Purification and Properties of Closteroviruslike Particles Associated with Grapevine Corky Bark Disease

Closteroviruslike particles, designated as grapevine corky bark-associated virus (GCBaV), were purified from mature leaves and stem phloem tissue of a corky bark-affected grapevine that had indexed negative for other grapevine viruses. Electron microscopy of purified preparations revealed the presence of flexuous rod-shaped viruslike particles that were about 13 nm in diameter and between 1,400 and 2,000 nm long, with a helical pitch of 3.4 nm. In purified preparations, the GCBaV particles degraded within a few weeks, unlike grapevine leafroll associated virus (GLRaV), which was stable for more than 1 mo under the same storage condition. The molecular weight of the coat protein of GCBaV was 24,000. A large dsRNA molecule (about 15.3 kbp), along with lower molecular weight species, was detected in tissues of corky bark-diseased grapevines, but not in healthy grapevines. Polyclonal antisera were produced in rabbits against purified or partially purified virus preparations. In direct enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA), antisera to GCBaV did not react to the serologically distinct types (II and III) of the long closteroviruses associated with grapevine leafroll disease and grapevine virus A (GVA), and vice versa. This antiserum also reacted in ELISA with other corky bark-affected grapevines. Our data suggest that closteroviruslike particles, designated as GCBaV, may be the causal agent of corky bark disease. However, definitive proof is still lacking. The inclusion of GCBaV in the group of closteroviruses with citrus tristeza virus is proposed.

Development of salinity tolerance in rice by constitutive-overexpression of genes involved in the regulation of programmed cell death

Environmental factors contribute to over 70% of crop yield losses worldwide. Of these drought and salinity are the most significant causes of crop yield reduction. Rice is an important staple crop that feeds more than half of the world’s population. However among the agronomically important cereals rice is the most sensitive to salinity. In the present study we show that exogenous expression of anti-apoptotic genes from diverse origins, AtBAG4 (Arabidopsis), Hsp70 (Citrus tristeza virus) and p35 (Baculovirus), significantly improves salinity tolerance in rice at the whole plant level. Physiological, biochemical and agronomical analyses of transgenic rice expressing each of the anti-apoptotic genes subjected to salinity treatment demonstrated traits associated with tolerant varieties including, improved photosynthesis, membrane integrity, ion and ROS maintenance systems, growth rate, and yield components. Moreover, FTIR analysis showed that the chemical composition of salinity-treated transgenic plants is reminiscent of non-treated, unstressed controls. In contrast, wild type and vector control plants displayed hallmark features of stress, including pectin degradation upon subjection to salinity treatment. Interestingly, despite their diverse origins, transgenic plants expressing the anti-apoptotic genes assessed in this study displayed similar physiological and biochemical characteristics during salinity treatment thus providing further evidence that cell death pathways are conserved across broad evolutionary kingdoms. Our results reveal that anti-apoptotic genes facilitate maintenance of metabolic activity at the whole plant level to create favorable conditions for cellular survival. It is these conditions that are crucial and conducive to the plants ability to tolerate/adapt to extreme environments.

Filodinâmica do vírus da tristeza dos citrinos: epidemiologia molecular e biologia evolutiva

O Citrus tristeza virus (CTV), responsável por várias doenças em citrinos, é um dos maiores condicionantes da citricultura a nível mundial. Existem diversos isolados de CTV com diferentes características biológicas e moleculares, sendo que os sintomas causados pelo vírus dependem essencialmente do isolado viral e da combinação variedade/porta-enxerto. A implementação de medidas de controlo da doença depende, em grande parte, do tipo de isolados presentes numa dada região. No Capítulo 2, efetuou-se uma análise comparativa entre dois métodos de tipificação de isolados de CTV e verificou-se que a caracterização por PCR assimétrico-ELISA, que considera a existência de sete grupos, é mais adequada à descrição da estrutura genética de CTV. Estes resultados foram complementados com o estudo da dinâmica de colonização de cada grupo filogenético através de um imuno-ensaio in situ (Capítulo 3). Os resultados obtidos sugerem que os isolados de CTV diferem na quantidade de células infetadas e que essa diferença parece estar relacionada com a severidade do isolado. No Capítulo 4, o estudo da variabilidade genómica da região 3’ terminal permitiu verificar que a estrutura de grupos obtida para o gene da proteína da cápside (CP) é extensível a toda a região 3’ terminal que contém os genes mais fortemente implicados na interação com o hospedeiro. A estabilidade da estrutura genética nesta região foi também inferida a partir da pesquisa de eventos de recombinação. Os resultados sugerem uma baixa frequência de recombinação entre isolados de CTV, mesmo em isolados contendo mistura de haplótipos e mantidos há mais de 12 anos no mesmo hospedeiro. Adicionalmente, foi estimada a taxa de evolução de CTV através de um método estatístico Bayesiano (Capítulo 5). Para tal, foram usadas sequências do gene da CP de isolados de diversas regiões do mundo, pertencentes a diferentes grupos filogenéticos e obtidas entre 1990 e 2010. A taxa média de evolução estimada foi de 1,58 X 10-4 substituições nucleotídicas / ano. No geral, os resultados destes dois capítulos mostram que os isolados de CTV mantêm uma elevada estabilidade genética ao longo do tempo. Finalmente, no Capítulo 6, foi estudada a situação epidemiológica de CTV em Portugal continental a partir de isolados de CTV recolhidos no campo, onde se verificou que a maioria das árvores infetadas era composta por isolados de CTV pertencentes ao grupo M, ou seja isolados considerados suaves e que não provocam sintomas severos.

Dimensionamento de amostras para monitoramento do ácaro da leprose Brevipalpus phoenicis (Geijskes, 1939) em citros

O controle do ácaro Brevipalpus phoenicis (Geijskes, 1939), transmissor do vírus da leprose, deve ser realizado quando sua população atinge o nível de ação, obtido pelo monitoramento de sua população, por meio de amostragens. Objetivou-se determinar o tamanho da amostra aceitável para estimar a população do ácaro, para posterior tomada de decisão. O experimento foi realizado na Fazenda Cambuhy, Matão - SP, no ano agrícola 2003-2004. Escolheu-se ao acaso um talhão da variedade Valência, com oito anos de idade, plantada no espaçamento 7x3,5m, com 2.480 plantas. Nesse talhão, foram inspecionados 1; 2; 3; 5; 10 e 100% das plantas, o que corresponde a 25; 50; 74; 124; 248 e 2.480 plantas, respectivamente, em caminhamento no sentido das linhas de plantio. Foram amostrados 3 frutos ou, na ausência destes, eram analisados ramos. de acordo com os resultados obtidos, observa-se que a porcentagem de erro na estimativa da média para a porcentagem de frutos com presença de ácaros, quando se amostra apenas 1% das plantas (25 plantas), é de 50%, ou seja, para uma infestação de 10%, a variação da porcentagem de frutos infestados estaria entre 5 e 15%, levando o produtor a subestimar ou a superestimar o nível de infestação, aumentando os gastos com pulverizações desnecessárias ou um controle ineficiente do ácaro. Para que o erro na amostragem fique dentro da situação aceitável, de 20 a 30% (em média 25%) de erro, deveriam ser amostradas 105 plantas. Na porcentagem de frutos com mais de 10 ácaros, verifica-se que, para a situação aceitável (20 a 30%), devem ser inspecionadas 540 plantas.

Resíduos de calda sulfocálcica sobre a eficiência de acaricidas no controle de Brevipalpus phoenicis

O objetivo do trabalho foi verificar a influência dos resíduos de calda sulfocálcica sobre a eficiência de acaricidas empregados no controle de Brevipalpus phoenicis. Inicialmente, o experimento foi instalado em um pomar de citros, em que foram selecionadas 10 plantas que continham frutos com verrugose. Realizou-se a aplicação de calda sulfocálcica (8g i.a. L-1 de água) em cinco plantas e as outras cinco plantas permaneceram sem aplicação de produto fitossanitário. Protegeram-se, com copos de plástico transparente de 500mL, 64 frutos nas plantas tratadas com calda e 64 frutos nas plantas não-tratadas, totalizando 128 frutos protegidos. Decorridos 30 dias da aplicação, os frutos foram colhidos e levados para o laboratório. Estes frutos foram parcialmente parafinados, deixando-se em cada fruto uma arena de 2,5cm de diâmetro com verrugose e sem parafina, delimitada com cola entomológica. em seguida, procedeu-se à aplicação sobre os frutos em Torre de Potter dos seguintes acaricidas nas concentrações expressas em mg de ingrediente ativo por litro de água: propargite a 720mg, óxido de fenbutatina a 400mg, cyhexatin a 250mg, azocyclotin a 250mg, fenpyroximate a 50mg, dicofol a 960mg e dinocap a 738mg e a testemunha sem aplicação de acaricida. Após 1, 7 e 16 dias da aplicação, transferiram-se para cada fruto 10 ácaros B. phoenicis para avaliar a mortalidade. Constatou-se que os resíduos de calda sulfocálcica não prejudicaram a eficiência dos acaricidas avaliados no controle de B. phoenicis.

Efeito da adição de óleos mineral e vegetal a acaricidas no controle do ácaro-da-leprose dos citros Brevipalpus phoenicis (Geijskes) (Acari: Tenuipalpide)

Com a finalidade de esclarecer os efeitos da adição de óleo vegetal e mineral aos acaricidas foi conduzido um ensaio de campo em 1994 no município de Viradouro, SP, utilizando-se de Assist, Triona e Natur'l Óleo, na dosagem de 500 mL por 100 litros de água, adicionados aos acaricidas: pyridaben nas formulações 200 CE e 750 PM, nas dosagens de 75 mL e 20 g; propargite 720 CE a 100 mL; óxido de fenbutatina 500 SC a 80 mL e cyhexatin 500 PM a 50 g. O delineamento estatístico adotado foi o de blocos casualizados. As aplicações foram feitas com pulverizador tipo pistola. Após a preparação da calda, foi determinado o pH. Empregou-se máquina de varredura e microscópio estereoscópico para as avaliações da população acarina. A adição de Natur'l Óleo pode afetar negativamente a eficiência do pyridaben 200 CE e 750 PM e cyhexatin 500 PM, no controle do ácaro-da-leprose. Triona e Assist não afetaram as eficiências dos acaricidas testados. Pelo índice de iodo, mediu-se o grau de insaturação das misturas dos acaricidas com Natur'l Óleo, concluindo-se que houve incorporação das moléculas dos acaricidas pelas ligações insaturadas do óleo; porém, isto não explica o diferente comportamento dos produtos no controle do ácaro da leprose dos citros.

Efeito da adição de óleos ao acaricida cyhexatin sobre o ácaro Brevipalpus phoenicis e na retenção de calda por folhas de citros

A adição de óleos à calda de pulverização, muitas vezes, é utilizada a campo sem o adequado conhecimento sobre a absorção do produto fitossanitário pelo alvo, retenção de calda e até mesmo sobre a praga e a cultura. O objetivo do trabalho foi avaliar o efeito da adição de óleos ao acaricida cyhexatin sobre o ácaro Brevipalpus phoenicis e na retenção de calda por folhas de citros. Avaliou-se a mortalidade de ácaros, utilizando-se de frutos de laranja com uma arena circundada com cola entomológica para confinar os ácaros. Adotou-se o delineamento inteiramente casualizado, em esquema fatorial, constituído pelos fatores: duas formulações de cyhexatin (WG e SC), dois tipos de óleo (mineral e vegetal) e duas concentrações dos óleos (0,5 e 1,0%), e mais dois tratamentos adicionais (acaricidas não adicionados de óleo) e uma testemunha sem aplicação. A aplicação dos produtos foi realizada sobre frutos de laranja até além do ponto de escorrimento. Logo após a aplicação, transferiram-se 10 ácaros B. phoenicis para cada fruto.A contagem dos ácaros vivos, mortos e retidos na barreira adesiva foi realizada um dia após a aplicação. Para a determinação da quantidade de calda retida, utilizaram-se folhas de laranjeira, que foram pulverizadas até além do ponto de escorrimento, adotando-se os mesmos tratamentos e o delineamento estatístico mencionados para a avaliação da mortalidade de ácaros, com exceção da testemunha sem aplicação. Determinou-se a massa de líquido retido após a aplicação dos produtos por folha, com auxílio de balança de precisão. Verificou-se que um dia após a aplicação dos produtos, todos os tratamentos apresentaram mortalidade de B. phoenicis acima de 99%. Dessa forma, a adição de óleo, seja mineral, seja vegetal, ao acaricida cyhexatin não afetou a eficácia biológica deste acaricida nas formulações SC e WG. A maior fuga de B. phoenicis para a barreira de cola foi verificada nos tratamentos com adição de óleos, em comparação ao cyhexatin aplicado isoladamente. A adição de óleo, seja mineral, seja vegetal, ao cyhexatin na calda de pulverização reduziu a quantidade máxima de líquido retido pelas folhas de citros, podendo contribuir para a redução da quantidade de calda necessária para uma boa cobertura da planta.

Influência da dureza e potencial hidrogeniônico da calda de pulverização sobre o controle do ácaro-da-leprose em frutos de laranja doce

Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e Tecnológico (CNPq)

Ontogênese de caneluras em pedúnculo de flores de laranjeira doce infectados pelo vírus da tristeza dos citros estirpe Capão Bonito

Um estudo da ontogênese das caneluras induzidas em ramos de laranjeiras doces suscetíveis por isolados severos do vírus da tristeza dos citros (Citrus tristeza vírus - CTV) foi feito usando-se como modelo pedúnculos florais e de frutos. O menor calibre destes órgãos permite um melhor acompanhamento do processo. As observações foram feitas em laranjeira cv. Pêra infetada pelo isolado severo Capão Bonito do CTV. Cinco fases do processo de formação de caneluras puderam ser deduzidas pelas análises anatômicas. As primeiras alterações são representadas pelo aparecimento de células adensadas, hipertrofia e hiperplasia no parênquima e câmbio do floema e uma desorganização generalizada desta área. Segue-se uma atividade intensa do câmbio do floema adjacente e sua expansão em direção ao xilema. Esta invasão do xilema resulta na ruptura do anel do xilema pela massa celular do floema constituída de células recém formadas de parede celular delgada. Esta invasão do floema em direção ao xilema inicia um processo de degeneração dos vasos e parênquima do xilema. Finalmente há um colapso completo da região do xilema invadida, que é substituída pela massa do floema, resultando na canelura, notada ao se remover a casca.

Efeito de espalhante-adesivo na eficiência dos acaricidas propargite e cyhexatin no controle do Brevipalpus phoenicis (Geijskes) (Acari: Tenuipalpidae) em citros

Embora espalhantes-adesivos sejam considerados importantes em pulverizações, existem dúvidas quanto à sua utilidade em pulverizações a alto volume quando o escorrimento é maior, como nas aplicações com equipamentos tipo pistola, para o controle de Brevipalpus phoenicis (Geijskes). Dois ensaios de campo foram conduzidos, em 1991 e 1994, em pomar de citros cv. Natal. As pulverizações foram realizadas com pulverizador tratorizado equipado com pistolas de alta pressão usando 18 l e 11 l de calda/planta, respectivamente. Efeitos dos espalhante-adesivo foi avaliado contando-se o número de ácaros antes e após a aplicação. Não se verificaram diferenças sensíveis na retenção do líquido pulverizado nas folhas de citros quando se adicionou o espalhante-adesivo à calda com propargite. Redução de até 95,6% na população do ácaro foi obsevada com o aumento na dosagem do propargite e de até 98,9% em relação de menor dosagem para o cyhexatin. Constatou-se que o espalhante-adesivo não melhorou a eficiência do cyhexatin, embora a somatória dos totais de ácaros, independentemente da dosagem e da formulação, tenha sido 50,1% menor com o uso de espalhante-adesivo.

Efeito de diferentes volumes de calda no controle do ácaro-da-leprose Brevipalpus phoenicis (Geijskes) em citros

Estudou-se o efeito de diferentes volumes de calda no controle do ácaro-da-leprose, Brevipalpus phoenicis (Geijskes), na cultura de citros (Citrus sinensis), em dois ensaios de campo, instalados em 1992 e 1993. Os ensaios foram delineados em blocos casualizados. Utilizou-se do óxido de fenbutatina (Torque 500 SC) a 0,01, 0,02, 0,04 e 0,08% de i.a., aplicado à razão de 5, 10, 20 e 40 litros de calda por planta. Os ácaros foram contados previamente e após a aplicação, amostrando-se 10 frutos/planta. Efetuou-se a retirada dos ácaros, com máquina de varredura, e as contagens com auxílio de microscópio estereoscópico. Concluiu-se que o óxido de fenbutatina independentemente das concentrações e volumes de calda, apresentou alta eficiência no controle do ácaro da leprose com reduções no número de ácaros durante o período do ensaio que variaram de 88,2 a 100% até 63 dias da aplicação (ensaio 1) e 75,4 a 100% até 123 dias (ensaio 2). A eficiência dependeu mais do volume do que da concentração, uma vez que, quanto maior o volume da calda, maior a redução da população. Aplicação de 40 l da calda/planta causou reduções médias de 99,3% e 96,7%, independente da concentração.

Aspectos técnicos e econômicos da poda e do controle químico de Brevipalpus phoenicis no manejo da leprose dos citros

The objective of this study was to evaluate different citrus leprosis management tactics during seven seasons, based in pruning and acaricide applications, considering technical and economic aspects of each tactic. The trial was conducted from October 2003 to August 2010 in an orange plantation of Pera cv. located in the municipality of Reginópolis-SP, Brazil. The plants of citrus used were12 years old and grafted onto Cleopatra tangerine. The experimental design used was randomized blocks, in a factorial scheme, made up of factors type of pruning (A), with six levels: (1) drastic pruning, (2) intermediate pruning without leprosis lesions, (3) intermediate pruning with leprosis lesions (4) light pruning, (5) without pruning and (6) replant; acaricide applications factor (B), with three levels: (1) without acaricides applications, (2) with lime sulfur applications and (3) spirodiclofen or cyhexatin applied in rotation; pruning factor to remove leprosis symptomatic branches (C), with two levels: (1) with pruning for removal, (2) without removal pruning. The combination of factors, with respective levels (6 x 3 x 2), resulted in 36 treatments that were repeated four times, with each parcel being made up of three plants in a row. After seven years, it was observed that the types of the pruning and remove of leprosis symptomatic branches used as single management tactic, is not sufficient to leprosis control. Therefore, the results demonstrated that for leprosis management, it is essential the association between tactics, especially the control mite vector. For ensuring the citrus production economically, the use of acaricides highly efficient is essential in B. phoenicis control. The recommendation of the type of pruning should be in function of the leprosis incidence and severity in the orchard. In orchards with low leprosis incidence and severity the light pruning is more appropriate, because it is efficient and ensures greater financial balance. However, in orchards with high leprosis incidence and severity it is indicated the severe pruning for reducing or eliminating inoculum source. Between the severe prunings, the intermediate pruning with leprosis lesions is the most relevant, because the financial return will be faster. Replant is indicated only for young orchards, because does not imply in changes onto cultural practices.

Atividade de acaricidas sobre o Ácaro-da-leprose, Brevipalpus phoenicis (Geijskes) (Acari: Tenuipalpidae) e sobre artrópodes benéficos na cultura dos citros

Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior (CAPES)

Interspecific interactions involving Neoseiulus californicus (Acari: Phytoseiidae) and Agistemus brasiliensis (Acari: Stigmaeidae) as predators of Brevipalpus phoenicis (Acari: Tenuipalpidae)

Fundação de Amparo à Pesquisa do Estado de São Paulo (FAPESP)

Efecto de patrones de cítricos tolerantes al virus tristeza de los cítricos en el contenido nutrimental en naranja valencia (Citrus sinensis. Osbeck)

Tesis (Maestría en Ciencias con Especialidad en Producción Agrícola) UANL