Cryptococcus neoformans isolados de pacientes com AIDS

Criptococose é considerada a infecção fúngica sistêmica oportunista mais comum em pacientes com AIDS. Nestes pacientes tem predominado como agente etiológico Cryptococcus neoformans var. neoformans, e muito raramente relata-se C. neoformans var. gattiii, mesmo nas regiões onde se verifica a sua prevalência. Foram estudados 50 pacientes com lesões de criptococose meningoencefálica associada com AIDS. Os isolados foram identificados através de características microscópicas e macroscópicas exibidas em meios de ágar Sabouraud, ágar niger e Christensen. As variedades de C. neoformans foram determinadas pela reação de coloração obtida em meio de L-canavanina glicina-azul de bromotimol (CGB). Em todos os pacientes examinados foram isolados C. neoformans, sendo identificados C. neoformans var. neoformans em 47 isolados e C. neoformans var. gattii em 3. Os resultados encontrados mostram que a criptococose em pacientes com AIDS pode também ser causada por C. neoformans var. gatti, apesar de haver predominância de C. neoformans var neoformans nesta população.

Cativeiro de aves como fonte de Cryptococcus neoformans na cidade de Campo Grande, Mato Grosso do Sul, Brasil

Cryptococcus neoformans é a levedura capsulada causadora de criptococose em humanos e animais. A variedade neoformans, encontrada em diversas fontes ambientais, inclusive habitats de aves, é importante causa de mortalidade em indivíduos com AIDS em todo o Mundo. Contudo, ainda não há estudos sobre a sua ecologia na região Centro Oeste brasileira, onde há registro da ocorrência de casos humanos da micose. Para estudar fontes saprofíticas de C. neoformans, na cidade de Campo Grande, foram coletadas 20 amostras de excretas de aves em distintos ambientes. Suspensão das amostras em salina estéril foram semeadas em placas com meio ágar níger. Após 5 dias, colônias mucóides marrom-escuro foram subcultivadas para identificação através de provas morfofisiológicas, determinação da variedade e sorotipagem. C. neoformans var. neoformans sorotipo A foi isolado de 10 (50%) das amostras, comprovando a ocorrência saprofítica de C. neoformans na cidade de Campo Grande, relacionada a habitat de aves em cativeiro.

Tipagem molecular de isolados clínicos e ambientais do complexo de espécies de Cryptococcus neoformans através do gene da fosfolipase B (PLB1) e avaliação da susceptibilidade antifúngica

Cryptococcus neoformans é uma levedura encapsulada, presente em animais e humanos, que infecta tanto indivíduos imunocomprometidos como imunocompetentes. A criptococose é uma causa significativa de morbilidade e mortalidade em todo o mundo, sendo a meningoencefalite o sinal mais frequente da doença. Duas espécies estão incluídas no complexo de Cryptococcus neoformans: C. gattii (serotipos B e C) e C. neoformans. Por sua vez, C. neoformans é dividido em duas grandes variedades - var. grubii (serotipo A) e var. neoformans (serotipo D) –, além de incluir estirpes híbridas (serotipo AD). A técnica de RFLP tem sido usada para identificar facilmente os tipos moleculares dos isolados em estudos epidemiológicos. Oito tipos foram descritos: VNI, VNII (ambos correspondentes a estirpes C. neoformans var. grubii), VNIII (estirpes híbridas AD), VNIV (C. neoformans var. neoformans), e VGI-IV (correspondentes a C. gattii). Este trabalho teve como objectivo, caracterizar geneticamente uma colecção de isolados clínicos e ambientais, portugueses e estrangeiros, e avaliar a sua resistência a duas drogas antifúngicas, permitindo comparar os padrões epidemiológicos do complexo de espécies com os encontrados noutras regiões do mundo. A colecção possui 337 isolados de C. neoformans, provenientes de diversos hospitais e regiões, previamente identificados por métodos convencionais de diagnóstico. A determinação dos tipos moleculares foi realizada através do método de RFLP no gene PLB1. Dos 267 isolados analisados, o tipo mais abundante foi VN I (61,42%), seguido por VN III (24,34%). Menos abundantes foram VN IV (10,11%) e VN II (3%), enquanto que VG I foi raro (1,12%). Os restantes tipos moleculares de C. gattii não foram encontrados. Usando o método de difusão em disco, 98 destes isolados foram analisados quanto à susceptibilidade antifúngica. Foi registada resistência ao voriconazol em apenas 3,1% dos isolados testados. Foi encontrada resistência ao fluconazol num elevado número de isolados (32,7%) e susceptibilidade dependendo da dose em 15,3%. Este trabalho, também teve o intuito de correlacionar os resultados anteriores com o tipo molecular. Todavia não foi encontrada diferença estatisticamente significativa entre qualquer dos tipos moleculares e as CMIs correspondentes ao fluconazol. Porém, os resultados mostram que alguns tipos moleculares são menos susceptíveis do que outros em relação ao voriconazol: VN I e VN IV são mais resistentes do que VN II, e VN I e VN II são mais susceptíveis que VN III. Concluindo, a elevada frequência de VN I está de acordo com resultados obtidos em outros estudos em países Europeus e Sul-Americanos. É notável a abundância de VN III em Portugal, tal como relatado noutros países do Sul da Europa, mas também no Chile, contrariamente a outras regiões do globo. A elevada resistência ao fluconazol é compatível com os resultados documentados em estudos anteriores. Esta investigação é um importante passo na epidemiologia da criptococose e da ocorrência de C. neoformans em Portugal.

Tipagem molecular de isolados clínicos e ambientais de Cryptococcus neoformans

As micoses estão incluídas entre as doenças infecciosas mais ubíquas em todo o mundo, afectando todos os estratos sociais e todos os grupos etários numa variedade de manifestações superficiais, cutâneas, subcutâneas e sistémicas. Um diagnóstico rápido e eficaz destas doenças, com uma correcta identificação da espécie fúngica responsável pela infecção, é essencial para um planeamento do tratamento mais eficaz para o doente infectado. Tem-se registado um aumento da incidência das infecções fúngicas também em consequência do aumento do número de casos de doentes imunodeprimidos, devido particularmente à crescente utilização de terapêuticas imunossupressivas, procedimentos médicos invasivos, prescrição de tratamentos prolongados, entre outros aspectos. O aparecimento da epidemia da Imunodeficiência Humana no início da década de 80, causada pelo vírus VIH, contribuiu também decisivamente para o aumento das infecções fúngicas oportunistas. A Criptococose é uma infecção fúngica, predominantemente oportunista e com uma distribuição epidemiológica mundial, causada por leveduras encapsuladas do género Cryptococcus. A espécie clinicamente mais relevante é Cryptococcus neoformans, cujas estirpes têm sido tradicionalmente classificadas em cinco serotipos relacionados com os antigénios da respectiva cápsula polissacárida: A (C. neoformans var. grubii); D (C. neoformans var. neoformans); B e C (actualmente reconhecidos como uma espécie distinta mas filogeneticamente próxima, C. gattii); e AD (estirpes híbridas). O presente trabalho teve como principal objectivo determinar retrospectivamente os tipos moleculares de uma colecção alargada de estirpes de C. neoformans, isoladas e mantidas durante os últimos 18 anos no Laboratório de Micologia do IHMT/UNL. A maioria das estirpes foi isolada de doentes imunodeprimidos com criptococose, existindo também algumas estirpes de origem ambiental. Foi utilizada a técnica de PCR-RFLP do gene URA5 para diferenciar as estirpes de Cryptococcus neoformans, tendo sido detectados quatro tipos moleculares: VN1 e VN2 (relacionados com C. neoformans var. grubii, serotipo A); VN3 (relacionado com as estirpes híbridas de serotipo AD); e VN4 (relacionado com C. neoformans var. neoformans, serotipo D). Não foram encontrados entre os isolados de origem clínica perfis de restrição correspondentes aos tipos moleculares VG1, VG2, VG3 e VG4 (relacionados com C. gattii, serotipos B e C). O tipo molecular VN1 foi o mais abundante entre os isolados de origem clínica (45% dos isolados), seguindo-se o grupo de 5 estirpes híbridas do tipo molecular VN3 (31%). Os tipos moleculares menos abundantes entre os isolados foram o VN2 (12%) e VN4 (12%). A estandardização do método de tipagem molecular utilizado neste trabalho permite comparar os resultados obtidos com os de outros estudos epidemiológicos semelhantes, realizados noutras regiões do globo e publicados em anos recentes, contribuindo para um conhecimento melhorado da epidemiologia global deste importante fungo patogénico. Em Portugal obteve-se uma percentagem mais elevada de isolados dos grupos moleculares VN1 e VN3 em relação a outros países da Europa e América Latina, em que os tipos mais abundantes são VN1 e VN2. Nestas mesmas regiões, o tipo molecular VN4, relacionado com as estirpes de C. neoformans var. neoformans do serotipo D, é muito raro. Esta variedade é mais comum em zonas mediterrâneas e está muito associada a casos clínicos de infecções cutâneas associadas a infecções do Sistema Nervoso Central. Este tipo molecular parece ser também significativamente mais abundante no nosso país.

Regulación de la función de macrófagos por Cryptococcus neoformans y Cryptococcus gattii y su participación en la generación de la inmunidad adaptativa antifúngica. Regulation of macrophage function by Cryptococcus neoformans and Cryptococcus gattii and their role in the antifungal adaptative immunity.

La criptococosis es causada por la inhalación de levaduras encapsuladas de Cryptococcus neoformans o Cryptococcus gattii. Representa una de las tres infecciones graves por oportunistas en pacientes con SIDA y existe aproximadamente un 6 por ciento de incidencia de criptococosis clínica en pacientes con transplante de órganos sólidos. Estas dos especies difieren la fisiopatogenia durante la infección. El factor de virulencia principal de Cryptococcus sp. es la presencia del polisacárido capsular, glucuronoxilomanano (GXM), de alto peso molecular, que es continuamente secretado por las levaduras. Los macrófagos son células centrales en la respuesta innata al hongo, los cuales deben ser activados por linfocitos T helper 1 para un eficiente control de la infección. Sin embargo, estas células también son suceptibles al parasitismo intracelular, permitiendo la infección persistente y la diseminación a sitios extrapulmonares. Este proyecto propone investigar la capacidad de levaduras de C. neoformans, C. gattii y de los polisacáridos capsulares para modular la respuesta proinflamatoria de los macrófagos. Queremos estudiar si el tratamiento de macrófagos con levaduras o polisacárido puede inducir perfiles supresores de la respuesta protectiva T helper 1, tales como linfocitos T helper 2 o T reguladores, favoreciendo la sobrevida intracelular del hongo. Además, pensamos que C. neoformans o C. gattii podrían inducir un activación diferencial de macrófagos lo que condicionaría la respuesta adaptativa, lo que podría explicar las diferencias en la fisiopatogenia de estas dos especies. Procedimientos experimentales -Microorganismos y obtención de GXM: se trabajará con C. neoformans variedad grubii, cepa ATCC 62067 y C. gattii serotipo B, cepa NIH112B. Se obtendrán polisacáridos capsulares (GXM) de C. neoformans y C. gattii por precipitación con etanol y y acomplejamiento selectivo con CTAB. - Obtención de macrófagos murinos y cultivos celulares: se obtendrán macrófagos por lavados peritoneales y/o alveolares de ratones BALB/c. Los macrófagos se cultivarán por 24 h en ausencia o presencia de levaduras muertas o vivas (sin opsonizar u opsonizadas) de C. neoformans o C. gattii o en presencia de GXM purificado. -Objetivo 1. Estudio de la modulación de las propiedades proinflamatorias de Mac: en sobrenadantes de los cultivos se medirán las citoquinas por ELISA de captura y en lisados celulares, la expresión de las enzimas (iNOS, arginasa, IDO) por western blot. Se analizará por citometría de flujo la expresión de MCHII y moléculas CD80, CD86, CD40, CTLA-4. -Objetivo 2. Estudios in vitro de la capacidad de macrófagos tratados con levaduras o GXM para inducir linfocitos Th1, Th2 o Treg: los macrófagos preincubados con GXM o levaduras, se incubarán con linfocitos autólogos estimulados con anti-CD3. Se medirá la proliferación celular y el perfil de citoquinas por citomtría de flujo. Células T CD4+ CD25- serán purificadas de suspenciones esplénicas de ratones normales. Luego las células serán incubadas con macrófagos (sin tratar o tratados con levaduras o GXM) y estimulados con anti-CD3. Se analizará la proliferación celular con CFSE y expresión de CD4, CD25 y Foxp3 . - Objetivo 3. Estudios in vivo de la capacidad de levaduras o GXM para inducir linfocitos Th1, Th2 o Treg . Rol de los macrófagos in vivo: Los ratones serán inyectados con 100000 levaduras o con 200 µg de GXM puro vía endovenosa y luego de 7, 14, 30 y 40 días se evaluarán las poblaciones celulares de bazo, por citometría de flujo usando marcaciones simultáneas para CD4, CD8, CD25, Foxp3 y citoquinas intracelulares. Para investigar la participación in vivo de los macrófagos, se depletaran estas células inyectando los animales con PBS-liposomas o clodronato (DMDP)-liposomas por vía endovenosa o inhalatoria (200- 300 µl por ratón). Luego de 24 h, los animales se infectarán con levaduras o inocularán con GXM y se evaluarán los perfiles de células T esplénicos o de nódulos linfaticos.

In vitro susceptibility characteristics of Cryptococcus neoformans varieties from AIDS patients in Goiânia, Brazil

Sixty clinical isolates of Cryptococcus neoformans from AIDS from Goiânia, state of Goiás, Brazil, were characterized according to varieties, serotypes and tested for antifungal susceptibility. To differentiate the two varieties was used L-canavanine-glycine-bromothymol blue medium and to separate the serotypes was used slide agglutination test with Crypto Check Iatron. The Minimal Inhibitory Concentration (MIC) of fluconazole, itraconazole, and amphotericin B were determined by the National Committee for Clinical Laboratory Standards macrodilution method. Our results identified 56 isolates as C. neoformans var. neoformans serotype A and 4 isolates as C. neoformans var. gattii serotype B. MIC values for C. neoformans var. gattii were higher than C. neoformans var. neoformans. We verified that none isolate was resistant to itraconazole and to amphotericin B, but one C. neoformans var. neoformans and three C. neoformans var. gattii isolates were resistant to fluconazole. The presence of C. neoformans var. gattii fluconazole resistant indicates the importance of determining not only the variety of C. neoformans infecting the patients but also measuring the MIC of the isolate in order to properly orient treatment.

Antifungal activity from Ocimum gratissimum L. towards Cryptococcus neoformans

Cryptococcal infection had an increased incidence in last years due to the explosion of acquired immune deficiency syndrome epidemic and by using new and effective immunosuppressive agents. The currently antifungal therapies used such as amphotericin B, fluconazole, and itraconazole have certain limitations due to side effects and emergence of resistant strains. So, a permanent search to find new drugs for cryptococcosis treatment is essential. Ocimum gratissimum, plant known as alfavaca (Labiatae family), has been reported earlier with in vitro activity against some bacteria and dermatophytes. In our work, we study the in vitro activity of the ethanolic crude extract, ethyl acetate, hexane, and chloroformic fractions, essential oil, and eugenol of O. gratissimum using an agar dilution susceptibility method towards 25 isolates of Cryptococcus neoformans. All the extracts of O. gratissimum studied showed activity in vitro towards C. neoformans. Based on the minimal inhibitory concentration values the most significant results were obtained with chloroformic fraction and eugenol. It was observed that chloroformic fraction inhibited 23 isolates (92%) of C. neoformans at a concentration of 62.5 µg/ml and eugenol inhibited 4 isolates (16%) at a concentration of 0.9 µg/ml. This screening may be the basis for the study of O. gratissimum as a possible antifungal agent.

Superoxide dismutase in Cryptococcus neoformans varieties gattii, grubi, and neoformans

Some clear dissimilarities occur among the varieties of Cryptococcus neoformans but there are few studies about the differences among individual yeast antioxidant enzymes. The total superoxide dismutase (SOD) activities and the copper, zinc-depend SOD (Cu,ZnSOD) and manganese-dependent SOD (MnSOD) isoenzymes of five reference C. neoformans strains belonged to A, B, C, AD and D serotypes (Table I) and other nine C. neoformans isolates (Table II) were determined. There were significant differences (p < 0.01 and p < 0.05) in total SOD activity among the varietie gattii (serotype C) and the other varieties. Cu,ZnSOD showed difference (p < 0.05) between A and D serotypes. These results point out a variety and serotype-independent SOD activity in C. neoformans reference strains and the other isolates that were evaluated.

Evaluation of phenotypic and genotypic alterations induced by long periods of subculturing of Cryptococcus neoformans strains

Cryptococcus neoformans is an encapsulated fungal organism that can cause disease in apparently immunocompetent, as well as immunocompromised, hosts. Since 1930, successive subculture has been used to preserve C. neoformans isolates in our Fungus Collection. In the 1970s, some of these Fungus Collection samples were selected to be subjected to a different methods of maintenance - that of lyophilized. Our objective was to analyze C. neoformans isolates in order to make a comparative evaluation between these two methods of preservation. The overall aim of this study was to qualify the preservation technique used in our mycology laboratory since the technique used might affect the survival, stability and purity of the primary isolates in culture. The samples were analyzed using classical mycology methods and using the randomly amplified polymorphic DNA technique In the analysis of phenotypes and genotypes, the typical characteristics of C. neoformans were found to differ in relation to the different methods of preservation employed. The aim of this study was to demonstrate the importance of selecting the appropriate method of preservation for fungus collections. This selection can affect the survival and purity of the cultures, and preserve the stability of their physiological, biochemical, and genetic characteristics.

Molecular diversity of serial Cryptococcus neoformans isolates from AIDS patients in the city of São Paulo, Brazil

Despite highly active anti-retroviral therapy, cryptococcal meningoencephalitis is the second most prevalent neurological disease in Brazilian AIDS patients, being frequently a defining condition with several episodes. As knowledge of Cryptococcus neoformans isolates in the same episode is critical for understanding why some patients develop several episodes, we investigated the genotype characteristics of C. neoformans isolates in two different situations. By pulsed field gel electrophoresis and random amplifield polymorphic DNA analysis, 54 isolates from 12 patients with AIDS and cryptococcosis were analyzed. Group 1 comprised 39 isolates from nine patients with a single episode and hospitalization. Group 2 comprised 15 isolates from three patients with two episodes and hospitalizations. Except for three patients from group 1 probably infected with a single C. neoformans isolate, the other nine patients probably were infected with multiple isolates selected in different collection periods, or the infecting isolate might have underwent mutation to adapt and survive the host immune system and/or the antifungal therapy. However, the three patients from group 2 presented genetic diversity among isolates collected in both hospitalizations, possibly having hosted the initial isolate in both periods. These data, emphasize that Cryptococcus diversity in infection can contribute to strategies of treatment and prevention of cryptococcosis.

Regional pattern of the molecular types of Cryptococcus neoformans and Cryptococcus gattii in Brazil

The molecular types of 443 Brazilian isolates of Cryptococcus neoformans and Cryptococcus gattii were analyzed to determine their geographic distribution within Brazil and their underlying host conditions. The following data, imported from previous epidemiological studies as well as two culture collections, were analyzed for: place of isolation, source (clinical or environmental), host risk factors, species, serotype, mating type, and molecular type. Molecular typing by PCR-fingerprinting using primers for the minisatellite-specific core sequence of the wild-type phage M13 or microsatellites [(GACA)4, (GTG)5], restriction fragment length polymorphism of URA5 gene analysis, and/or amplified fragment length polymorphism (AFLP) identified eight major genotypes: VNI/AFLP1, VNII/AFLP1A, VNIII/AFLP2, and VNIV/AFLP3 for C. neoformans, and VGI/AFLP4, VGII/AFLP6, VGIII/AFLP5, and VGIV/AFLP7 for C. gattii. The most common molecular type found in Brazil was VNI (64%), followed by VGII (21%), VNII (5%), VGIII (4%), VGI and VNIV (3% each), and VNIII (< 1%). Primary cryptococcosis caused by the molecular type VGII (serotype B, MAT) prevails in immunocompetent hosts in the North and Northeast regions, disclosing an endemic regional pattern for this specific molecular type in the Northern Brazil.

First isolation of Cryptococcus gattii molecular type VGII and Cryptococcus neoformans molecular type VNI from environmental sources in the city of Belém, Pará, Brazil

Cryptococcus neoformans and Cryptococcus gattii are important agents of meningoencephalitis in humans in the city of Belém. This clinical data suggests that the region may be a highly endemic area for the pathogenic Cryptococcus species within the state of Pará (PA), Northern Brazil. Preliminary analysis of 11 environmental samples from the city of Belém showed two positive locations, including a hollow of a kassod tree (Senna siamea) colonized simultaneously by C. gattii molecular type VGII and C. neoformans molecular type VNI, and a birdcage in a commercial aviary positive for C. neoformans, molecular type VNI. This is the first evidence of an environmental occurrence of molecular types VNI and VGII in PA.

Cryptococcus neoformans var. grubii - Pathogenicity of environmental isolates correlated to virulence factors, susceptibility to fluconazole and molecular profile

The pathogenicity of Cryptococcus neoformans is heterogeneous and is associated with the expression of virulence factors. This study aimed to correlate the pathogenicity of C. neoformans var. grubii in BALB/c mice with in vitro virulence factors, fluconazole minimal inhibitory concentrations (MICs) and molecular profiles, before and after animal passage. Ten environmental isolates and one ATCC strain of C. neoformans var. grubii mating type α were evaluated. Most isolates (91%) killed 50% or more of the infected animals by day 24 postinfection and were recovered from the lungs and brains of surviving animals on days 7 and 14 postinfection. The burden of yeast in the lungs was more variable than that in the brain. The differences in the expression of virulence factors (growth at 37ºC, presence and size of the capsule and production of melanin, urease, proteinase and phospholipase) by most isolates pre and postpassage in animals were not statistically significant. The fluconazole MICs in postpassaged lines differed by a one-dilution from the MIC of the corresponding prepassaged line for six isolates. Using molecular typing [polymerase chain reaction-fingerprinting with (GACA)4 and M13], eight isolates were identified as VNI and three as VNII. We concluded that different isolates with the same molecular and phenotypic profiles, including isolates that are markedly hypervirulent, span a wide range of virulence and there were no changes in virulence factors in the postpassaged lines when compared with the corresponding nonpassaged lines.

Genotypes of Cryptococcus neoformans and Cryptococcus gattii as agents of endemic cryptococcosis in Teresina, Piauí (northeastern Brazil)

Throughout Brazil, Cryptococcus neoformans is the cause of cryptococcosis, whereas Cryptococcus gattii is endemic to the northern and northeastern states. In this study, the molecular types of 63 cryptococcal isolates recovered from the cerebrospinal fluid of meningitis patients diagnosed between 2008-2010 in Teresina, Piauí, Brazil, were analysed. Out of the 63 patients, 37 (58.7%) were human immunodeficiency virus (HIV)-positive and 26 (41.3%) were HIV-negative. URA5-restriction fragment length polymorphism analysis identified 37/63 (58.7%) isolates as the C. neoformans VNI genotype, predominantly in HIV-positive patients (32/37, 86.5%), and 24/63 (38.1%) as the C. gattii VGII genotype, mostly in HIV-negative patients (21/26, 80.8%). The occurrence of C. gattii VGII in six apparently healthy children and in seven adolescents/young adults in this region reaffirms the endemic occurrence of C. gattii VGII-induced primary cryptococcosis and early cryptococcal infection. Lethality occurred in 18/37 (48.6%) of the HIV-positive subjects and in 13/26 (50%) of the HIV-negative patients. Our results provide new information on the molecular epidemiology of C. neoformans and C. gattii in Brazilian endemic areas.

Cryptococcus neoformans carried by Odontomachus bauri ants

Cryptococcus neoformans is the most common causative agent of cryptococcosis worldwide. Although this fungus has been isolated from a variety of organic substrates, several studies suggest that hollow trees constitute an important natural niche for C. neoformans. A previously surveyed hollow of a living pink shower tree (Cassia grandis) positive for C. neoformans in the city of Rio de Janeiro, Brazil, was chosen for further investigation. Odontomachus bauri ants (trap-jaw ants) found inside the hollow were collected for evaluation as possible carriers of Cryptococcus spp. Two out of 10 ants were found to carry phenoloxidase-positive colonies identified as C. neoformans molecular types VNI and VNII. The ants may have acted as a mechanical vector of C. neoformans and possibly contributed to the dispersal of the fungi from one substrate to another. To the best of our knowledge, this is the first report on the association of C. neoformans with ants of the genus Odontomachus.