Atividade antibacteriana de óleos essenciais e extratos vegetais sobre o desenvolvimento de Ralstonia Solanacearum em mudas de bananeira

O presente trabalho teve como objetivo determinar a atividade de diferentes concentrações de óleos essenciais e extratos vegetais sobre o crescimento de Ralstonia solanacearum e a incidência do moko em mudas de bananeira. Foram avaliadas diferentes concentrações de óleos essenciais de citronela, eucalipto citriodora, cravo-da-índia e gengibre: 1,25%; 3,5%; 3,75% e 5% e de extratos de cravo-da-índia, gengibre, canela e melão-de-são-caetano: 5%, 10%, 15% e 20%, medindo-se o halo de inibição da bactéria, após 48 horas. O óleo de eucalipto e os extratos de melão-de-são-caetano, cravo-da-índia e canela não apresentaram efeito sobre a bactéria. O extrato de gengibre, os óleos de citronela, de cravo e de gengibre inibiram o crescimento de R. solanacearumem todas as concentrações testadas, destacando-se o óleo de cravo como o melhor tratamento, seguido por extrato de gengibre. Mudas de bananeira foram pulverizadas com os óleos de citronela, gengibre e cravo (3,75%) e extrato de gengibre (20%), aplicando-se 10 ml da solução por planta. Oito dias após, as mudas foram inoculadas com o patógeno (10(8) cel/mL). O óleo de citronela proporcionou o melhor resultado, com 100% de controle da doença, porém as folhas das plantas, com esse tratamento, apresentaram sintomas de fitotoxidez. O óleo e o extrato de gengibre foram semelhantes na eficiência de controle do moko (50%), e o óleo de cravo apresentou menor eficiência (25%).

Integrated regulation of the type III secretion system and other virulence determinants in Ralstonia solanacearum

In many plant and animal bacterial pathogens, the Type III secretion system (TTSS) that directly translocates effector proteins into the eukaryotic host cells is essential for the development of disease. In all species studied, the transcription of the TTSS and most of its effector substrates is tightly regulated by a succession of consecutively activated regulators. However, the whole genetic programme driven by these regulatory cascades is still unknown, especially in bacterial plant pathogens. Here, we have characterised the programme triggered by HrpG, a host-responsive regulator of the TTSS activation cascade in the plant pathogen Ralstonia solanacearum. We show through genome-wide expression analysis that, in addition to the TTSS, HrpG controls the expression of a previously undescribed TTSS-independent pathway that includes a number of other virulence determinants and genes likely involved in adaptation to life in the host. Functional studies revealed that this second pathway co-ordinates the bacterial production of plant cell wall-degrading enzymes, exopolysaccharide, and the phytohormones ethylene and auxin. We provide experimental evidence that these activities contribute to pathogenicity. We also show that the ethylene produced by R. solanacearum is able to modulate the expression of host genes and can therefore interfere with the signalling of plant defence responses. These results provide a new, integrated view of plant bacterial pathogenicity, where a common regulator activates synchronously upon infection the TTSS, other virulence determinants and a number of adaptive functions, which act co-operatively to cause disease.

The awr gene family encodes a novel class of Ralstonia solanacearum type III effectors displaying virulence and avirulence activities

We present here the characterization of a new gene family, awr, found in all sequenced Ralstonia solanacearum strains and in other bacterial pathogens. We demonstrate that the five paralogues in strain GMI1000 encode type III-secreted effectors and that deletion of all awr genes severely impairs its capacity to multiply in natural host plants. Complementation studies show that the AWR (alanine-tryptophanarginine tryad) effectors display some functional redundancy, although AWR2 is the major contributor to virulence. In contrast, the strain devoid of all awr genes (¿awr1-5) exhibits enhanced pathogenicity on Arabidopsis plants. A gain-of-function approach expressing AWR in Pseudomonas syringae pv. tomato DC3000 proves that this is likely due to effector recognition, because AWR5 and AWR4 restrict growth of this bacterium in Arabidopsis. Transient overexpression of AWR in nonhost tobacco species caused macroscopic cell death to varying extents, which, in the case of AWR5, shows characteristics of a typical hypersensitive response. Our work demonstrates that AWR, which show no similarity to any protein with known function, can specify either virulence or avirulence in the interaction of R. solanacearum with its plant hosts.

A chromosomal insertion toolbox for promoter probing, mutant complementation and pathogenicity studies in Ralstonia solanacearum

We describe here the construction of a delivery system for stable and directed insertion of gene constructs in a permissive chromosomal site of the bacterial wilt pathogen Ralstonia solanacearum. The system consists of a collection of suicide vectors the Ralstonia chromosome (pRC) series that carry an integration element flanked by transcription terminators and two sequences of homology to the chromosome of strain GMI1000, where the integration element is inserted through a double recombination event. Unique restriction enzyme sites and a GATEWAY cassette enable cloning of any promoter::gene combination in the integration element. Variants endowed with different selectable antibiotic resistance genes and promoter::gene combinations are described. We show that the system can be readily used in GMI1000 and adapted to other R. solanacearum strains using an accessory plasmid. We prove that the pRC system can be employed to complement a deletion mutation with a single copy of the native gene, and to measure transcription of selected promoters in monocopy both in vitro and in planta. Finally, the system has been used to purify and study secretion type III effectors. These novel genetic tools will be particularly useful for the construction of recombinant bacteria that maintain inserted genes or reporter fusions in competitive situations (i.e., during plant infection).

Ralstonia solanacearum, a widespread bacterial plant pathogen in the post-genomic era

Ralstonia solanacearum is a soil-borne bacterium causing the widespread disease known as bacterial wilt. Ralstonia solanacearum is also the causal agent of Moko disease of banana and brown rot of potato. Since the last R. solanacearum pathogen profile was published 10 years ago, studies concerning this plant pathogen have taken a genomic and post-genomic direction. This was pioneered by the first sequenced and annotated genome for a major plant bacterial pathogen and followed by many more genomes in subsequent years. All molecular features studied now have a genomic flavour. In the future, this will help in connecting the classical field of pathology and diversity studies with the gene content of specific strains. In this review, we summarize the recent research on this bacterial pathogen, including strain classification, host range, pathogenicity determinants, regulation of virulence genes, type III effector repertoire, effector-triggered immunity, plant signalling in response to R. solanacearum, as well as a review of different new pathosystems.

Freqüência de biovares de ralstonia solanacearum em diferentes cultivares e épocas de cultivo de batata no rio grande do sul

A presença das biovares I e/ou II de Ralstonia solanacearum em uma lavoura de batatas (Solanum tuberosum) tem influência direta no sucesso das medidas adotadas para controlar a murcha bacteriana. As biovares diferem entre si em relação à agressividade, latência e sobrevivência. Assim, um experimento de campo foi conduzido em uma área naturalmente infestada em duas épocas de cultivo com os objetivos de verificar (1) a incidência de biovares I e/ou II, (2) a relação entre biovar e época de plantio e (3) a relação entre biovar e cultivar de batata. Os isolados obtidos de plantas das cultivares Achat, Baronesa, Elvira, Macaca, Monte Bonito e Trapeira foram identificados como biovar I ou II através da PCR, utilizando os oligonucleotídeos iniciadores T3A e T5A. Ambas as biovares foram encontradas na área naturalmente infestada. De 73 isolados de R. solanacearum, 94,5% foram identificados como biovar II e 5,5% como biovar I. A biovar II foi isolada dos cultivos de primavera e de outono, independente da cultivar, mas a I apenas do cultivo de primavera e de plantas assintomáticas das cultivares Achat e Macaca. A maior população da biovar I nestas duas cultivares pode ser uma evidência da possível relação entre biovar e cultivar.

Ocorrência das biovares 1 e 2 de Ralstonia solanacearum em lavouras de batata no estado do Rio Grande do Sul

Com a finalidade de verificar a ocorrência e a distribuição de biovares de Ralstonia solanacearum no Estado do Rio Grande do Sul, plantas com sintomas de murcha-bacteriana foram coletadas, na primavera de 1999, em 25 lavouras de batata (Solanum tuberosum) em dez municípios das quatro áreas de produção: Serra do Nordeste, Planalto Superior, Depressão Central e Grandes Lagoas. A determinação da espécie foi feita com teste sorológico através de ELISA e da biovar com base no metabolismo oxidativo de açúcares e álcoois. Noventa e quatro porcento dos 490 isolados foram identificados como biovar 2. A ocorrência da biovar 1 foi registrada na Serra do Nordeste e Depressão Central. A ocorrência das biovares não mostrou relação com a temperatura média local ou cultivar de batata.

Caracterização de isolados de Ralstonia solanacearum obtidos de tomateiros em várzea e em terra firme, no Estado do Amazonas

A variabilidade de isolados de Ralstonia solanacearum, provenientes de tomateiros (Lycopersicon esculentum) do Estado do Amazonas, foi estudada com relação à agressividade, à sensibilidade a bacteriocinas e às características bioquímicas. Três experimentos foram estabelecidos em áreas naturalmente infestadas com R. solanacearum sendo um em terra firme, em 1998, e dois em uma mesma área de várzea, em 1998 e em 2000. Em cada experimento, 200 mudas de tomateiros da cv Yoshimatsu (resistente) e 200 da cv. Santa Cruz Kada (suscetível) foram plantadas alternadas em um espaçamento de 1 m entre fileiras e 0,5 m entre plantas. Semanalmente, isolou-se a bactéria, a partir de plantas apresentando sintomas de murcha. Obtiveram-se, nos três experimentos, 267 isolados pertencentes aos biovares 1 (67,8%) e 3 (32,2%). Em terra firme, 80,4% dos isolados obtidos eram do biovar 1 enquanto que em várzea, os isolados do biovar 1 foram 37,4 e 87,8%, nos ensaios de 1998 e de 2000, respectivamente. Com base na sensibilidade a bacteriocinas os isolados foram divididos em sete grupos, sendo que dois deles englobaram 80,5% do total dos isolados. Através da reação apresentada por 15 plantas de tomate, de berinjela (Solanum melongena) e de pimentão (Capsicum annuum) , inoculadas um mês após a semeadura, a agressividade de isolados selecionados foi avaliada. Os isolados do biovar 1 foram mais agressivos sobre tomateiros que os do biovar 3. Estes últimos, no entanto, foram mais agressivos sobre pimentão e berinjela. Em várzea, as plantas da cv. Yoshimatsu tiveram 50,5% de mortalidade contra 22,5%, em terra firme, comprovando a importância do fator ambiente na ocorrência da doença.

Colonização de raízes de plantas daninhas cultivadas in vitro e em vasos por Ralstonia solanacearum, biovares 1, 2 e 3

No presente trabalho, a colonização de raízes de espécies de plantas daninhas por estirpes das biovares 1, 2 e 3 de Ralstonia solanacearum foi avaliada in vitro e em casa de vegetação. Na condição in vitro, sementes foram submetidas à quebra de dormência, desinfestadas e semeadas em meio de cultura Murashige & Skoog (MS) modificado. A bactéria foi inoculada, colocando uma porção da massa no meio MS ao lado das plântulas. A colonização de raízes foi avaliada visualmente de acordo com a concentração de bactérias ao redor e na extensão das raízes e comparada a uma escala diagramática que variou de 1 a 4. Foi analisada a área abaixo da curva de colonização de raízes. Em casa de vegetação, populações de seis variantes das mesmas biovares foram quantificadas a partir de raízes de plantas daninhas. A bactéria foi inoculada nas raízes sem ferimentos, vertendo-se 100 ml da suspensão bacteriana na concentração de aproximadamente 10(8) ufc/ml por vaso. A avaliação foi feita aos 35 dias após a inoculação através do plaqueamento dos extratos diluídos das raízes e contagem posterior das colônias. Foram observados diferentes sintomas e níveis de colonização de raízes pela bactéria nas espécies de plantas estudadas. Os dois métodos permitiram o estudo da colonização de raízes com resultados análogos, sugerindo que ambos permitem obter resultados similares. Entretanto, a técnica in vitro é promissora como método auxiliar para a avaliação da colonização radicular de grande número de espécies botânicas por diferentes isolados de R. solanacearum.

Avaliação da solarização do solo para o controle de Ralstonia solanacearum

O presente trabalho avaliou o emprego da solarização como uma alternativa para o controle da murcha bacteriana, causada por Ralstonia solanacearum, em amostras de solo infestado com o patógeno, dispostas em bolsas de náilon e enterradas em parcelas solarizadas ou não. Dois experimentos foram instalados, um em Campinas (SP), de fevereiro a abril de 2001, e o outro em Piracicaba (SP), de dezembro de 2001 a janeiro de 2002. Os ensaios foram efetuados em delineamento inteiramente casualizado, esquema fatorial, com quatro repetições, tendo cada parcela 4 x 4 m. Os fatores avaliados foram a solarização (com ou sem), efetuada com filme plástico transparente de 100 µm de espessura, o período de tratamento (30 e 60 dias e 37 e 60 dias para o primeiro e o segundo experimentos, respectivamente) e a profundidade de colocação das amostras (10 e 20 cm), fator verificado apenas no segundo ensaio. Após os períodos estipulados de solarização, o solo de cada bolsa foi colocado em vasos, para os quais foram transplantadas mudas de tomateiro (Lycopersicon esculentum). No solo não solarizado, em ambos os experimentos, 43 a 100% dos tomateiros murcharam. No segundo experimento, 6 a 22% dos tomateiros murcharam no solo solarizado por 37 dias. Entretanto não foram detectadas plantas murchas nas parcelas solarizadas do primeiro experimento e no segundo ensaio nenhum tomateiro murchou solo solarizado por 60 dias, nas duas profundidades estudadas. Os resultados indicam que a solarização é uma técnica promissora para o controle de R. solanacearum.

Caracterização de estirpes de Ralstonia solanacearum isoladas de plantas de batata com murcha bacteriana, por PCR-Rep e RAPD

Considerado como um dos mais sérios patógenos da batata (Solanum tuberosum), em regiões de clima tropical, subtropical, assim como em zonas mais quentes de clima temperado, Ralstonia solanacearum é uma espécie com significativa diversidade genética. Ela é caracterizada em um sistema binário de raças e biovares, com base nas espécies hospedeiras e na capacidade de utilizar diferentes fontes de carbono. A tentativa de utilizar a resistência genética como forma de controle de R. solanacearum não tem demonstrado estabilidade, devido a alterações climáticas nas diferentes regiões e a variabilidade das estirpes do patógeno. Devido às características epidemiológicas diferentes para essas biovares, estirpes da biovar 2 são mais factíveis de serem erradicadas em um sistema de controle integrado. Em um levantamento realizado em quatro regiões produtoras de batata do Rio Grande do Sul, foram obtidos isolados de R. solanacearum de 25 lavouras de dez municípios. Após a análise bioquímica dos isolados verificou-se a presença das biovares 1 e 2, com predominância da última. Os isolados obtidos foram submetidos à avaliação da variabilidade genética por PCR, utilizando seqüências repetitivas ERIC e BOX e oligonucleotídeos aleatórios (RAPD). A PCR-ERIC e BOX puderam diferenciar claramente as biovares 1 e 2. Porém, ambas não detectaram variabilidade entre isolados da biovar 2 e apenas PCR-BOX detectou variabilidade entre isolados da biovar 1. Já através de RAPD demonstrou-se claramente a separação das biovares verificando-se que os mesmos apresentam um perfil característico dependente da região da qual os isolados foram obtidos.

Ralstonia solanacearum em viveiros clonais de eucalipto no Brasil

A incidência da murcha bacteriana, causada por Ralstonia solanacearum, em viveiros clonais de eucalipto, no período de abril a setembro de 2005, resultou no descarte de cerca de 553.991 minicepas, 6.837.691 propágulos na fase de enraizamento e 11.266.819 mudas, nos Estados da Bahia, do Espírito Santo, do Maranhão, de Minas Gerais e do Pará, totalizando um prejuízo estimado em, no mínimo, seis milhões de reais (US$ 2,7 milhões). Em minijardim clonal, a doença caracteriza-se por necrose foliar, escurecimento anelar ou completo do lenho, murcha e morte de minicepas. Os sintomas na parte aérea são similares à morte gradual de minicepas submetidas a podas drásticas ou com sistema radicular malformado. Na fase de enraizamento, miniestacas infectadas podem apresentar arroxeamento das nervuras do limbo foliar e podridão. No campo, a doença caracteriza-se por bronzeamento e necrose foliar, desfolha basal, ascendente escurecimento interno do lenho e morte da planta, geralmente a partir do quarto mês após o transplantio. Os sintomas geralmente se agravam em árvores com enovelamento de raízes e afogamento de coleto. A etiologia da doença foi confirmada por meio de testes de exsudação, microscopia de varredura, isolamento da bactéria, análises de PCR/RFLP, reação de hipersensibilidade (HR) em mudas de fumo, testes de patogenicidade em plântulas de eucalipto e tomate e re-isolamento da bactéria. Como o sistema de produção de mudas clonais de eucalipto é altamente favorável à multiplicação bacteriana e na falta de conhecimento sobre a resistência genética e de outras estratégias de controle da doença, é essencial evitar a introdução da bactéria em viveiros.

Epidemiological analysis of clones and cultivars of potato in soil naturally infested with Ralstonia solanacearum biovar 2

The objectives of this study were to evaluate the progress of Ralstonia solanacearum bacterial potato wilt biovar 2 (race 3) in 14 potato (Solanum tuberosum L.) cultivars or clones, the resistance of potato clone MB 03 (selected in Brasília, Brazil) to race 1 of R. solanacearum, and the occurrence of the pathogen in tubers harvested from asymptomatic potato plants. During the spring (September to the end of November in the southern hemisphere) of 1999 and 2000, 14 cultivars or clones were grown in a field naturally infested with R. solanacearum biovar 2, in Caxias do Sul, RS. The number of wilted potato plants was recorded each week and a disease progress curve plotted, the resistance of the potato genotypes to bacterial wilt being evaluated by determining the area under the curve. Various models were evaluated to fit the curves, with the logistic model being the best fit. At the end of each growing season tubers produced by asymptomatic plants were harvested and stored until budding and then tested for the presence of R. solanacearum. Cultivar Cruza 148 and clone MB 03 were the most resistant but both showed tubers with latent infections. The epidemiological implications of the incidence of R. solanacearum biovar 2 (race 3) in potato crops, as well as the resistance of certain genotypes that may harbor latent infections, are important aspects to be considered in the integrated management of bacterial wilt.