virulence and selectively neutral markers to understand pathogen population structure.

Colletotrichum gloeosporioides, a new causal agent of citrus post-bloom fruit drop

Citrus post-bloom fruit drop (caused by Colletotrichum acutatum) frequently occurs in the southwestern region of So Paulo State, Brazil. A survey of Colletotrichum isolates associated with symptoms of post-bloom fruit drop in So Paulo State showed C. gloeosporioides in addition to C. acutatum. The objectives of this study were to confirm the identification of C. gloeosporioides isolated from symptomatic citrus flowers, to test the pathogenicity of C. gloeosporioides isolates, to compare the development of disease caused by C. gloeosporioides and C. acutatum, and to determine the frequency of C. gloeosporioides in a sample of isolates obtained from symptomatic flowers in different regions of So Paulo State. Through the use of species-specific primers by PCR, 17.3% of 139 isolates were C. gloeosporioides, and the remaining 82.7% were C. acutatum. The pathogenicity tests, carried out in 3-year old potted plants of sweet oranges indicated that both species caused typical symptoms of the disease including blossom blight and persistent calyces. Incubation periods (3.5 and 3.9 days, respectively, for C. acutatum and C. gloeosporioides) and fruit sets (6.7 and 8.5%, respectively for C. acutatum and C. gloeosporioides) were similar for both species. The incidences of blossom blight and persistent calyces were higher on plants inoculated with C. acutatum than in those inoculated with C. gloeosporioides. Conidial germination was similar for both species under different temperatures and wetness periods. Under optimal conditions, appressorium formation and melanisation were higher for C. gloeosporioides than for C. acutatum. These results indicated that Colletotrichum gloeosporioides is a new causal agent of post-bloom fruit drop.

Isolation of genotype- and chromosome-specific DNA markers in a biotype of Colletotrichum gloeosporioides using random amplified polymorphic DNA analysis

Genetic markers that distinguish fungal genotypes are important tools for genetic analysis of heterokaryosis and parasexual recombination in fungi. Random amplified polymorphic DNA (RAPD) markers that distinguish two races of biotype B of Colletotrichum gloeosporioides infecting the legume Stylosanthes guianensis were sought. Eighty-five arbitrary oligonucleotide primers were used to generate 895 RAPD bands but only two bands were found to be specifically amplified from DNA of the race 3 isolate. These two RAPD bands were used as DNA probes and hybridised only to DNA of the race 3 isolate. Both RAPD bands hybridised to a dispensable 1.2 Mb chromosome of the race 3 isolate. No other genotype-specific chromosomes or DNA sequences were identified in either the race 2 or race 3 isolates. The RAPD markers hybridised to a 2 Mb chromosome in all races of the genetically distinct biotype A pathogen which infects other species of Stylosanthes as well as S. guianensis. The experiments indicate that RAPD analysis is a potentially useful tool for obtaining genotype-and chromosome-specific DNA probes in closely related isolates of one biotype of this fungal pathogen.

Transfer of a supernumerary chromosome between vegetatively incompatible biotypes of the fungus Colletotrichum gloeosporioides

Two biotypes (A and B) of Colletotrichum gloeosporioides infect the tropical legumes Stylosanthes spp. in Australia. These biotypes are asexual and vegetatively incompatible. However, field isolates of biotype B carrying a supernumerary 2-Mb chromosome, thought to originate from biotype A, have been reported previously. We tested the hypothesis that the 2-Mb chromosome could be transferred from biotype A to biotype B under laboratory conditions. Selectable marker genes conferring resistance to hygromycin and phleomycin were introduced into isolates of biotypes A and B, respectively. A transformant of biotype A, with the hygromycin resistance gene integrated on the 2-Mb chromosome, was cocultivated with phleomycin-resistant transformants of biotype B. Double antibiotic-resistant colonies were obtained from conidia of these mixed cultures at a frequency of approximately 10(-7). Molecular analysis using RFLPs, RAPDs, and electrophoretic karyotypes showed that these colonies contained the 2-Mb chromosome in a biotype B genetic background. In contrast, no double antibiotic colonies developed from conidia obtained from mixed cultures of phleomycin-resistant transformants of biotype B with biotype A transformants carrying the hygromycin resistance gene integrated in chromosomes >2 Mb in size. The results demonstrated that the 2-Mb chromosome was selectively transferred from biotype A to biotype B. The horizontal transfer of specific chromosomes across vegetative incompatibility barriers may explain the origin of supernumerary chromosomes in fungi.

Transfer of an autonomously replicating vector between vegetatively incompatible biotypes of Colletotrichum gloeosporioides

Previous research has indicated that biotypes A and B of Colletotrichum gloeosporioides that infect Stylosanthes spp. in Australia are asexual and vegetatively incompatible. Selectable marker genes conferring resistance either to hygromycin or phleomycin were introduced into isolates of these biotypes. Vectors conferring resistance to hygromycin and carrying telomeric sequences from Fusarium oxysporum replicated autonomously in C. gloeosporioides and gave frequencies of transformation 100-times higher than vectors that integrated into the genome. Monoconidial colonies resistant to both antibiotics were recovered when hygromycin-resistant biotype-A transformants carrying an autonomously replicating vector were paired in culture with a phleomycin-resistant biotype-B transformant carrying integrative vector sequences. Molecular analysis of double antibiotic-resistant progeny indicated that they contained the autonomous vector in a biotype-B genetic background, Results indicate that transfer of the autonomous vector had occurred from biotype A to biotype B, demonstrating the potential for transfer of genetic information between these biotypes.

Diversidade e prospecção de fungos endofíticos de Begonia spp. encontradas na Mata Atlântica

Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior (CAPES)

Antimicrobial activity of wax and hexane extracts from Citrus spp. peels

Antibacterial and antifungal properties of wax and hexane extracts of Citrus spp. peels were tested using bioautographic and microdilution techniques against three plant pathogenic fungi (Penicillium digitatum, Curvularia sp., and Colletotrichum sp.), two human pathogens (Trichophyton mentagrophytes and Microsporum canis), and two opportunistic bacteria (Escherichia coli and Staphylococcus aureus). Two polymethoxylated flavonoids and a coumarin derivative, were isolated and identified from peel extracts, which presented antimicrobial activity especially against M. canis and T. mentagrophytes: 4',5,6,7,8-pentamethoxyflavone (tangeritin) and 3',4',5,6,7,8-hexamethoxyflavone (nobiletin) from C. reticulata; and 6,7-dimethoxycoumarin (also known as escoparone, scoparone or scoparin) from C. limon.

Relação entre número de estegmata na epiderme foliar e intensidade da antracnose em Stylosanthes spp

O objetivo deste trabalho foi quantificar o número de estegmata em cinco espécies de Stylosanthes e relacioná-lo à severidade da antracnose. Quantificaram-se os estegmata em secções foliares paradérmicas, coradas com safranina a 1%. A antracnose foi avaliada no 12º dia, depois da inoculação de Colletotrichum gloeosporioides. As espécies apresentaram número semelhante de estegmata na epiderme foliar, à exceção de S. guianensis, que apresentou menor quantidade. Maior severidade da antracnose foi observada em S. macrocephala e, em seguida, em S. capitata. Não foi constatada correlação significativa entre número de estegmata na epiderme foliar e a severidade da doença.

Promoção de crescimento e indução de resistência à antracnose por Trichoderma spp. em pepineiro

O objetivo deste trabalho foi determinar o efeito de 60 isolados de Trichoderma e do produto Trichodermil na promoção do crescimento e na indução de resistência sistêmica à antracnose, causada por Colletotrichum lagenarium em pepineiro, além de identificar as espécies dos isolados de Trichoderma spp. efetivas como indutores de resistência. Nos experimentos de promoção de crescimento, os isolados de Trichoderma spp. foram submetidos à inoculação no substrato e, após 21 dias, a massa de matéria seca da parte aérea das plantas foi mensurada. Nos experimentos de indução de resistência, os isolados que promoveram crescimento foram introduzidos no substrato, na base das plantas, sete dias antes da inoculação de C. lagenarium nas folhas. O isolado que apresentou melhor desempenho foi avaliado quanto à redução dos sintomas de antracnose, em aplicações aos 3, 7 ou 14 dias antes da inoculação do patógeno, e quanto à capacidade de aumentar a atividade de peroxidase. Dezenove isolados e o Trichodermil promoveram o crescimento de pepineiro em até 100% e conferiram proteção à antracnose em até 88,39%. O isolado IB 31/06 reduziu a severidade da doença nos intervalos de tempo avaliados. Não foi observado aumento significativo de peroxidase, sete dias após o tratamento com IB 31/06, nas plantas tratadas e infectadas com o patógeno, em comparação às plantas infectadas. O sequenciamento gênico dos dezenove isolados permitiu a identificação de sete espécies distintas de Trichoderma.

Promoção do crescimento do feijoeiro e controle da antracnose por Trichoderma spp

O objetivo deste trabalho foi avaliar a capacidade de Trichoderma spp. em promover o crescimento de plantas de feijão e reduzir a severidade da antracnose do feijoeiro (Colletotrichum lindemuthianum), bem como identificar os isolados mais eficientes. Sessenta isolados de Trichoderma spp. foram avaliados quanto à capacidade de promoção do crescimento nas plantas. Os sete isolados que mais se destacaram foram adicionados ao substrato de cultivo e avaliados quanto à redução na severidade da antracnose em plantas de feijão tratadas com conídios de C. lindemuthianum. Os mais eficientes no controle da doença foram identificados por sequenciamento de DNA. O isolado IB 28/07 foi avaliado nas concentrações 0,5, 1, 1,5 e 2% (peso:volume), que reduziram a severidade da doença em 41,51, 55,15, 81,82 e 96,06%, respectivamente. Os isolados mais eficientes de Trichoderma spp. podem proporcionar aumentos superiores a 30% na produção de matéria seca da parte aérea das plantas e reduzir a severidade da doença entre 63 e 98%. Esses isolados foram identificados como pertencentes às espécies Trichoderma harzianum, T. strigosum e T. theobromicola.

Controle alternativo de Colletotrichum acutatum agente causal da queda prematura dos frutos cítricos

A queda prematura dos frutos cítricos (QPFC), causada por Colletotrichum acutatum, dados os grandes prejuízos que têm causado aos produtores, constitui-se numa doença de grande importância econômica. O controle da doença é feito predominantemente mediante uso de fungicidas, que eleva o custo de produção e afeta negativamente o meio ambiente. Diante disso, este trabalho teve por objetivo buscar um método alternativo de controle da QPFC, mediante o uso de agentes de biocontrole ou de biofertilizantes. Diferentes concentrações de biofertilizantes (originários de duas fontes distintas e denominados de Bio1 e Bio 2); três isolados de Bacillus subtilis (ACB-69; 72 e 77) e três isolados de Trichoderma spp. (ACB-14; 37 e 39) foram testados, isoladamente ou em combinação, sob condições de laboratório, quanto à capacidade inibitória da germinação de conídios de C. acutatum. Estudaram-se, ainda, a produção de metabólitos termoestáveis por B. subtilis e o efeito sobre a germinação do patógeno. Quinze isolados de B. subtilis foram testados quanto à capacidade de prevenir a infecção por C. acutatum em flores destacadas de lima- ácida 'Tahiti' e, no campo, foram instalados dois experimentos, visando a testar ACBs e biofertilizantes no controle da doença. Verificou-se que o isolado ACB-72 (B. subtilis) e ACB-37 (T. pseudokoningii) foram os que mais inibiram a germinação do patógeno. Quanto à produção de metabólitos termoestáveis, ACB-69 e 77 foram os mais eficientes em produzir substâncias antifúngicas, e em quantidades suficientes para inibirem a germinação do patógeno. A mistura dos quatro isolados de Bacillus (ACBs: 69; 72; 77 e AP3) foi o que apresentou maior porcentagem de inibição (73%). Os biofertilizantes (Bio1 e Bio2), em concentrações acima de 10% e, quando em associação com isolados de Trichoderma spp., promoveram maiores inibições na germinação de C. acutatum. Em testes com flores destacadas, verificou-se que, onde foram aplicados os ACBs 69; 76; 74 e 77, as porcentagens de pétalas sem sintomas de infecção por C. acutatum foram de 83; 92; 92 e 97%, respectivamente. Mediante avaliações a campo, verificou-se a potencialidade de B. subtilis e de biofertilizantes em controlar a doença.

Controle biológico de Colletotrichum acutatum, agente causal da queda prematura dos frutos cítricos

O trabalho teve por finalidade estudar a potencialidade antagonística de isolados de Bacillus subtilis a Colletotrichum acutatum, agente causal da queda prematura dos frutos cítricos (Citrus spp.) (QPFC), sob condições de laboratório e de campo. Foram estudados 64 isolados de B. subtilis, quatro isolados de Bacillus spp. e um isolado de B. thuringiensis quanto à capacidade de inibir o desenvolvimento do patógeno em cultura pareada e quanto à produção de metabólitos com atividade antimicrobiana. Os isolados mais promissores foram testados em condições de campo para controle da doença. In vitro, todos os isolados de Bacillus spp. inibiram o crescimento de C. acutatum, não havendo diferenças significativas entre eles. Os isolados de Bacillus spp. produziram, in vitro, metabólitos capazes de inibir o crescimento micelial de C. acutatum, os quais mantiveram suas atividades capazes de causar a inibição, após autoclavagem a 120 ºC, durante 20 min. Dentre os sete isolados de B. subtilis testados para o controle da QPFC, em condições naturais, o ACB-69 diferiu da testemunha e de vários outros isolados, porém equiparou-se estatisticamente ao benomyl, proporcionando menor porcentagem de flores com sintomas e maior número médio de frutos efetivos. Ainda, sob condições de campo, isolados de cada uma das espécies Trichoderma viride, T. pseudokoningii e T. aureoviride foram ineficientes, apresentando o mesmo comportamento da testemunha. Em relação aos métodos de avaliação da doença, a porcentagem de flores com sintomas foi mais eficiente do que o número médio de frutos efetivos (NMFE), uma vez que esses resultam do efeito direto do patógeno.

Caracterização fisiomorfológica de isolados de Colletotrichum musae

Isolados de Colletotrichum musae obtidos de quatro cultivares de banana (Musa spp.) 'Comprida', 'Maçã', 'Pacovan' e 'Prata' foram estudados quanto ao aspecto morfológico dos conídios, apressórios, características culturais, diâmetro das colônias em meio BDA, germinação dos conídios em água destilada esterilizada e meio líquido BD, como também, quanto ao efeito da combinação de C/N no crescimento micelial, esporulação e peso da matéria seca, sob alternância luminosa, a aproximadamente, 25 ºC. No estudo da relação C/N, as fontes de carbono foram dextrose, sacarose e sorbitol e as de nitrogênio asparagina, peptona e nitrato de potássio combinadas na proporção 10:1 (10 g de carbono para 1 g de nitrogênio). Os resultados mostraram conídios hialinos, com forma e tamanhos característicos da espécie, variando dentro dos limites estabelecidos para a espécie. A relação comprimento/largura foi menor para os isolados Iso-1, Iso-6 e Iso-8 oriundos de banana 'Comprida'. A germinação de conídios ocorreu a partir de 8 h de incubação, havendo diferença significativa entre os isolados, quanto ao percentual de conídios germinados. Foram observados apressórios em todos os isolados, variando em quantidade. Houve diversidade nas características culturais e diâmetro das colônias dos isolados, em BDA. Com relação às combinações C/N, a análise estatística revelou diferença significativa entre os isolados, sob efeito da interação C/N, bem como dos fatores independentes, sobre o crescimento micelial, produção de esporos e peso seco do micélio. De um modo geral, as combinações de carbono com peptona favoreceram esses três processos fisiológicos, porém com diferença significativa entre os isolados de C. musae dentro de cada processo considerado.

Efeito de Colletotrichum dematium var. truncata e Phomopsis sojae na qualidade sanitária e fisiológica de sementes de soja

Tem sido atribuído a vários patógenos reduções na qualidade de sementes de soja. Com o objetivo de avaliar o transporte dos fungos pelas sementes provenientes de plantas de soja, artificialmente inoculadas em condições de campo com dois isolados de Colletotrichum dematium var. truncata e um isolado de Phomopsis sojae, e seu efeito sobre a qualidade sanitária e fisiológica das mesmas, quatro variedades de soja (BRS 133, MSoy 6101, Conquista e Liderança) foram manualmente semeadas no campo, e as plantas obtidas foram inoculadas com C. dematium var. truncata isolado 1 e isolado 2, e P. sojae. A testemunha permaneceu sem inoculação. As sementes foram colhidas manualmente e submetidas a testes para avaliação da sanidade, teor de água, peso de 100 sementes, germinação em papel e emergência em areia. A desinfestação das sementes com hipoclorito de sódio a 1% por 3 minutos diminuiu a incidência dos patógenos nas mesmas. As sementes apresentaram uma alta infecção por Fusarium spp.. Phomopsis sojae foi encontrada em todos os tratamentos, e sua incidência nas sementes esteve relacionada com a incidência de Fusarium sp.. Há diferença na patogenicidade entre isolados de C. dematium var. truncata, sendo o isolado 1 o mais patogênico, com destaque para a variedade Liderança (25% de infecção por C. dematium var. truncata). Fusarium sp. influenciou negativamente a germinação de sementes da variedade MSoy 6101, independente do tratamento, e C. dematium var. truncata afetou negativamente a germinação das sementes das variedades Conquista e Liderança. Os valores de emergência em areia apresentaram-se significativamente superiores à germinação em papel, para as variedades MSoy 6101, Conquista e Liderança.