L’importance de la coopération de TRAF1 et LSP1 en aval du récepteur 4-1BB(CD137) pour la survie des lymphocytes

4-1BB (CD137) est un membre de la superfamille TNFR qui est impliqué dans la transmission des signaux de survie aux lymphocytes. TRAF1 est une protéine adaptatrice qui est recrutée par 4-1BB et autres TNFRs et est caractérisée par une expression très restreinte aux lymphocytes, cellules dendritiques et certaines cellules épithéliales. TRAF1 est nécessaire pour l’expansion et la survie des cellules T mémoire en présence d'agonistes anti-4-1BB in vivo. De plus, TRAF1 est requise en aval de 4-1BB pour activer (phosphoryler) la MAP kinase Erk impliquée dans la régulation de la molécule pro-apoptotique Bim. Suite à l’activation du récepteur 4-1BB, TRAF1 et ERK sont impliqués dans la phosphorylation de Bim et la modulation de son expression. L’activation et la régulation de TRAF1 et Bim ont un rôle important dans la survie des cellules T CD8 mémoires. Dans cette étude, nous avons utilisé une approche protéomique afin de pouvoir identifier de nouveaux partenaires de liaison de TRAF1. Utilisant cette stratégie, nous avons identifié que LSP1 (Leukocyte Specific Protein 1) est recruté dans le complexe de signalisation 4-1BB de manière TRAF1 dépendante. Une caractérisation plus poussée de l’interaction entre TRAF1 et LSP1 a montré que LSP1 lie la région unique N-terminal de TRAF1 de façon indépendante de la région conservée C-terminal. À l’instar des cellules T déficientes en TRAF1, les cellules T déficientes en LSP1 ne sont pas capables d’activer ERK en aval de 4-1BB et par conséquent ne peuvent pas réguler Bim. Ainsi, TRAF1 et LSP1 coopèrent en aval de 4-1BB dans le but d’activer ERK et réguler en aval les niveaux de Bim dans les cellules T CD8. Selon la littérature, le récepteur 4-1BB n’est pas exprimé à la surface des cellules B murines, mais le récepteur 4-1BB favorise la prolifération et la survie des cellules B humaines. Cependant, il est important d'étudier l'expression du récepteur 4-1BB dans les cellules B murines afin de disposer d'un modèle murin et de prédire la réponse clinique à la manipulation de 4-1BB. En utilisant différentes stimulations de cellules B murines primaires, nous avons identifié que le récepteur 4-1BB est exprimé à la surface des cellules B de souris suite à une stimulation avec le LPS (Lipopolysaccharides). Une caractérisation plus poussée a montré que le récepteur 4-1BB est induit dans les cellules B murines d'une manière dépendante de TLR4 (Toll Like Receptor 4). Collectivement, notre travail a démontré que la stimulation avec le LPS induit l’expression du récepteur 4-1BB à la surface des cellules B murines, menant ainsi à l'induction de TRAF1. De plus, TRAF1 et LSP1 coopèrent en aval de 4-1BB pour activer la signalisation de la Map kinase ERK dans les cellules B murines de manière similaire aux cellules T. Les cellules B déficientes en TRAF1 et les cellules B déficientes en LSP1 ne sont pas en mesure d'activer la voie ERK en aval de 4-1BB et montrent un niveau d’expression du récepteur significativement diminué comparé aux cellules B d’une souris WT. Ainsi, TRAF1 et LSP1 sont nécessaires pour une expression maximale du récepteur 4-1BB à la surface cellulaire de cellules B murines et coopèrent en aval de 4-1BB afin d'activer la cascade ERK dans les cellules B murines.

L’importance de la coopération de TRAF1 et LSP1 en aval du récepteur 4-1BB(CD137) pour la survie des lymphocytes

4-1BB (CD137) est un membre de la superfamille TNFR qui est impliqué dans la transmission des signaux de survie aux lymphocytes. TRAF1 est une protéine adaptatrice qui est recrutée par 4-1BB et autres TNFRs et est caractérisée par une expression très restreinte aux lymphocytes, cellules dendritiques et certaines cellules épithéliales. TRAF1 est nécessaire pour l’expansion et la survie des cellules T mémoire en présence d'agonistes anti-4-1BB in vivo. De plus, TRAF1 est requise en aval de 4-1BB pour activer (phosphoryler) la MAP kinase Erk impliquée dans la régulation de la molécule pro-apoptotique Bim. Suite à l’activation du récepteur 4-1BB, TRAF1 et ERK sont impliqués dans la phosphorylation de Bim et la modulation de son expression. L’activation et la régulation de TRAF1 et Bim ont un rôle important dans la survie des cellules T CD8 mémoires. Dans cette étude, nous avons utilisé une approche protéomique afin de pouvoir identifier de nouveaux partenaires de liaison de TRAF1. Utilisant cette stratégie, nous avons identifié que LSP1 (Leukocyte Specific Protein 1) est recruté dans le complexe de signalisation 4-1BB de manière TRAF1 dépendante. Une caractérisation plus poussée de l’interaction entre TRAF1 et LSP1 a montré que LSP1 lie la région unique N-terminal de TRAF1 de façon indépendante de la région conservée C-terminal. À l’instar des cellules T déficientes en TRAF1, les cellules T déficientes en LSP1 ne sont pas capables d’activer ERK en aval de 4-1BB et par conséquent ne peuvent pas réguler Bim. Ainsi, TRAF1 et LSP1 coopèrent en aval de 4-1BB dans le but d’activer ERK et réguler en aval les niveaux de Bim dans les cellules T CD8. Selon la littérature, le récepteur 4-1BB n’est pas exprimé à la surface des cellules B murines, mais le récepteur 4-1BB favorise la prolifération et la survie des cellules B humaines. Cependant, il est important d'étudier l'expression du récepteur 4-1BB dans les cellules B murines afin de disposer d'un modèle murin et de prédire la réponse clinique à la manipulation de 4-1BB. En utilisant différentes stimulations de cellules B murines primaires, nous avons identifié que le récepteur 4-1BB est exprimé à la surface des cellules B de souris suite à une stimulation avec le LPS (Lipopolysaccharides). Une caractérisation plus poussée a montré que le récepteur 4-1BB est induit dans les cellules B murines d'une manière dépendante de TLR4 (Toll Like Receptor 4). Collectivement, notre travail a démontré que la stimulation avec le LPS induit l’expression du récepteur 4-1BB à la surface des cellules B murines, menant ainsi à l'induction de TRAF1. De plus, TRAF1 et LSP1 coopèrent en aval de 4-1BB pour activer la signalisation de la Map kinase ERK dans les cellules B murines de manière similaire aux cellules T. Les cellules B déficientes en TRAF1 et les cellules B déficientes en LSP1 ne sont pas en mesure d'activer la voie ERK en aval de 4-1BB et montrent un niveau d’expression du récepteur significativement diminué comparé aux cellules B d’une souris WT. Ainsi, TRAF1 et LSP1 sont nécessaires pour une expression maximale du récepteur 4-1BB à la surface cellulaire de cellules B murines et coopèrent en aval de 4-1BB afin d'activer la cascade ERK dans les cellules B murines.

Caractérisation des inhibiteurs de DCIR, une lectine de type C participant à la transmission du VIH-1

Le virus de l’immunodéficience humaine de type 1 provoque une infection définitive de l’organisme. Il entraine une déroute du système immunitaire depuis la primo-infection occasionnant ainsi, une déplétion massive des lymphocytes T CD4 (LTCD4). Le DCIR (Dendritic Cell Immuno Receptor) qui constitue le socle de notre travail, est une lectine de type C. Il est exprimé sur les cellules myéloïdes comme les cellules dendritiques mais aussi sur les cellules B, les LTCD4 infectés par le VIH-1 et apoptotiques ainsi que sur les LTCD4 polarisés en Th17. Il constitue un facteur d’attachement et d’internalisation du virus dans la cellule dendritique. Il permet son transfert aux LTCD4 dans les organes lymphoïdes secondaires, jouant ainsi un rôle dans la pathogenèse associée au VIH-1. En plus, le DCIR assure la régulation négative de la réponse cellulaire, favorisant ainsi la propagation et la réplication du virus au détriment de la réponse immunitaire contre le VIH-1. Le rôle que joue le DCIR est dépendant du sentier de signalisation induit à la suite de la phosphorylation des résidus tyrosine de son motif ITIM. Le blocage de DCIR par des inhibiteurs spécifiques pourrait empêcher cette phosphorylation et réduire l’attachement, l’internalisation et le transfert du virus. Nous avons montré que la stimulation des cellules dendritiques et des LTCD4 polarisés en Th17 avec un anticorps anti-DCIR générait un patron de phosphorylation des résidus tyrosine des protéines. De plus, les inhibiteurs de la portion extracellulaire du DCIR inhibent cette activation. Afin de développer une mesure plus directe de l’interaction de DCIR avec ces inhibiteurs, nous avons purifié le DCIR à partir des cellules Raji-CD4-DCIR. En conclusion, ce projet de maitrise montre que l’activation directe de DCIR peut être renversée par des inhibiteurs montrant ainsi leurs spécificités. De plus, le profil d’activation de DCIR est spécifique pour chaque type cellulaire. A long terme, l’inactivation de DCIR par des inhibiteurs efficaces pourrait être une stratégie thérapeutique capable d’inhiber l’infection et de préserver une réponse immunitaire efficace.

Étude du rôle de l’auto-antigène nucléaire centromérique B (CENP-B) et des auto-anticorps anti-CENP-B dans l’activation des cellules musculaires lisses vasculaires : implication potentielle dans la pathophysiologie de la sclérose systémique

La sclérose systémique (ScS) est une maladie auto-immune dont l’un des principaux auto-anticorps, dirigé contre la protéine centromérique B (CENP-B), est fortement associé à l’hypertension artérielle pulmonaire, l’une des causes majeures de décès dû à la ScS. L’hypertension résulte de l’occlusion progressive des vaisseaux suite à une hyperactivation des cellules musculaires lisses (CML) de la paroi vasculaire. Cependant, les facteurs responsables de ce remodelage vasculaire restent inconnus. Plusieurs études récentes ont démontré que certains auto-antigènes possèdent des fonctions biologiques additionnelles lorsqu'ils se retrouvent dans le milieu extracellulaire. En effet, une fois libérés par nécrose ou apoptose, ces auto-antigènes adoptent une activité biologique qui s'apparente à celles des cytokines et peuvent ainsi participer aux processus normaux de réparation de blessure et/ou acquérir une activité pathogène qui contribue au développement de certaines maladies auto-immunes. Nos résultats suggèrent que la CENP-B peut être ajoutée à cette liste de molécules bifonctionnelles. À l'aide des techniques d'immunofluorescence, d'ELISA cellulaire et de cytométrie en flux, nous avons démontré que la CENP-B se liait spécifiquement à la surface des CML vasculaire de l’artère pulmonaire avec une plus grande affinité pour le phénotype contractile que synthétique. Cette liaison provoquait la migration des cellules ainsi que la sécrétion de cytokines pro-inflammatoires telles que l’interleukine 6 et 8. Les mécanismes par lesquels la protéine exerçait ces effets impliquaient la phosphorylation de FAK et Src ainsi que la voie des MAP kinases, avec ERK1/2 et p38. Des études de signalisation intracellulaire effectuées à l’aide de plusieurs inhibiteurs spécifiques ainsi que des études de désensibilisation nous ont permis d’identifier le récepteur de la CENP-B en plus d’identifier les mécanismes complets de sa signalisation membranaire. Nous avons démontré que la CENP-B se liait de manière spécifique aux CML vasculaire via le récepteur de chémokine 3 (CCR3) pour ensuite transactiver le récepteur EGF, selon un mécanisme métalloprotéase-dépendant qui implique le relargage du HB-EGF. Cette transactivation est un processus important dans l’activation de la voie des MAP kinases ainsi que dans la sécrétion d’IL-8 induite par la CENP-B. Finalement, nous avons démontré que les auto-anticorps anti-CENP-B pouvaient abolir cette cascade de signalisation, empêchant ainsi la CENP-B d’exercer son rôle de cytokine. L’identification de la CENP-B comme ligand du CCR3 ouvre donc plusieurs perspectives quant à l’étude du rôle pathogène des auto-anticorps anti-CENP-B dans la ScS.

Contrôle de la réponse immunitaire par l’indoleamine 2,3-dioxygénase : étude de la régulation d’une molécule immuno-suppressive dans les cellules cancéreuses et les lymphocytes B chez l’humain

Le système immunitaire se doit d’être étroitement régulé afin d’éviter que des réponses immunologiques inappropriées ou de trop forte intensité ne surviennent. Ainsi, différents mécanismes permettent de maintenir une tolérance périphérique, mais aussi d’atténuer la réponse lorsque celle-ci n’est plus nécessaire. De tels mécanismes sont cependant aussi exploités par les tumeurs, qui peuvent ainsi échapper à une attaque par le système immunitaire et donc poursuivre leur progression. Ces mécanismes immunosuppresseurs nuisent non seulement à la réponse naturelle contre les cellules tumorales, mais font aussi obstacle aux tentatives de manipulation clinique de l’immunité visant à générer une réponse anti-tumorale par l’immunothérapie. L’un des mécanismes par lesquels les tumeurs s’évadent du système immunitaire est l’expression d’enzymes responsables du métabolisme des acides aminés dont l’une des principales est l’indoleamine 2,3-dioxygénase (IDO). Cette dernière dégrade le tryptophane et diminue ainsi sa disponibilité dans le microenvironnement tumoral, ce qui engendre des effets négatifs sur la prolifération, les fonctions et la survie des lymphocytes T qui y sont présents. Bien que la régulation de l’expression de cette enzyme ait été largement étudiée chez certaines cellules présentatrices d’antigènes, dont les macrophages et les cellules dendritiques, peu est encore connu sur sa régulation dans les cellules tumorales humaines. Nous avons posé l’hypothèse que différents facteurs produits par les cellules immunitaires infiltrant les tumeurs (TIIC) régulent l’expression de l’IDO dans les cellules tumorales. Nous avons effectivement démontré qu’une expression de l’IDO est induite chez les cellules tumorales humaines, suite à une interaction avec des TIIC. Cette induction indépendante du contact cellulaire résulte principalement de l’interféron-gamma (IFN-g) produit par les lymphocytes T activés, mais est régulée à la baisse par l’interleukine (IL)-13. De plus, la fludarabine utilisée comme agent chimiothérapeutique inhibe l’induction de l’IDO chez les cellules tumorales en réponse aux lymphocytes T activés. Cette observation pourrait avoir des conséquences importantes en clinique sachant qu’une forte proportion d’échantillons cliniques provenant de tumeurs humaines exprime l’IDO. Enfin, les lymphocytes B, qui sont retrouvés également dans certaines tumeurs et qui interagissent étroitement avec les lymphocytes T, sont aussi susceptibles à une induction transcriptionnelle et traductionnelle de l’IDO. Cette enzyme est cependant produite sous une forme inactive dans les lymphocytes B, ce qui rend peu probable l’utilisation de l’IDO par les lymphocytes B comme mécanisme pour freiner la réponse immunitaire. Nos travaux apportent des informations importantes quant à la régulation de l’expression de la molécule immunosuppressive IDO dans les cellules cancéreuses. Ils démontrent que l’expression de l’IDO est influencée par la nature des cytokines présentes dans le microenvironnement tumoral. De plus son expression est inhibée par la fludarabine, un agent utilisé pour le traitement de certains cancers. Ces données devraient être prises en considération dans la planification de futurs essais immunothérapeutiques, et pourraient avoir un impact sur les réponses cliniques anti-tumorales.

Modulation de l’expression du récepteur B1 des kinines par l’angiotensine II et l’endothéline-1 dans des cellules musculaires lisses vasculaires

Le stress oxydatif est impliqué dans l’expression du récepteur B1 des kinines (RB1) dans différents modèles de diabète et d'hypertension. Puisque l'angiotensine II (Ang II) et l'endothéline-1 (ET-1) sont des peptides prooxydants impliqués dans les maladies cardiovasculaires, leur contribution dans l'augmentation de l'expression du RB1 a été étudiée dans des cellules musculaires lisses vasculaires (CMLV). Le QRT-PCR et l’immunobuvardage de type Western ont été utilisés pour mesurer l’expression du RB1 dans des CMLV dérivées de la lignée A10 et de l’aorte de rats Sprague-Dawley. Cette étude montre que l’Ang II augmente l’expression du RB1 (ARNm et protéine) en fonction de la concentration et du temps (maximum 1 μM entre 3-6 h). Cette augmentation implique le récepteur AT1, la PI3K et le NF-κB, mais non le récepteur AT2 et ERK1/2. Aussi, le récepteur ETA de l’ET-1 est impliqué dans la réponse à l’Ang II à 6-8 h et non à 1-4 h. Par contre, l’ET-1 augmente l’expression du RB1 (maximum 2-4 h) via la stimulation des récepteurs ETA et ETB. L’augmentation du RB1 causée par l’Ang II et l’ET-1 est bloquée par les antioxydants (N-acétyl-cystéine et diphénylèneiodonium). Ces résultats suggèrent que l’Ang II induit le RB1 dans les CMLV par le récepteur AT1 dans la première phase, et par la libération d’ET-1 (majoritairement par ETA) dans la phase tardive, via le stress oxydatif et l’activation de la PI3K et du NF-κB. Ces résultats précisent le mécanisme impliqué dans la surexpression du RB1 ayant des effets néfastes dans le diabète et l'hypertension.

Le rôle des cellules gliales de Müller dans la mort des cellules ganglionnaires de la rétine par des mécanismes cellulaires non-autonomes

Les cellules gliales sont essentielles au fonctionnement du système nerveux. Dans la rétine, les cellules gliales de Müller assurent à la fois l’homéostasie du tissu et la protection des neurones, notamment celle des cellules ganglionnaires de la rétine (CGRs). L’hypothèse principale de la thèse est que les cellules de Müller joueraient un rôle primordial dans la survie neuronale tant au plan de la signalisation des neurotrophines/proneurotrophines par suite d’une blessure que lors des mécanismes d’excitotoxicité. Contrairement au brain-derived neurotrophic factor (BDNF), le nerve growth factor (NGF) n’est pas en mesure d’induire la survie des CGRs après une section du nerf optique. Le premier objectif de la thèse a donc été de localiser les récepteurs p75NTR et TrkA du NGF dans la rétine adulte et d’établir leur fonction respective en utilisant des ligands peptidomimétiques agonistes ou antagonistes spécifiques pour chacun des récepteurs. Nos résultats ont démontré que TrkA est surexprimé par les CGRs après l’axotomie, tandis que p75NTR est spécifiquement exprimé par les cellules de Müller. Alors que NGF n’est pas en mesure d’induire la survie des CGRs, l’activation spécifique de TrkA par des ligands peptidomimétique est nettement neuroprotectrice. De façon surprenante, le blocage sélectif de p75NTR ou l’absence de celui-ci protège les CGRs de la mort induite par l’axotomie. De plus, la combinaison de NGF avec l’antagoniste de p75NTR agit de façon synergique sur la survie des CGRS. Ces résultats révèlent un nouveau mécanisme par lequel le récepteur p75NTR exprimé par les cellules gliales de Müller peut grandement influencer la survie neuronale. Ensuite, nous avons voulu déterminer l’effet des proneurotrophines dans la rétine adulte. Nous avons démontré que l’injection de proNGF induit la mort des CGRs chez le rat et la souris par un mécanisme dépendant de p75NTR. L’expression de p75NTR étant exclusive aux cellules de Müller, nous avons testé l’hypothèse que le proNGF active une signalisation cellulaire non-autonome qui aboutit à la mort des CGRs. En suivant cette idée, nous avons montré que le proNGF induit une forte expression du tumor necrosis factor α (TNFα) dans les cellules de Müller et que l’inhibition du TNF bloque la mort neuronale induite par le proNGF. L’utilisation de souris knock-out pour la protéine p75NTR, son co-récepteur sortiline, ou la protéine adaptatrice NRAGE a permis de montrer que la production de TNF par les cellules gliales était dépendante de ces protéines. Le proNGF semble activer une signalisation cellulaire non-autonome qui cause la mort des neurones de façon dépendante du TNF in vivo. L’hypothèse centrale de l’excitotoxicité est que la stimulation excessive des récepteurs du glutamate sensibles au N-Methyl-D-Aspartate (NMDA) est dommageable pour les neurones et contribue à plusieurs maladies neurodégénératives. Les cellules gliales sont soupçonnées de contribuer à la mort neuronale par excitotoxicité, mais leur rôle précis est encore méconnu. Le dernier objectif de ma thèse était d’établir le rôle des cellules de Müller dans cette mort neuronale. Nos résultats ont démontré que l’injection de NMDA induit une activation du nuclear factor κB (NF-κB) dans les cellules de Müller, mais pas dans les CGRs, et que l’utilisation d’inhibiteurs du NF-κB empêche la mort des CGRs. De plus, nous avons montré que les cellules de Müller en réaction à l’activation du NF-κB produisent la protéine TNFα laquelle semble être directement impliquée dans la mort des CGRs par excitotoxicité. Cette mort cellulaire se produit principalement par l’augmentation à la surface des neurones des récepteurs AMPA perméables au Ca2+, un phénomène dépendant du TNFα. Ces donnés révèlent un nouveau mécanisme cellululaire non-autonome par lequel les cellules gliales peuvent exacerber la mort neuronale lors de la mise en jeu de mécanismes excitotoxiques.

Étude de la collaboration entre les facteurs de transcription hématopoïétiques lors du développement et de la différenciation des cellules érythroïdes

La régulation transcriptionnelle des gènes est cruciale pour permettre le bon fonctionnement des cellules. Afin que les cellules puissent accomplir leurs fonctions, les gènes doivent être exprimés adéquatement dans le bon type cellulaire et au stade de développement et de différenciation approprié. Un dérèglement dans l’expression de un ou plusieurs gènes peut entraîner de graves conséquences sur le destin de la cellule. Divers éléments en cis (ex : promoteurs et enhancers) et en trans (machinerie transcriptionnelle et facteurs de transcription) sont impliqués dans la régulation de la transcription. Les gènes du locus humain beta-globine (hub) sont exprimés dans les cellules érythroïdes et sont finenement régulés lors du développement et de la différenciation. Des mutations dans différentes régions du locus causent entre autres les beta-thalassémies. Nous avons utilisé ce modèle bien caractérisé afin d’étudier différents mécanismes de régulation favorisés par les facteurs de transcription qui sont exprimés dans les cellules érythroïdes. Nous nous sommes intéressés à l’importance de l’élément en cis HS2 du Locus control region. Cet élément possède plusieurs sites de liaison pour des facteurs de transcription impliqués dans la régulation des gènes du locus hub. Nos résultats montrent que HS2 possède un rôle dans l’organisation de la chromatine du locus qui peut être dissocié de son rôle d’enhancer. De plus, HS2 n’est pas essentiel pour l’expression à haut niveau du gène beta alors qu’il est important pour l’expression des gènes gamma. Ceci suggère que le recrutement des différents facteurs au site HS2 lors du développement influence différement les gènes du locus. Dans un deuxième temps, nous avons investigué l’importance de HS2 lors de la différenciation des cellules érythroïdes. Il avait été rapporté que l’absence de HS2 influence grandement la potentialisation de la chromatine du gène beta. La potentialisation dans les cellules progénitrices favorise l’activation transcriptionnelle du gène dans les cellules matures. Nous avons caractérisé le recrutement de différents facteurs de transcription au site HS2 et au promoteur beta dans les cellules progénitrices hématopoïétiques (CPH) ainsi que dans les cellules érythroïdes matures. Nos résultats montrent que le facteur EKLF est impliqué dans la potentialisation de la chromatine et favorise le recrutement des facteurs BRG1, p45 et CBP dans les CPH. L’expression de GATA-1 dans les cellules érythroïdes matures permet le recrutement de GATA-1 au locus hub dans ces cellules. Ces données suggèrent que la combinaison de EKLF et GATA-1 est requise pour permettre une activation maximale du gène beta dans les cellules érythroïdes matures. Un autre facteur impliqué dans la régulation du locus hub est Ikaros. Nous avons étudié son recrutement au locus hub et avons observé que Ikaros est impliqué dans la répression des gènes gamma. Nos résultats montrent aussi que GATA-1 est impliqué dans la répression de ces gènes et qu’il interagit avec Ikaros. Ensemble, Ikaros et GATA-1 favorisent la formation d’un complexe de répression aux promoteurs gamma. Cette étude nous a aussi permis d’observer que Ikaros et GATA-1 sont impliqués dans la répression du gène Gata2. De façon intéressante, nous avons caractérisé le mécanisme de répression du gène Hes1 (un gène cible de la voie Notch) lors de la différenciation érythroïde. Similairement à ce qui a été observé pour les gènes gamma, Hes1 est aussi réprimé par Ikaros et GATA-1. Ces résultats suggèrent donc que la combinaison de Ikaros et GATA-1 est associée à la répression de plusieurs de gènes dans les cellules érythroïdes. Globalement cette thèse rapporte de nouveaux mécanismes d’action de différents facteurs de transcription dans les cellules érythroïdes. Particulièrement, nos travaux ont permis de proposer un modèle pour la régulation des gènes du locus hub lors du développement et de la différenciation. De plus, nous rapportons pour la première fois l’importance de la collaboration entre les facteurs Ikaros et GATA-1 dans la régulation transcriptionnelle de gènes dans les cellules érythroïdes. Des mutations associées à certains des facteurs étudiés ont été rapportées dans des cas de beta-thalassémies ainsi que de leucémies. Nos travaux serviront donc à avoir une meilleure compréhension des mécanismes d’action de ces facteurs afin de potentiellement pouvoir les utiliser comme cibles thérapeutiques.

Impact du statut de différenciation des cellules promyélocytaires HL-60 sur l’efficacité anticancéreuse et antiinflammatoire de l’EGCG

L’altération de la barrière hématoencéphalique (BHE) par les cellules tumorales et les cellules immunes circulantes peut mener à la neuroinflammation. Les cellules leucémiques promyélocytaires HL-60 sont un excellent modèle pour étudier et comprendre les mécanismes de signalisation moléculaires qui caractérisent le développement tumoral et métastatique. La cancérogenèse peut s’accompagner de modulations de l’expression de biomarqueurs tels que la cyclooxygénase-2 et la métalloprotéase-9. Les recherches décrites dans ce mémoire relatent l’analyse des biomarqueurs inflammatoires et invasifs régulés lors de la différenciation induite par le PMA des cellules HL-60 en macrophages. Le statut de différenciation cellulaire pourrait avoir un impact sur les gènes cibles de la voie NF-κB. Nous émettons l’hypothèse que le PMA active la voie NF-κB et que cette signalisation peut être renversée par l’(-)-épigallocatéchine-gallate (EGCG). En effet, une régulation à la hausse de l’expression de plusieurs gènes combinée à la diminution de l’expression d’IκB mettent en évidence l’implication de la voie NF-κB dans l’activation des mécanismes pro-inflammatoires et pro-invasifs. Les mêmes observations sont faites dans les cellules différenciées appelées «macrophages-like». L’EGCG, un polyphénol dérivé du thé vert, a un potentiel chimiopréventif. Il est capable d’inhiber la signalisation moléculaire passant par la voie NF-κB dans les cellules HL-60 traitées simultanément par l’EGCG et le PMA, mais pas dans les cellules «macrophages-like». Cette différence peut s’expliquer par une modulation de l’expression du récepteur de surface cellulaire de l’EGCG, le récepteur à la laminine de 67 kDa, et de son précurseur de 37 kDa. Collectivement, nos résultats montrent que le statut de différenciation des cellules promyélocytaires HL-60 concorde avec l’activation des mécanismes favorisant le développement d’un cancer et des métastases. Cet effet peut être prévenu par l’utilisation d’agents naturels tel l’EGCG. Le ciblage de biomarqueurs liés au statut de différenciation des cellules tumorales impliquées dans la perturbation de la barrière hématoencéphalique qui cause la neuroinflammation permettrait l’avancement des connaissances dans la prévention de la cancérogenèse.

Le peptide natriurétique auriculaire induit la différenciation cardiaque dans les cellules souches embryonnaires carcinomateuses de souris P19

Traditionnellement associée à la reproduction féminine, l'ocytocine (OT), une hormone peptidique synthétisée par les noyaux paraventriculaire et supraoptique de l'hypothalamus et sécrétée par l'hypophyse postérieure (neurohypophyse), a été récemment revue et a été démontrée avoir plusieurs nouveaux rôles dans le système cardio-vasculaire. En effet, notre laboratoire a montré que l’OT peut induire la différenciation des cellules souches embryonnaires (CSE) en cardiomyocytes (CM) fonctionnels. À l’aide du modèle cellulaire embryonnaire carcinomateux de souris P19, il a été démontré que ce processus survenait suite à la libération de la guanosine monophosphate cyclique (GMPc) dépendante du monoxyde d’azote. De même, il est connu que le peptide natriurétique auriculaire (ANP), un peptide produit, stocké et sécrété par les myocytes cardiaques, peut aussi induire la production du GMPc. De nombreuses études ont démontré que le cœur ayant subi un infarctus pouvait être régénéré à partir d’une population isolée de cellules souches et progénitrices transplantées. Une de ces populations de cellules, fréquemment isolées à partir d'organes provenant d'animaux aux stades de développement embryonnaire et adulte, appelée « Side Population » (SP), sont identifiées par cytométrie en flux (FACS) comme une population de cellules non marquées par le colorant fluorescent Hoechst 33342 (Ho). Les cellules SP expriment des protéines de transport spécifiques, de la famille ATP-binding cassette, qui ont pour rôle de transporter activement le colorant fluorescent Ho de leur cytoplasme. La sous-population de cellules SP isolée du cœur affiche un potentiel de différenciation cardiaque amélioré en réponse à un traitement avec l’OT. Récemment, l'hétérogénéité phénotypique et fonctionnelle des CSE a été mise en évidence, et cela a été corrélé avec la présence de sous-populations cellulaires ressemblant beaucoup aux cellules SP issues du cœur. Puisque l’ANP peut induire la production du GMPc et qu’il a été démontré que la différenciation cardiaque était médiée par la production du GMPc, alors nous émettons l'hypothèse selon laquelle l’ANP pourrait induire la différenciation cardiaque. Étant donné que les CSE sont composés d’un mélange de différents types cellulaires alors nous émettons aussi l’hypothèse selon laquelle l’utilisation d’une sous-population de CSE plus homogène renforcerait le potentiel de différenciation de l'ANP. Méthodes : Les SP ont été isolées des cellules P19 par FACS en utilisant la méthode d’exclusion du colorant fluorescent Ho. Puis, leur phénotype a été caractérisé par immunofluorescence (IF) pour les marqueurs de l’état indifférencié, d’auto-renouvellement et de pluripotence octamer-binding transcription factor 4 (OCT4) et stage-specific embryonic antigen-1 (SSEA1). Ensuite, la dose pharmacologique optimale d’ANP a été déterminée via des tests de cytotoxicité sur des cellules P19 (MTT assay). Pour induire la différenciation en cardiomyocytes, des cellules à l’état de sphéroïdes ont été formées à l’aide de la technique du « Hanging-Drop » sous la stimulation de l’ANP pendant 5 jours. Puis, des cryosections ont été faites dans les sphéroïdes afin de mettre en évidence la présence de marqueurs de cellules cardiaques progénitrices tels que GATA4, Nkx2.5 et un marqueur mitochondrial spécifique Tom22. Ensuite, les cellules SP P19 ont été stimulées dans les sphéroïdes cellulaires par le traitement avec de l'ANP (10-7 M) ou de l’OT (10-7 M), de l’antagoniste spécifique du guanylate cyclase particulé (GCp) A71915 (10-6 M), ainsi que la combinaison des inducteurs OT+ANP, OT+A71915, ANP+A71915. Après la mise en culture, la différenciation en cardiomyocytes a été identifié par l’apparition de colonies de cellules battantes caractéristiques des cellules cardiaques, par la détermination du phénotype cellulaire par IF, et enfin par l’extraction d'ARN et de protéines qui ont été utilisés pour le dosage du GMPc par RIA, l’expression des ARNm par RT-PCR et l’expression des protéines par immunobuvardage de type western. Résultats : Les sphéroïdes obtenus à l’aide de la technique du « Hanging-Drop » ont montré une hausse modeste de l’expression des ARNm suivants : OTR, ANP et GATA4 comparativement aux cellules cultivées en monocouches. Les sphéroïdes induits par l’ANP ont présenté une augmentation significative des facteurs de transcription cardiaque GATA4 et Nkx2.5 ainsi qu’un plus grand nombre de mitochondries caractérisé par une plus grande présence de Tom22. De plus, L’ANP a induit l’apparition de colonies de cellules battantes du jour 7 (stade précoce) au jour 14 (stade mature) de façon presque similaire à l’OT. Cependant, la combinaison de l’ANP avec l’OT n’a pas induit de colonies de cellules battantes suggérant un effet opposé à celui de l’OT. Par IF, nous avons quantifié (nombre de cellules positives) et caractérisé, du jour 6 au jour 14 de différenciation, le phénotype cardiaque de nos cellules en utilisant les marqueurs suivants : Troponine T Cardiaque, ANP, Connexines 40 et 43, l’isoforme ventriculaire de la chaîne légère de myosine (MLC-2v), OTR. Les SP différenciées sous la stimulation de l’ANP ont montré une augmentation significative du GMPc intracellulaire comparé aux cellules non différenciées. À notre grande surprise, l’antagoniste A71915 a induit une plus grande apparition de colonies de cellules battantes comparativement à l’OT et l’ANP à un jour précoce de différenciation cardiaque et l’ajout de l’OT ou de l’ANP a potentialisé ses effets, augmentant encore plus la proportion de colonies de cellules battantes. De plus, la taille des colonies de cellules battantes était encore plus importante que sous la simple stimulation de l’OT ou de l’ANP. Les analyses radioimmunologiques dans les cellules SP P19 stimulés avec l’ANP, A71915 et la combinaison des deux pendant 15min, 30min et 60min a montré que l’ANP stimule significativement la production du GMPc, cependant A71915 n’abolit pas les effets de l’ANP et celui-ci au contraire stimule la production du GMPc via des effets agonistes partiels. Conclusion : Nos résultats démontrent d’une part que l’ANP induit la différenciation des cellules SP P19 en CM fonctionnels. D’autre part, il semblerait que la voie de signalisation NPRA-B/GCp/GMPc soit impliquée dans le mécanisme de différenciation cardiaque puisque l’abolition du GMPc médiée par le GCp potentialise la différenciation cardiaque et il semblerait que cette voie de signalisation soit additive de la voie de signalisation induite par l’OT, NO/GCs/GMPc, puisque l’ajout de l’OT à l’antagoniste A71915 stimule plus fortement la différenciation cardiaque que l’OT ou l’A71915 seuls. Cela suggère que l’effet thérapeutique des peptides natriurétiques observé dans la défaillance cardiaque ainsi que les propriétés vasodilatatrices de certains antagonistes des récepteurs peptidiques natriurétiques inclus la stimulation de la différenciation des cellules souches en cardiomyocytes. Cela laisse donc à penser que les peptides natriurétiques ou les antagonistes des récepteurs peptidiques natriurétiques pourraient être une alternative très intéressante dans la thérapie cellulaire visant à induire la régénération cardiovasculaire.

Role of CD4+ T cells in the regulation of the immune response against encapsulated Group B Streptococcus

Le Streptocoque de groupe B (GBS) est un important agent d’infection invasive pouvant mener à la mort et demeure la cause principale de septicémie néonatale à ce jour. Neuf sérotypes ont été officiellement décrits basés sur la composition de la capsule polysaccharidique (CPS). Parmi ces sérotypes, le type III est considéré le plus virulent et fréquemment associé aux maladies invasives graves, telle que la méningite. Malgré que plusieurs recherches aient été effectuées au niveau des interactions entre GBS type III et les cellules du système immunitaire innées, aucune information n’est disponible sur la régulation de la réponse immunitaire adaptative dirigée contre ce dernier. Notamment, le rôle de cellules T CD4+ dans l’immuno-pathogenèse de l’infection causée par GBS n’a jamais été étudié. Dans cet étude, trois différents modèles murins d’infection ont été développé pour évaluer l’activation et la modulation des cellules T CD4+ répondantes au GBS de type III : ex vivo, in vivo, et in vitro. Les résultats d’infections ex vivo démontrent que les splénocytes totaux répondent à l’infection en produisant des cytokines de type-1 pro-inflammatoires. Une forte production d’IL-10 accompagne cette cascade inflammatoire, probablement dans l’effort de l’hôte de maintenir l’homéostasie. Les résultats démontrent aussi que les cellules T sont activement recrutées par les cellules répondantes du système inné en produisant des facteurs chimiotactiques, tels que CXCL9, CXCL10, et CCL3. Plus spécifiquement, les résultats obtenus à partir des cellules isolées T CD4+ provenant des infections ex vivo ou in vivo démontrent que ces cellules participent à la production d’IFN-γ et de TNF-α ainsi que d’IL-2, suggérant un profil d’activation Th1. Les cellules isolées T CD4+ n’étaient pas des contributeurs majeurs d’IL-10. Ceci indique que cette cytokine immuno-régulatrice est principalement produite par les cellules de l’immunité innée de la rate de souris infectées. Le profil Th1 des cellules T CD4+ a été confirmé en utilisant un modèle in vitro. Nos résultats démontrent aussi que la CPS de GBS a une role immuno-modulateur dans le développement de la réponse Th1. En résumé, cette étude adresse pour la première fois, la contribution des cellules T CD4+ dans la production d’IFN-γ lors d’une infection à GBS et donc, dans le développement d’une réponse de type Th1. Ces résultats renforcent d’avantage le rôle central de cette cytokine pour un control efficace des infections causées par ce pathogène.

Étude des effets du phénotype de sénescence des cellules stromales de la moelle osseuse sur les fonctions hématopoïétiques

L’irradiation (IR) est utilisée dans le traitement de plusieurs cancers et désordres hématologiques, en particulier dans les protocoles de conditionnement précédents les transplantations de moelle osseuse. L’emploi de doses réduites d’IR semble favoriser le succès de la prise de greffe. Cette observation soulève un point de plus en plus discuté dans la littérature, soit l’importance de l’intégrité du microenvironnement pour la transplantation et le bon fonctionnement de l’hématopoïèse. L’IR induit la sénescence des cellules stromales de la moelle osseuse in vitro. Ce mécanisme de défense cellulaire entraînant un arrêt de prolifération permanent est également observé in vivo dans différents systèmes, mais n’a pas encore été étudié dans le contexte de la niche hématopoïétique. Les travaux présentés dans cette thèse ont pour objectif de déterminer si l’IR induit la sénescence des cellules stromales de la moelle osseuse et si une telle induction altère les fonctions hématopoïétiques. Nos résultats ont permis de démontrer pour la première fois qu’une IR corporelle totale induit effectivement la sénescence des cellules stromales de la moelle osseuse. En outre, cette altération du microenvironnement affecte la lymphopoïèse B de façon Ink4a/Arf-dépendante (1er article). De plus, les modifications systémiques qui résultent de l’IR compromettent l’homéostasie osseuse en augmentant la résorption de l’os, sans toutefois diminuer la formation de celui-ci (2e article). Ces données nous permettent de mieux comprendre les effets de la sénescence des cellules stromales de la moelle osseuse sur les fonctions hématopoïétiques. Par ailleurs, elles suggèrent que l’emploi de drogues et/ou de procédés n’induisant pas la sénescence des cellules stromales de l’os offrirait un meilleur pronostic à long terme pour les patients.

The Role of Second Generation Antiretroviral Drugs in HIV-1 Subtype B and non-B Variants Harboring Natural Polymorphisms and Drug Resistance Mutations.

Cette thèse traite de la résistance du VIH-1 aux antirétroviraux, en particulier de l'activité antivirale de plusieurs inhibiteurs non nucléosidiques de la transcriptase inverse (INNTI) ainsi que des inhibiteurs de protéase (IP). Nous avons exploré l’émergence et la spécificité des voies de mutations qui confèrent la résistance contre plusieurs nouveaux INNTI (étravirine (ETR) et rilpivirine (RPV)) (chapitres 2 et 3). En outre, le profil de résistance et le potentiel antirétroviral d'un nouvel IP, PL-100, est présenté dans les chapitres 4 et 5. Pour le premier projet, nous avons utilisé des sous-types B et non-B du VIH-1 pour sélectionner des virus résistants à ETR, et ainsi montré que ETR favorise l’émergence des mutations V90I, K101Q, E138K, V179D/E/F, Y181C, V189I, G190E, H221H/Y et M230L, et ce, en 18 semaines. Fait intéressant, E138K a été la première mutation à émerger dans la plupart des cas. Les clones viraux contenant E138K ont montré un faible niveau de résistance phénotypique à ETR (3,8 fois) et une diminution modeste de la capacité de réplication (2 fois) par rapport au virus de type sauvage. Nous avons également examiné les profils de résistance à ETR et RPV dans les virus contenant des mutations de résistance aux INNTI au début de la sélection. Dans le cas du virus de type sauvage et du virus contenant la mutation unique K103N, les premières mutations à apparaître en présence d’ETR ou de RPV ont été E138K ou E138G suivies d’autres mutations de résistance aux INNTI. À l’inverse, dans les mêmes conditions, le virus avec la mutation Y181C a évolué pour produire les mutations V179I/F ou A62V/A, mais pas E138K/G. L'ajout de mutations à la position 138 en présence de Y181C n'augmente pas les niveaux de résistance à ETR ou RPV. Nous avons également observé que la combinaison de Y181C et E138K peut conduire à un virus moins adapté par rapport au virus contenant uniquement Y181C. Sur la base de ces résultats, nous suggérons que les mutations Y181C et E138K peuvent être antagonistes. L’analyse de la résistance au PL-100 des virus de sous-type C et CRF01_AE dans les cellules en culture est décrite dans le chapitre 4. Le PL-100 sélectionne pour des mutations de résistance utilisant deux voies distinctes, l'une avec les mutations V82A et L90M et l'autre avec T80I, suivi de l’addition des mutations M46I/L, I54M, K55R, L76F, P81S et I85V. Une accumulation d'au moins trois mutations dans le rabat protéique et dans le site actif est requise dans chaque cas pour qu’un haut niveau de résistance soit atteint, ce qui démontre que le PL-100 dispose d'une barrière génétique élevée contre le développement de la résistance. Dans le chapitre 5, nous avons évalué le potentiel du PL-100 en tant qu’inhibiteur de protéase de deuxième génération. Les virus résistants au PL-100 émergent en 8-48 semaines alors qu’aucune mutation n’apparaît avec le darunavir (DRV) sur une période de 40 semaines. La modélisation moléculaire montre que la haute barrière génétique du DRV est due à de multiples interactions avec la protéase dont des liaison hydrogènes entre les groupes di-tétrahydrofuranne (THF) et les atomes d'oxygène des acides aminés A28, D29 et D30, tandis que la liaison de PL-100 est principalement basée sur des interactions polaires et hydrophobes délocalisées à travers ses groupes diphényle. Nos données suggèrent que les contacts de liaison hydrogène et le groupe di-THF dans le DRV, ainsi que le caractère hydrophobe du PL-100, contribuent à la liaison à la protéase ainsi qu’à la haute barrière génétique contre la résistance et que la refonte de la structure de PL-100 pour inclure un groupe di-THF pourrait améliorer l’activité antivirale et le profil de résistance.

Suivi des vaisseaux sanguins en temps réel à partir d’images ultrasonores mode-B et reconstruction 3D : application à la caractérisation des sténoses artérielles

La maladie des artères périphériques (MAP) se manifeste par une réduction (sténose) de la lumière de l’artère des membres inférieurs. Elle est causée par l’athérosclérose, une accumulation de cellules spumeuses, de graisse, de calcium et de débris cellulaires dans la paroi artérielle, généralement dans les bifurcations et les ramifications. Par ailleurs, la MAP peut être causée par d`autres facteurs associés comme l’inflammation, une malformation anatomique et dans de rares cas, au niveau des artères iliaques et fémorales, par la dysplasie fibromusculaire. L’imagerie ultrasonore est le premier moyen de diagnostic de la MAP. La littérature clinique rapporte qu’au niveau de l’artère fémorale, l’écho-Doppler montre une sensibilité de 80 à 98 % et une spécificité de 89 à 99 % à détecter une sténose supérieure à 50 %. Cependant, l’écho-Doppler ne permet pas une cartographie de l’ensemble des artères des membres inférieurs. D’autre part, la reconstruction 3D à partir des images échographiques 2D des artères atteintes de la MAP est fortement opérateur dépendant à cause de la grande variabilité des mesures pendant l’examen par les cliniciens. Pour planifier une intervention chirurgicale, les cliniciens utilisent la tomodensitométrie (CTA), l’angiographie par résonance magnétique (MRA) et l’angiographie par soustraction numérique (DSA). Il est vrai que ces modalités sont très performantes. La CTA montre une grande précision dans la détection et l’évaluation des sténoses supérieures à 50 % avec une sensibilité de 92 à 97 % et une spécificité entre 93 et 97 %. Par contre, elle est ionisante (rayon x) et invasive à cause du produit de contraste, qui peut causer des néphropathies. La MRA avec injection de contraste (CE MRA) est maintenant la plus utilisée. Elle offre une sensibilité de 92 à 99.5 % et une spécificité entre 64 et 99 %. Cependant, elle sous-estime les sténoses et peut aussi causer une néphropathie dans de rares cas. De plus les patients avec stents, implants métalliques ou bien claustrophobes sont exclus de ce type d`examen. La DSA est très performante mais s`avère invasive et ionisante. Aujourd’hui, l’imagerie ultrasonore (3D US) s’est généralisée surtout en obstétrique et échocardiographie. En angiographie il est possible de calculer le volume de la plaque grâce à l’imagerie ultrasonore 3D, ce qui permet un suivi de l’évolution de la plaque athéromateuse au niveau des vaisseaux. L’imagerie intravasculaire ultrasonore (IVUS) est une technique qui mesure ce volume. Cependant, elle est invasive, dispendieuse et risquée. Des études in vivo ont montré qu’avec l’imagerie 3D-US on est capable de quantifier la plaque au niveau de la carotide et de caractériser la géométrie 3D de l'anastomose dans les artères périphériques. Par contre, ces systèmes ne fonctionnent que sur de courtes distances. Par conséquent, ils ne sont pas adaptés pour l’examen de l’artère fémorale, à cause de sa longueur et de sa forme tortueuse. L’intérêt pour la robotique médicale date des années 70. Depuis, plusieurs robots médicaux ont été proposés pour la chirurgie, la thérapie et le diagnostic. Dans le cas du diagnostic artériel, seuls deux prototypes sont proposés, mais non commercialisés. Hippocrate est le premier robot de type maitre/esclave conçu pour des examens des petits segments d’artères (carotide). Il est composé d’un bras à 6 degrés de liberté (ddl) suspendu au-dessus du patient sur un socle rigide. À partir de ce prototype, un contrôleur automatisant les déplacements du robot par rétroaction des images échographiques a été conçu et testé sur des fantômes. Le deuxième est le robot de la Colombie Britannique conçu pour les examens à distance de la carotide. Le mouvement de la sonde est asservi par rétroaction des images US. Les travaux publiés avec les deux robots se limitent à la carotide. Afin d’examiner un long segment d’artère, un système robotique US a été conçu dans notre laboratoire. Le système possède deux modes de fonctionnement, le mode teach/replay (voir annexe 3) et le mode commande libre par l’utilisateur. Dans ce dernier mode, l’utilisateur peut implémenter des programmes personnalisés comme ceux utilisés dans ce projet afin de contrôler les mouvements du robot. Le but de ce projet est de démontrer les performances de ce système robotique dans des conditions proches au contexte clinique avec le mode commande libre par l’utilisateur. Deux objectifs étaient visés: (1) évaluer in vitro le suivi automatique et la reconstruction 3D en temps réel d’une artère en utilisant trois fantômes ayant des géométries réalistes. (2) évaluer in vivo la capacité de ce système d'imagerie robotique pour la cartographie 3D en temps réel d'une artère fémorale normale. Pour le premier objectif, la reconstruction 3D US a été comparée avec les fichiers CAD (computer-aided-design) des fantômes. De plus, pour le troisième fantôme, la reconstruction 3D US a été comparée avec sa reconstruction CTA, considéré comme examen de référence pour évaluer la MAP. Cinq chapitres composent ce mémoire. Dans le premier chapitre, la MAP sera expliquée, puis dans les deuxième et troisième chapitres, l’imagerie 3D ultrasonore et la robotique médicale seront développées. Le quatrième chapitre sera consacré à la présentation d’un article intitulé " A robotic ultrasound scanner for automatic vessel tracking and three-dimensional reconstruction of B-mode images" qui résume les résultats obtenus dans ce projet de maîtrise. Une discussion générale conclura ce mémoire. L’article intitulé " A 3D ultrasound imaging robotic system to detect and quantify lower limb arterial stenoses: in vivo feasibility " de Marie-Ange Janvier et al dans l’annexe 3, permettra également au lecteur de mieux comprendre notre système robotisé. Ma contribution dans cet article était l’acquisition des images mode B, la reconstruction 3D et l’analyse des résultats pour le patient sain.

Implication de la voie alternative NF-kappa B dans le cancer de la prostate

Le cancer de la prostate (CaP) est le plus diagnostiqué chez les hommes au Canada et représente le troisième cancer le plus meurtrier au sein de cette population. Malgré l’efficacité des traitements de première ligne, de nombreux patients finiront par développer une résistance et, le cas échéant, verront leur CaP progresser vers une forme plus agressive. Plusieurs paramètres, essentiellement cliniques, permettent de prédire la progression du CaP mais leur sensibilité, encore limitée, implique la nécessité de nouveaux biomarqueurs afin de combler cette lacune. Dans cette optique nous nous intéressons au facteur de transcription NF-κB. Des études réalisées au laboratoire et ailleurs, associent RelA(p65) à un potentiel clinique dans le CaP, soulignant ainsi l’importance de la voie classique NF-κB. L’implication de la voie alternative NF-κB dans la progression du CaP a aussi été suggérée dans une de nos études illustrant la corrélation entre la distribution nucléaire de RelB et le score de Gleason. Alors que la voie classique est largement documentée et son implication dans la progression du CaP établie, la voie alternative, elle, reste à explorer. La présente thèse vise à clarifier l’implication de la voie alternative NF-κB dans le CaP et répond à deux objectifs fixés dans ce but. Le premier objectif fut d’évaluer l’impact de l'activation de la voie alternative NF-κB sur la biologie des cellules cancéreuses prostatiques. L’étude de la surexpression de RelB a souligné les effets de la voie alternative NF-κB sur la prolifération et l'autophagie. Étant ainsi impliquée tant dans la croissance tumorale que dans un processus de plus en plus associée à la progression tumorale, quoique potentiellement létal pour les cellules cancéreuses, son impact sur la tumorigénèse du CaP reste encore difficile à définir. Il n'existe, à ce jour, aucune étude permettant de comparer le potentiel clinique des voies classique et alternative NF-κB. Le second objectif de ce projet fut donc l'analyse conjointe de RelA(p65) et RelB au sein de mêmes tissus de patients atteints de CaP afin de déterminer l'importance clinique des deux signalisations NF-κB, l'une par rapport à l'autre. Le marquage immunofluorescent de RelA(p65) et RelB en a permis l'analyse quantitative et objective par un logiciel d'imagerie. Nos travaux ont confirmé le potentiel clinique associé à RelA(p65). La variable RelA(p65)/RelB s’est, elle, avérée moins informative que RelA(p65). Par contre, aucune corrélation entre RelB et les paramètres cliniques inclus dans l'étude n’est ressortie. En définitive, mon projet de thèse aura permis de préciser l'implication de la voie alternative NF-κB sur la biologie du CaP. Son impact sur la croissance des cellules cancéreuses prostatiques ainsi que sur l'autophagie, dénote l’ambivalence de la voie alternative NF-κB face à la tumorigénèse du CaP. L’étude exhaustive de la signalisation NF-κB souligne davantage l'importance de la voie classique dont l’intérêt clinique est principalement associé au statut de RelA(p65). Ainsi, bien que RelB n’affiche aucun potentiel en tant que biomarqueur exploitable en clinique, l’analyse de l’intervention de la voie alternative NF-κB sur la biologie des cellules cancéreuses prostatiques reste d’intérêt pour la compréhension de son rôle exact dans la progression du CaP.