Zur Bedeutung bindungstheoretischer Erkenntnisse für die logopädische Praxis

Praxisbeobachtungen und der informelle Erfahrungsaustausch mit Berufskollegen implizieren immer wieder einen kausalen Zusammenhang zwischen Spracherwerbsstörungen und unzureichenden Bindungserfahrungen, der jedoch in der Wissenschaft bislang nicht eindeutig nachgewiesen werden konnte. Thema dieser Masterarbeit ist daher die Darstellung und Diskussion des aktuellen Forschungsstandes zu Zusammenhängen zwischen Bindung und Sprachentwicklung. Bindungstheoretisches, entwicklungspsychologisches, sprachtherapeutisches und psychodynamisches Wissen wird dazu anhand einer Literaturrecherche zusammengefasst und analysiert. Empirische und theoretische Erkenntnisse sowie die Auswertung eigener Praxisbeispiele bestätigen den Anfangsverdacht, dass Zusammenhänge zwischen Bindungsfähigkeit und Sprachkompetenz bestehen. Neben dieser gewonnenen Erkenntnis zum Spracherwerb und zu Spracherwerbsstörungen bietet die Integration bindungstheoretischer Konzepte auch Chancen zum Verständnis schwieriger Verhaltens- und Interaktionsmuster. Diese theoriegeleiteten Erklärungsansätze sind für den logopädischen Behandlungsprozess und Therapieerfolg bedeutsam. Die in dieser Masterarbeit vorgenommene Bestandsaufnahme stellt eine fundierte Basis für weiterführende themenbezogene Auseinandersetzungen, Diskussionen und Forschungsarbeiten dar, um den Erkenntnisgewinn auch in der logopädischen Praxis effektiv zu nutzen und einzusetzen.

Untersuchung des humanen Proteins NF110 als Bindungspartner viraler RNAs

In der vorliegenden Masterarbeit wurde das Protein nuclear factor 110 (NF110) in vitro rückgefaltet, chromatographisch gereinigt, durch den Zusatz von L-Arginin stabilisiert und seine Affinität gegenüber RNAs untersucht. Das Ausgangsmaterial wurde mittels Dialyse zurückgefaltet und über drei aufeinander folgende Chromatographieschritte gereinigt: mittels Kationenaustauschchromatographie (capture) zur Entfernung von Fremdproteinen, Größenausschlusschromatographie (intermediate) zur Trennung des monomeren Proteins von höher-oligomeren Spezies und der Affinitätschromatographie (polishing). Diese Proteinlösung wurde unter Zusatz von 500 mM L-Arginin gelagert um eine Proteinaggregation zu unterbinden. Durch Streulichtmessungen und eine analytische Ultrazentrifugation konnte erfolgreich nachgewiesen werden, dass NF110 erst in Puffern mit mindestens 200 mM L-Arginin stabil vorliegt. Im Rahmen der vorliegenden Arbeit konnte erfolgreich bestimmt werden, dass NF110 zwischen doppelsträngiger RNA und DNA diskriminiert, während es gegenüber einzel- bzw. doppelsträngiger RNA ähnlich affin ist. Dies stellt einen großen Unterschied zu NF90 dar. Diese C-terminal verkürzte Variante interagiert mit einzelsträngiger RNA in sehr geringerem Umfang als mit doppelsträngiger RNA (Schmidt, 2015). Daher kann vermutet werden, dass der C-Terminus, insbesondere das dort befindliche GQSY-Motiv, für die Spezifität gegenüber den RNAs verantwortlich ist. Ein weiterer Fokus der Arbeit lag auf dem Einfluss von L-Arginin bei der RNA-Bindung. Mit Hilfe einer linearen freien Enthalpiebeziehung (LFER) konnte so eine Dissoziationskonstante für nicht aggregierendes NF110 ohne L-Arginin ermittelt werden. Außerdem wurde ersichtlich, dass dieser Stabilisator zwar die Aggregation hemmt, aber nur marginal die RNA-Bindung des Proteins beeinflusst

HelF, a suppressor of RNAi mediated gene silencing in Dictyostelium discoideum

RNA interference (RNAi) is a recently discovered process, in which double stranded RNA (dsRNA) triggers the homology-dependant degradation of cognate messenger RNA (mRNA). In a search for new components of the RNAi machinery in Dictyostelium, a new gene was identified, which was called helF. HelF is a putative RNA helicase, which shows a high homology to the helicase domain of Dicer, to the helicase domain of Dictyostelium RdRP and to the C. elegans gene drh-1, that codes for a dicer related DExH-box RNA helicase, which is required for RNAi. The aim of the present Ph.D. work was to investigate the role of HelF in PTGS, either induced by RNAi or asRNA. A genomic disruption of the helF gene was performed, which resulted in a distinct mutant morphology in late development. The cellular localization of the protein was elucidated by creating a HelF-GFP fusion protein, which was found to be localized in speckles in the nucleus. The involvement of HelF in the RNAi mechanism was studied. For this purpose, RNAi was induced by transformation of RNAi hairpin constructs against four endogenous genes in wild type and HelF- cells. The silencing efficiency was strongly enhanced in the HelF K.O. strain in comparison with the wild type. One gene, which could not be silenced in the wild type background, was successfully silenced in HelF-. When the helF gene was disrupted in a secondary transformation in a non-silenced strain, the silencing efficiency was strongly improved, a phenomenon named here “retrosilencing”. Transcriptional run-on experiments revealed that the enhanced gene silencing in HelF- was a posttranscriptional event, and that the silencing efficiency depended on the transcription levels of hairpin RNAs. In HelF-, the threshold level of hairpin transcription required for efficient silencing was dramatically lowered. The RNAi-mediated silencing was accompanied by the production of siRNAs; however, their amount did not depend on the level of hairpin transcription. These results indicated that HelF is a natural suppressor of RNAi in Dictyostelium. In contrast, asRNA mediated gene silencing was not enhanced in the HelF K.O, as shown for three tested genes. These results confirmed previous observations (H. Martens and W. Nellen, unpublished) that although similar, RNAi and asRNA mediated gene silencing mechanisms differ in their requirements for specific proteins. In order to characterize the function of the HelF protein on a molecular level and to study its interactions with other RNAi components, in vitro experiments were performed. Besides the DEAH-helicase domain, HelF contains a double-stranded RNA binding domain (dsRBD) at its N-terminus, which showed high similarity to the dsRBD domain of Dicer A from Dictyostelium. The ability of the recombinant dsRBDs from HelF and Dicer A to bind dsRNA was examined and compared. It was shown by gel-shift assays that both HelF-dsRBD and Dicer-dsRBD could bind directly to long dsRNAs. However, HelF-dsRBD bound more efficiently to dsRNA with imperfect matches than to perfect dsRNA. Both dsRBDs bound specifically to a pre-miRNA substrate (pre-let-7). The results suggested that most probably there were two binding sites for the proteins on the pre-miRNA substrate. Moreover, it was shown that HelF-dsRBD and Dicer-dsRBD have siRNA-binding activity. The affinities of the two dsRBDs to the pre-let-7 substrate were also examined by plasmon surface resonance analyses, which revealed a 9-fold higher binding affinity of the Dicer-dsRBD to pre-let-7 compared to that of the HelF-dsRBD. The binding of HelF-dsRBD to the pre-let-7 was impaired in the presence of Mg2+, while the Dicer-dsRBD interaction with pre-let-7 was not influenced by the presence of Mg2+. The results obtained in this thesis can be used to postulate a model for HelF function. In this, HelF acts as a nuclear suppressor of RNAi in wild type cells by recognition and binding of dsRNA substrates. The protein might act as a surveillance system to avoid RNAi initiation by fortuitous dsRNA formation or low abundance of dsRNA trigger. If the protein acts as an RNA helicase, it could unwind fold-back structures in the nucleus and thus lead to decreased RNAi efficiency. A knock-out of HelF would result in initiation of the RNAi pathway even by low levels of dsRNA. The exact molecular function of the protein in the RNAi mechanism still has to be elucidated. RNA interferenz (RNAi) ist ein in jüngster Zeit entdeckter Mechanismus, bei dem doppelsträngige RNA Moleküle (dsRNA) eine Homologie-abhängige Degradation einer verwandten messenger-RNA (mRNA) auslösen. Auf der Suche nach neuen Komponenten der RNAi-Maschinerie in Dictyostelium konnte ein neues Gen (helF) identifiziert werden. HelF ist eine putative RNA-Helikase mit einer hohen Homologie zur Helikasedomäne der bekannten Dicerproteine, der Helikasedomäne der Dictyostelium RdRP und zu dem C. elegans Gen drh-1, welches für eine Dicer-bezogene DExH-box RNA Helikase codiert, die am RNAi-Mechanismus beteiligt ist. Das Ziel dieser Arbeit war es, die Funktion von HelF im Zusammenhang des RNAi oder asRNA induzierten PTGS zu untersuchen. Es wurde eine Unterbrechung des helF-Gens auf genomischer Ebene (K.O.) vorgenommen, was bei den Mutanten zu einer veränderten Morphologie in der späten Entwicklung führte. Die Lokalisation des Proteins in der Zelle konnte mit Hilfe einer GFP-Fusion analysiert werden und kleinen Bereichen innerhalb des Nukleus zugewiesen werden. Im Weiteren wurde der Einfluss von HelF auf den RNAi-Mechanismus untersucht. Zu diesem Zweck wurde RNAi durch Einbringen von RNAi Hairpin-Konstrukten gegen vier endogene Gene im Wiltypstamm und der HelF--Mutante induziert. Im Vergleich zum Wildtypstamm konnte im HelF--Mutantenstamm eine stark erhöhte „Silencing“-Effizienz nachgewiesen werden. Ein Gen, welches nach RNAi Initiation im Wildtypstamm unverändert blieb, konnte im HelF--Mutantenstamm erfolgreich stillgelegt werden. Durch sekundäres Einführen einer Gendisruption im helF-Locus in einen Stamm, in welchem ein Gen nicht stillgelegt werden konnte, wurde die Effizienz des Stilllegens deutlich erhöht. Dieses Phänomen wurde hier erstmals als „Retrosilencing“ beschrieben. Mit Hilfe von transkriptionellen run-on Experimenten konnte belegt werden, dass es sich bei dieser erhöhten Stilllegungseffizienz um ein posttranskriptionelles Ereignis handelte, wobei die Stillegungseffizienz von der Transkriptionsstärke der Hairpin RNAs abhängt. Für die HelF--Mutanten konnte gezeigt werden, dass der Schwellenwert zum Auslösen eines effizienten Stillegens dramatisch abgesenkt war. Obwohl die RNAi-vermittelte Genstilllegung immer mit der Produktion von siRNAs einhergeht, war die Menge der siRNAs nicht abhängig von dem Expressionsniveau des Hairpin-Konstruktes. Diese Ergebnisse legen nahe, dass es sich bei der HelF um einen natürlichen Suppressor des RNAi-Mechanismus in Dictyostelium handelt. Im Gegensatz hierzu war die as-vermittelte Stilllegung von drei untersuchten Genen im HelF-K.O. im Vergleich zum Wildyp unverändert. Diese Ergebnisse bestätigten frühere Beobachtungen (H. Martens und W. Nellen, unveröffentlicht), wonach die Mechanismen für RNAi und asRNA-vermittelte Genstilllegung unterschiedliche spezifische Proteine benötigen. Um die Funktion des HelF-Proteins auf der molekularen Ebene genauer zu charakterisieren und die Interaktion mit anderen RNAi-Komponenten zu untersuchen, wurden in vitro Versuche durchgeführt. Das HelF-Protein enthält, neben der DEAH-Helikase-Domäne eine N-terminale Doppelstrang RNA bindende Domäne (dsRBD) mit einer hohen Ähnlichkeit zu der dsRBD des Dicer A aus Dictyostelium. Die dsRNA-Bindungsaktivität der beiden dsRBDs aus HelF und Dicer A wurde analysiert und verglichen. Es konnte mithilfe von Gel-Retardationsanalysen gezeigt werden, dass sowohl HelF-dsRBD als auch Dicer-dsRBD direkt an lange dsRNAs binden können. Hierbei zeigte sich, dass die HelF-dsRBD eine höhere Affinität zu einem imperfekten RNA-Doppelstrang besitzt, als zu einer perfekt gepaarten dsRNA. Für beide dsRBDs konnte eine spezifische Bindung an ein pre-miRNA Substrat nachgewiesen werden (pre-let-7). Dieses Ergebnis legt nah, dass es zwei Bindestellen für die Proteine auf dem pre-miRNA Substrat gibt. Überdies hinaus konnte gezeigt werden, dass die dsRBDs beider Proteine eine siRNA bindende Aktivität besitzen. Die Affinität beider dsRBDs an das pre-let-7 Substrat wurde weiterhin mit Hilfe der Plasmon Oberflächen Resonanz untersucht. Hierbei konnte eine 9-fach höhere Bindeaffinität der Dicer-dsRBD im Vergleich zur HelF-dsRBD nachgewiesen werden. Während die Bindung der HelF-dsRBD an das pre-let-7 durch die Anwesenheit von Mg2+ beeinträchtigt war, zeigte sich kein Einfluß von Mg2+ auf das Bindeverhalten der Dicer-dsRBD. Mit Hilfe der in dieser Arbeit gewonnen Ergebnisse lässt sich ein Model für die Funktion von HelF postulieren. In diesem Model wirkt HelF durch Erkennen und Binden von dsRNA Substraten als Suppressor von der RNAi im Kern. Das Protein kann als Überwachungsystem gegen eine irrtümliche Auslösung von RNAi wirken, die durch zufällige dsRNA Faltungen oder eine zu geringe Häufigkeit der siRNAs hervorgerufen sein könnte. Falls das Protein eine Helikase-Aktivität besitzt, könnte es rückgefaltete RNA Strukturen im Kern auflösen, was sich in einer verringerten RNAi-Effizienz wiederspiegelt. Durch Ausschalten des helF-Gens würde nach diesem Modell eine erfolgreiche Auslösung von RNAi schon bei sehr geringer Mengen an dsRNA möglich werden. Das Modell erlaubt, die exakte molekulare Funktion des HelF-Proteins im RNAi-Mechanismus weiter zu untersuchen.

Funktionsanalysen der Domänen des Vacuolin B und die Rolle des filamentösen Actins am Vacuolin B-positiven Kompartiment im endocytotischen Transit in Dictyostelium discoideum

Ähnlich wie in Säugerzellen ist das neutrale Postlysosom in Dictyostelium discoideum von einem Coat aus filamentösem Actin umgeben. In dieser Arbeit wurde der Frage nach der Funktion dieses Actin-Cytoskeletts am späten Endosom nachgegangen. Hierzu wurde zunächst eine Analyse der Domänen des Vacuolin B durchgeführt, das als bisher spätester bekannter Marker im Endocytoseweg in Dictyostelium discoideum das neutrale, postlysosomale Kompartiment dekoriert. In einer Yeast Two Hybrid-Analyse wurden die Bereiche des Vacuolin B identifiziert, die für eine Selbst-Interaktion des Proteins notwendig und ausreichend sind. Es handelt sich dabei um die coiled-coil-Domäne und einen daran anschließenden, 18 Aminosäuren langen, alpha-helicalen Abschnitt. Diesem helicalen Bereich scheint die Funktion einer modifizierenden, die coiled-coil-Ausbildung vermittelnden oder initiierenden Faltungseinheit zuzukommen. Sie weist jedoch nicht die typischen Merkmale einer trigger-Helix auf. Lokalisationsuntersuchungen mit GFP-Deletionskonstrukten zeigten, dass es einen Zusammenhang zwischen Interaktionsfähigkeit und Bindung des Vacuolin an die Oberfläche später Endosomen gibt: Eine korrekte Lokalisation und Membranassoziation waren nur dann zu beobachten, wenn in der Yeast Two Hybrid-Analyse eine Interaktion nachgewiesen werden konnte. Es wurden die für die Lokalisation und Assoziation mit der vacuolären Membran notwendigen Sequenzbereiche identifiziert; diese waren jedoch nicht hinreichend. Vermutlich sind hierfür auch Sequenzen des N-Terminus notwendig. Die erhobenen Daten legen weiterhin eine Bedeutung der hydrophoben Domäne des Vacuolin B für die korrekte Faltung des Proteins nahe. Im Anschluss an die Domänenanalyse wurde Vacuolin dazu benutzt, durch Herstellung von Hybridproteinen Actin-interagierende Proteine gezielt an das späte Endosom zu transportieren. Es wurde deren Einfluss auf den lokalen Actin Coat und den endocytotischen Transit untersucht. Zwei Actin-bindende Proteine mit depolymerisierender Wirkung konnten im Rahmen dieser Arbeit getestet werden, nämlich Severin und Cofilin. Die Schwächung des lokalen Actin Coats durch das Vorhandensein von Severin an der späten Vacuole war nicht eindeutig festzustellen. Severin am Postlysosom führte nicht zu einer Veränderung der Transitkinetik von Flüssigphasenmarker. Allerdings konnte ein Defekt in der Phagocytose festgestellt werden. Es könnte hierbei ein Zusammenhang zwischen der Mobilisierung von intrazellulärem Calcium während der Partikelaufnahme und der Calcium-abhängigen Regulation der Severin-Aktivität bestehen. Das Hybridprotein aus Vacuolin und Cofilin zeigte neben einer Assoziation mit der vacuolären Membran auch eine Lokalisation im Cytoplasma und Cortex der Zellen. Mit der Lokalisation im Cytoplasma und Cortex korrelierte eine Veränderung der endocytotischen Aktivität. Das Vacuolin-Cofilin-Fusionsprotein am Postlysosom rief einen Verlust des lokalen Actin Coats hervor. Dies führte zu einer traubenförmigen Assoziation der späten Endosomen; exocytotische Parameter blieben jedoch unbeeinflusst. Aufgrund der hier erhobenen Daten kann vermutet werden, dass der Actin Coat am Postlysosom dazu dient, eine Agglutination dieser Endosomen zu inhibieren. Dies könnte ein Schutzmechanismus zum Ausschluss von Docking- und Fusionsereignissen sein.

Funktionelle Analyse der LC-FACS in Dictyostelium discoideum

"Funktionelle Analyse der LC-FACS in Dictyostelium discoideum" Das Dictyostelium discoideum Gen fcsA kodiert für ein 75 kDa großes Protein. Es kann durch Homologieanyalysen der Amino-säuresequenz zu den "long-chain fatty acyl-CoA"-Synthetasen ge-rechnet werden, die lang-kettige Fettsäuren durch die kovalente Bindung von Coenzym A akti-vie-ren und damit für diverse Reak-tionen in Stoffwechsel und Molekül-Synthese der Zelle verfügbar machen. Die hier untersuchte D. discoideum LC-FACS lokalisiert als peripher assoziiertes Protein an der cytosolischen Seite der Membran von Endo-somen und kleiner Vesikel. Bereits kurz nach der Bildung in der frühen sauren Phase kann die Lokalisation der LC-FACS auf Endosomen ge-zeigt werden. Sie dissoziiert im Laufe ihrer Neutra-li-sierung und kann auf späten Endosomen, die vor ihrer Exocytose stehen nicht mehr nach-gewiesen werden. Ein Teil der kleinen die in der gesamte Zelle verteilten kleinen Vesikel zeigt eine Kolokalisation mit lysosomalen Enzymen. Trotz des intrazellulären Verteilungs-mus-ters, das eine Beteiligung dieses Pro-teins an der Endocytose nahe-legt, konnte kein signifikanter Rückgang der Pino- und Phagocytose-Rate in LC-FACS Nullmutanten beobachtet werden. Der endo-cy-to-ti-sche Transit ist in diesen Zellen etwas verlängert, außerdem zeigen die Endosomen einen deutlich erhöhten pH-Wert, was zu einer weniger effektiven Prozessierung eines lysosomalen Enzyms führt (a-Mannosidase). Die Funktion der LC-FACS ist die Aufnahme von langkettigen Fettsäuren aus dem Lumen der Endosomen.

Role of Rab5 in synaptic vesicle recycling

During synaptic transmission, NT-filled synaptic vesicles are released by Ca2+-triggered exocytosis at the active zone. Following exocytosis, SV membrane is immediately re-internalized and synaptic vesicles (SVs) are regenerated by a local recycling mechanism within the presynaptic terminal. It is debated whether an endosomal compartment is involved in this recycling process. In contrast, it is well known from cultured mammalian cells, that endocytic vesicles fuse to the early sorting endosome. The early endosome is a major sorting station of the cell where cargo is send into the degradative pathway to late endosome and lysosome or towards recycling. Each trafficking step is mediated by a certain protein of the Rab family. Rab proteins are small GTPases belonging to the Ras superfamily. They accumulate at their target compartments and have thereby been used as markers for the different endocytic organelles in cultured mammalian cells. Rab5 controls trafficking from the PM to the early endosome and has thereby been used as marker for this compartment. A second marker is based on the specific binding of the FYVE zinc finger protein domain to the lipid PI(3)P that is specifically generated at the early endosomal membrane. This study used the Drosophila NMJ as a model system to investigate the SV recycling process. In particular, three questions were addressed: First, is an endosomal compartment present at the synapse? Second, do SVs recycle through an endosome? Third, is Rab5 involved in SV recycling? We used GFP fusions of Rab5 and 2xFYVE to visualize endosomal compartments at the presynaptic terminal of Drosophila third instar larval NMJs. Furthermore, the endosomes are located within the pool of recycling SVs, labeled with the styryl-dye FM5-95. Using the temperature-sensitive mutation in Dynamin, shibirets, we showed that SV recycling involves trafficking through an intermediate endosomal compartment. In cultured mammalian cells, interfering with Rab5 function by expressing the dominant negative version, Rab5SN causes the fragmentation of the endosome and the accumulation of endocytic vesicles. In contrast, when Rab5 is overexpressed enlarged endosomal compartments were observed. In Drosophila, the endosomal compartment was disrupted when loss of function and dominant negative mutants of Rab5 were expressed. In addition, at the ultrastructural we observed an accumulation of endocytic vesicles in Rab5S43N expressing terminals and enlarged endosomes when Rab5 was overexpressed. Furthermore, interfering with Rab5 function using the dominant negative Rab5S43N caused a decrease in the SV recycling kinetics as shown by FM1-43 experiments. In contrast, overexpression of Rab5 or GFP-Rab5 caused an increase in the FM1-43 internalization rate. Finally, standard electrophysiological techniques were used to measure synaptic function. We found that the Rab5-mediated endosomal SV recycling pathway generates vesicles with a higher fusion efficacy during Ca2+-triggered release, compared to SVs recycled when Rab5 function was impaired. We therefore suggest a model in which the endosome serves as organelle to control the SV fusion efficacy and thereby the synaptic strength. Since changes in the synaptic strength are occuring during learning and memory processes, controlling endosomal SV recycling might be a new molecular mechanism involved in learning and memory.

The role of Ken&Barbie in JAK/STAT signalling during development of Drosophila melanogaster

Cell-cell interactions during embryonic development are crucial in the co-ordination of growth, differentiation and maintenance of many different cell types. To achieve this co-ordination each cell must properly translate signals received from neighbouring cells, into spatially and temporally appropriate developmental responses. A surprisingly limited number of signal pathways are responsible for the differentiation of enormous variety of cell types. As a result, pathways are frequently 'reused' during development. Thus, in mammals the JAK/STAT pathway is required during early embryogenesis, mammary gland formation, hematopoiesis and, finally, plays a pivotal role in immune response. In the canonical way, the JAK/STAT pathway is represented by a transmembrane receptor associated with a Janus kinase (JAK), which upon stimulation by an extra-cellular ligand, phosphorylates itself, the receptor and, finally, the signal transducer and activator of transcription (STAT) molecules. Phosphorylated STATs dimerise and translocate to the nucleus where they activate transcription of target genes. The JAK/STAT pathway has been conserved throughout evolution, and all known components are present in the genome of Drosophila melanogaster. Besides hematopoietic and immunity functions, the pathway is also required during development for processes including embryonic segmentation, tracheal morphogenesis, posterior spiracle formation etc. This study describes Drosophila Ken&Barbie (Ken) as a selective regulator of JAK/STAT signalling. ken mutations identified in a screen for modulators of an eye overgrowth phenotype, caused by over-expression of the pathway ligand unpaired, also interact genetically with the pathway receptor domeless (dome) and the transcription factor stat92E. Over-expression of Ken can phenocopy developmental defects known to be caused by the loss of JAK/STAT signalling. These genetic interactions suggest that Ken may function as a negative regulator of the pathway. Ken has C-terminal Zn-finger domain, presumably for DNA binding, and N-terminal BTB/POZ domain, often found in transcriptional repressors. Using EGFP-fused construct expressed in vivo revealed nuclear accumulation of Ken. Therefore, it is proposed that Ken may act as a suppresser of STAT92E target genes. An in vitro assay, termed SELEX, determined that Ken specifically binds to a DNA sequence, with the essential for DNA recognition core overlapping that of STAT92E. This interesting observation suggests that not all STAT92E sites may also allow Ken binding. Strikingly, when effects of ectopic Ken on the expression of putative JAK/STAT pathway target genes were examined, only a subset of the genes tested, namely vvl, trh and kni, were down-regulated by Ken, whereas some others, such as eve and fj, appeared to be unresponsive. Further analysis of vvl, one of the genes susceptible to ectopic Ken, was undertaken. In the developing hindgut, expression of vvl is JAK/STAT pathway dependent, but remains repressed in the posterior spiracles, despite the stimulation of STAT92E by Upd in their primordia. Importantly, ken is also expressed in the developing posterior spiracles. Strikingly, up-regulation of vvl is observed in these tissues in ken mutant embryos. These imply that while ectopic Ken is sufficient to repress the expression of vvl in the hindgut, endogenous Ken is also necessary to prevent its activation in the posterior spiracles. It is therefore conceivable that ectopic vvl expression in the posterior spiracles of the ken mutants may be the result of de-repression of endogenous STAT92E activity. Another consequence of these observations is a fine balance that must exist between STAT92E and Ken activities. Apparently, endogenous level of Ken is sufficient to repress vvl, but not other, as yet unidentified, JAK/STAT pathway targets, whose presumable activation by STAT92E is required for posterior spiracle development as the embryos mutant for dome, the receptor of the pathway, show severe spiracle defects. These defects are also observed in the embryos mis-expressing Ken. Though it is possible that the posterior spiracle phenotype caused by higher levels of Ken results from a JAK/STAT pathway independent activity, it seems to be more likely that Ken acts in a dosage dependent manner, and extra Ken is able to further antagonise JAK/STAT pathway target genes. While STAT92E binding sites required for target gene expression have been poorly characterised, the existence of genome data allows the prediction of candidate STAT92E sites present in target genes promoters to be attempted. When a 6kb region containing the putative regulatory domains flanking the vvl locus are examined, only a single potential STAT92E binding site located 825bp upstream of the translational start can be detected. Strikingly, this site also includes a perfect Ken binding sequence. Such an in silico observation, though consistent with both Ken DNA binding assay in vitro and regulation of STAT92E target genes in vivo, however, requires further analysis. The JAK/STAT pathway is implicated in a variety of processes during embryonic and larval development as well as in imago. In each case, stimulation of the same transcription factor results in different developmental outcomes. While many potential mechanisms have been proposed and demonstrated to explain such pleiotropy, the present study indicates that Ken may represent another mechanism, with which signal transduction pathways are controlled. Ken selectively down-regulates a subset of potential target genes and so modifies the transcriptional profile generated by activated STAT92E - a mechanism, which may be partially responsible for differences in the morphogenetic processes elicited by JAK/STAT signalling during development.

The bonds of democratic politics

This paper is an attempt to analyze bonds and their relevance within the confines of economics. They are discussed as both exogenous and endogenous variables. More specifically, the bonds of democratic politics are compared with those of non-democratic politics. It is argued that only those societies that have at their disposition certain kinds of bonds will be able to sustain democracy. It is further argued that the differential effects of democratic vs. non-democratic regimes on the respective bonds are rather weak. But then again, different kinds of democratic institutions might well have an effect on the prevalent bonds found in a society.

Der Markt für Paket- und Expressdienste

Die Paket- und Expressdienste, als Teil logistischer Distributionssysteme, sind bedeutende Bestandteile unseres Wirtschaftssystems geworden. Nach der erfolgreichen Einführungsphase der Express- und Paketdienstleistung auf dem westeuropäischen Markt, Mitte der 1980-er, entwickelte er sich rasant bis zum Ende der 1990-er, mit teilweise zweistelligen Wachstumsraten. Doch nach Jahren des Booms sind die Paket- und Expressdienstleister im neuen Jahrhundert in einen Zeitabschnitt mit gedämpften Wachstumssteigerungen übergegangen. Der Markt zeichnet sich aus, durch immer kürzer werdende Laufzeiten, bei permanent sinkenden Preisen. Viele Anzeichen deuten darauf hin, dass sich die KEP-Branche auf dem Weg zur Marktreife befindet. Aufgrund dieser Entwicklungen, sind die Anbieter von Paket- und Expressdienstleistungen zunehmend gefordert, ihre Produkte auf Kundenorientierung zu überprüfen, sowie ihre Bindung zum Kunden in den Fokus zu stellen. Darin liegt der Ansatz der Dissertation. Mittels einer empirischen Erhebung wurden Kundenzufriedenheit, Kundenerwartungen und die daraus entstandene Kundenbindung der Verlader, den Einschätzungen der Paket- und Expressdienstleister gegenübergestellt. Die Marktstudie war offen für alle Nutzer und Anbieter von Paket- und Expressdienstleistungen. Die Arbeit lässt sich in drei grössere Themenbereiche unterteilen. Im ersten Themenbereich werden zunächst Grundlagen der Themen Logistik, Kundenzufriedenheit und Kundenbindung geschaffen. Für die Ermittlung der Kundenbindung wurde die Kundenzufriedenheit als wesentliche Determinante gewählt. Der zweite Themenbereich geht auf die aktuellen Probleme der Paket- und Expressdienstleister ein und erläutert, warum sich die Anbieter von Paket- und Expressdienstleistung verstärkt auf den Kunden ausrichten müssen. Im dritten Teil erfolgt die Herleitung der Thesen sowie die Darstellung der empirischen Ergebnisse. Den Abschluss dieses Abschnitts stellt dann die Verifizierung der Thesen, sowie die Erarbeitung von Handlungsempfehlungen auf der Grundlage der gewonnenen Erkenntnisse dar. Mit der Arbeit sollten im Markt für Paket- und Expressdienstleistung folgende Erkenntnislücken geschlossen werden: Zunächst wurde geklärt, wie Anbieter auf die veränderten Produktanforderungen der Kunden reagiert haben und in welchem Umfang die Nachfrager diese bereits nutzen. Ein weiterer zentraler Bereich klärt, wie zufrieden die Kunden dieses Segments mit ihren Dienstleistern sind und wie zufrieden die Anbieter ihre Kunden einschätzen. Außerdem weist die Marktanalyse auf der Grundlage der ermittelten Kundenzufriedenheit auf, wie hoch die Kundenbindung in diesem Markt ist. Der abschliessende Teil der Arbeit zeigt dann auf, aus welchen Gründen sich Kunden für oder gegen einen Dienstleister entscheiden und wo Kunden und Anbieter die grössten Potentiale sehen, die Geschäftsbeziehungen langfristig vertiefend auszubauen.

Manipulation der Aktin-Hülle später Endosomen durch ektopisches Protein-Targeting und Etablierung einer in vivo-Hierarchie cytoplasmatischer Targeting-Signalstärken

Der Endocytoseweg in Dictyostelium verläuft über definierte endosomale Reifestadien. Dabei werden die reifenden Endosomen im letzten Stadium durch eine Schicht aus filamentösem Aktin umhüllt. Über die biologische Funktion dieser Aktin-Hülle ist derzeit wenig bekannt. Zum weiteren Erkenntnisgewinn sollten daher unterschiedliche Aktin-interagierende Proteine an die endosomale Aktin-Hülle dirigiert und die sich daraus ergebenden Folgen untersucht werden. Dabei wurde der in Drengk et al., 2003 beschriebene Ansatz aufgegriffen, in dem Proteine durch die Fusion an Vacuolin an die späte endosomale Membran transportiert wurden. Die endosomale Lokalisation von DAip1 bewirkte den vollständigen Verlust der endosomalen Aktin-Hülle, ohne dabei das restliche zelluläre Cytoskelett zu beeinträchtigen. Dabei wird die Depolymerisation vermutlich über die nachgewiesene Interaktion von DAip1 mit dem Aktin-depolymerisierenden Protein Cofilin bewirkt. Einhergehend damit trat eine Aggregation der betroffenen Kompartimente, eine Verzögerung des endocytotischen Transits, sowie eine verstärkte Retention lysosomaler Enzyme auf. Diese Ergebnisse ließen auf eine Funktion der endosomalen Aktin-Hülle als Fusionsinhibitor oder in der Regulation von Recycling-Prozessen an späten Endosomen schließen. Die Verlängerung der endosomalen Verweilzeit des den Arp2/3-Komplex negativ regulierenden Proteins Coronin bewirkte dagegen keine offensichtlichen Veränderungen in den betroffenen Zellen. Diese Beoachtung könnte ein Indiz dafür sein, dass nach der Ausbildung der Aktin-Hülle keine weiteren essentiellen Arp2/3-abhängigen mehr an der endosomalen Membran auftreten. Die endosomale Lokalisation des Aktin-Crosslinkers ABP34 induzierte ebenfalls keine Abweichungen vom Wildtyp-Verhalten. Hierbei besteht allerdings die Möglichkeit, dass die Aktivität des Proteins durch die bereits zuvor beschriebene Calcium-Sensitivität beeintächtigt vorliegt. Eine Verstärkung der endosomalen Hülle konnte trotz der Verwendung unterschiedlicher Ansätze nicht hervorgerufen werden. Offensichtlich wirkt die zusätzliche Expression zentraler Regulatoren der Aktin-Polymerisation in der Zelle cytotoxisch. Die Bindung von VASP an die endosomale Membran bewirkte in den Zellen die Ausbildung voluminöser, cytoplasmatischer „Aktin-Bälle“. Diese riefen in den betroffenen Zellen Defekte in unterschiedlichen Aktin-abhängigen Prozessen, wie der Phago- und Pinocytose, sowie der Cytokinese hervor. Dabei gehen die beobachteten Veränderungen vermutlich auf die nachgewiesene Störung im Gleichgewicht zwischen G- und F-Aktin zurück. Obwohl die Aktin-Bälle an der endosomalen Membran entstehen, weisen sie nach vollendeter Entstehung keine inneren oder äußeren Membranen mehr auf und nehmen nicht mehr aktiv am endocytotischen Geschehen teil. Die nähere Charakterisierung offenbarte große Ähnlichkeit zu den mit unterschiedlichen neurodegenerativen Erkrankungen assoziierten Hirano-Bodies. Über das beobachtbare Lokalisationsverhalten der unterschiedlichen im ersten Teil der Arbeit eingesetzten Vacuolin-Hybridproteine ließ sich die Stärke der Lokalisationsinformationen der fusionierten Aktin-interagierenden Proteine miteinander vergleichen. Dies wurde verwendet, um die einzelnen Proteine gemäß ihres Targeting-Potenzials hierarchisch anzuordnen. Im zweiten Teil der Arbeit wurden dieser Hierarchie die beiden cytoplasmatischen Targeting-Signale für Peroxisomen (PTS1) und den Zellkern (SV40-NLS) hinzugefügt. Der vorgenommene Vergleich dieser in vivo gewonnen Daten aus Dictyostelium mit unterschiedlichen in vitro-Bindungsstudien mit homologen Proteinen anderer Organismen zeigte eine erstaunlich gute Übereinstimmung. Diese Beobachtung lässt auf vergleichbare Targeting-Affinitäten innerhalb der Eukaryoten schließen und belegt, dass die zelluläre Lokalisation eines Proteins relativ sicher anhand der in ihm vorhandenen Bindungs-Affinitäten vorhergesagt werden kann. Durch die Kombination der in vivo- und in vitro-Daten war es auch ohne Kenntnis des Oligomerisierungsgrades und des Interaktionspartners erstmals möglich, die Bindungsstärke von Vacuolin an der endosomalen Membran auf einen definierten Bereich einzugrenzen.

Photoschaltbare Azobenzol-modifizierte selbstorganisierte Monoschichten auf Gold(111)-Oberflächen

Für die Entwicklung photoschaltbarer selbstorganisierter Monoschichten (SAMs) auf Gold(111)-Oberflächen wurden neue Azobenzol-terminierte Asparagussäure - und Liponsäurederivate synthetisiert. Um den Einfluss lateraler Wasserstoffbrückenbindungen auf Qualität und Orientierungsordnung der Schichten zu untersuchen, wurden Monolagen, die durch amid- und esterverknüpfte Verbindungen gebildet wurden, miteinander verglichen. Die Filmbildung aus der Lösung wurde in situ durch optische Frequenzverdopplung (SHG) untersucht und die Photoreaktivität mittels Kontaktwinkelmessungen, Oberflächen-Plasmonenresonanz (SPR) und Ellipsometrie verfolgt. SAMs auf Gold wurden außerdem mit Hilfe von Röntgenphotoelektronenspektroskopie (XPS), Nahkanten-Reflexions-Röntgenabsorptionsspektroskopie (NEXAFS) und Infrarot-Reflexionsabsorptionsspektroskopie (IRRAS) charakterisiert, um die Filmqualität, die Bindung ans Substrat und Orientierungsordnung im Film zu ermitteln. Da die Chemisorption auf polykristallinem Gold formal der Koordinationschemie von 1,2-Dithiolan-Derivaten gegenüber nullwertigen Edelmetall-Zentralatomen entspricht, wurden etliche Pt-Komplexe durch oxidative Addition an [Pt(PPh3)4] dargestellt. Im Zusammenhang mit der Darstellung der Asparagussäure wurde die Kristallstruktur von [pipH]2[WS4] und der neuen Verbindungen [pipH]3[WS4](HS) und [pipH]4[WS4][WOS3] (pip = Piperidin) bestimmt. Wasserstoffbrückenbindungen zwischen den Piperidinium-Kationen und den Thiowolframat-Anionen spielen eine dominante strukturelle Rolle.

Dipodal Ferrocene Derivatives for Nanostructured Redox-Functionalised Surfaces

Self-assembled monolayers (SAMs) on solid surfaces are of great current interest in science and nanotechnology. This thesis describes the preparation of several symmetrically 1,1’-substituted ferrocene derivatives that contain anchoring groups suitable for chemisorption on gold and may give rise to SAMs with electrochemically switchable properties. The binding groups are isocyano (-NC), isothiocyanato (-NCS), phosphanyl (-PPh2), thioether (-SR) and thienyl. In the context of SAM fabrication, isothiocyanates and phosphanes are adsorbate systems which, surprisingly, have remained essentially unexplored. SAMs on gold have been fabricated with the adsorbates from solution and investigated primarily by X-ray photoelectron spectroscopy and near-edge X-ray absorption fine structure spectroscopy. The results of these analytical investigations are presented and discussed in matters of the film quality and possible binding modes. The quality of self-assembled monolayers fabricated from 1,1’-diisocyanoferrocene and 1,1’-diisothiocyanatoferrocene turned out to be superior to that of films based on the other adsorbate species investigated. Films of those absorbates as well as of dppf afforded well-defined SAMs of good quality. All other films of this study based on sulfur containing anchoring groups exhibit chemical inhomogeneity and low orientational order of the film constituents and therefore failed to give rise to well-defined SAMs. Surface coordination chemistry is naturally related to molecular coordination chemistry. Since all SAMs described in this thesis were prepared on gold (111) surfaces, the ferrocene-based ligands of this study have been investigated in their ability for complexation towards gold(I). The sulfur-based ferrocene ligands [fc(SR)2] failed to give stable gold(I) complexes. In contrast, 1,1’-diisocyanoferrocene (1) proved to be an excellent ligand for the complexation of gold(I). Several complexes were prepared and characterised utilising a series of gold(I) acetylides. These complexes show interesting structural motifs in the solid state, since intramolecular aurophilic interactions lead to a parallel orientation of the isocyano moieties, combined with an antiparallel alignment of neighbouring units. The reaction of 1 with the gold(I) acetylide [Au(C≡C–Fc)]n turned out to be very unusual, since the two chemically equivalent isocyano groups undergo a different reaction. One group shows an ordinary coordination and the other one undergoes an extraordinary 1,1-insertion into the Au-C bond. As a sideline of the research of this thesis several ferrocene derivatives have been tested for their suitability for potential surface reactions. Copper(I) mediated 1,3-dipolar cycloadditions of azidoferrocene derivatives with terminal alkynes appeared very promising in this context, but failed to a certain extent in terms of ‘click’ chemistry, since the formation of the triazoles depended on the strict exclusion of oxygen and moisture and yields were only moderate. Staudinger reactions between dppf and azidoferrocene derivatives were also tested. The nucleophilic additions of secondary amines to 1,1’-diisothiocyanatoferrocene led to the respective thiourea derivatives in quantitative yields.

Neue redoxfunktionalisierte Schwefel-Tripodliganden für selbstassemblierende monomolekulare Filme auf Goldoberflächen

Für die Entwicklung selbstorganisierter Monoschichten (SAMs) auf Gold(111)-Oberflächen wurden neue, redox-funktionalisierte Schwefel-Tripodliganden synthetisiert. Um die tripodale Struktur zu realisieren, wurde Adamantan als vierbindiges Zentrum eingesetzt. Die Anbindung an die Goldoberfläche wurde durch Thioethereinheiten ermöglicht, eventuelle laterale Wechselwirkungen durch Alkylseitenketten an den Thioethereinheiten, sowie durch lineare, rigide Spacereinheiten wurden untersucht. Als redoxaktive, funktionelle Einheit wurde ein Ferrocenylrest an den Liganden eingeführt. Gebildete monomolekulare Filme der Liganden auf Gold wurden mit Hilfe von Röntgenphotoelektronenspektroskopie (XPS), Nahkanten-Reflexions-Röntgenabsorptionsspektroskopie (NEXAFS) und Sum-Frequency-Generation (SFG) charakterisiert, um die Filmqualität, die Bindung ans Substrat und Orientierungsordnung im Film zu ermitteln.

Ästhetik und nachhaltige Entwicklung in Bergregionen

Die Bergregionen Japans leiden am Niedergang der regionalen Wirtschaft, des Sozialsystems und der Kultur. Dies wird im Zusammenhang mit dem Rückgang von Produktion und Verbrauch regionaler Ressourcen gesehen, der seit der Modernisierung und Globalisierung einsetzte. Durch das Sammeln und die Produktion von Ressourcen in der Landschaft und die Fertigung regionaler Produkte wird von den Bewohnern der Bergdörfer auch die Landschaft gepflegt. Seit die Nutzung von Ressourcen aus den Bergen allmählich aufgegeben wird, erobert sich die Wildnis den vom Menschen geprägten Lebensraum zurück. Sowohl in Mitteleuropa als auch in Japan gibt es Bewohner in Bergregionen, die weiterhin in ihrer Heimat bleiben möchten. Sie geben sich viel Mühe und betreiben großen Aufwand, ihre Landschaft zu pflegen und von ihr zu leben, was oft genug schwer fällt. Im Kontext der Rationalisierung der Moderne mögen sich ihre Beweggründe, trotzdem nicht fortzuziehen und auszuharren, als irrational ausmachen. Auf der anderen Seite stößt ihre kommunikative Lebensweise auch auf Sympathie und Bewunderung, und ihrer Arbeit für die Erhaltung der Landschaft wird eine gewisse Wertschätzung entgegengebracht. In dieser Forschungsarbeit wird die Hypothese aufgestellt, dass Landschaft, Produzent, Produkt und Verbraucher bei regionaler Ressourcennutzung über zwei Bedeutungsebenen der Ästhetik, nämlich durch „Kohärenz“ und „Sympathie“ miteinander verbunden sind. Es ist heute in der Regionalplanung erforderlich, die Themen mit regionaler Landschaft, Kultur, Sozialsystem und Wirtschaft, die bisher als einzelnen Aufgaben behandelt worden sind, zu bündeln und für die gesamte Entwicklung in eine Richtung zu zielen. Unter diesem Aspekt sind komplexe und sich selbst regulierende Entwicklungsmodelle nützlich, d.h. es ist dabei von Nutzen, dass Bürger sich selbst und ihrer Region bewusst werden und sie sich Raum für Entwicklung schaffen. Eine „Ästhetische Praxis“ kann dabei Produzenten untereinander und mit ihren Kunden in der Region mit „Sympathie“ aneinander binden, was zum Austausch und zur Weitergabe von Wissen über die regionale Natur mit ihren Ressourcen, die Naturanschauung und die innere Einstellung gegenüber der Produktion, auch über die Generationen hinweg, nützlich ist. Durch die „Sympathie“ zueinander erhöht sich auch die „Kohärenz“ in einer Region, werden die verschiedenen Interessensgruppen zusammengeführt, Gemeinsamkeiten erkannt und die Bindung an den Ort gestärkt.

Untersuchungen zum Vorkommen und molekularen Mechanismus der Biofilm-Bildung bei Enterokokken aus verschiedenen klinischen Bereichen

Im Rahmen der vorliegenden Arbeit wurde eine größere Anzahl an E. faecalis Isolaten aus Vaginalabstrichen, erstmals insbesondere von Patientinnen, die an Bakterieller Vaginose litten, untersucht und mit E. faecalis Stämme aus verschiedenen anderen klinischen Bereichen auf das Vorkommen von Virulenzfaktoren verglichen. Weiterhin wurden Korrelationen zwischen bestimmten Faktoren und der Menge an produziertem Biofilm erstellt, um mögliche Zusammenhänge zum Mechanismus der Biofilm-Bildung zu erfassen. Mittels statistischer Analysen konnte hinsichtlich der 150 untersuchten E. faecalis Isolate nachgewiesen werden, dass keine signifikanten Unterschiede der Inzidenzen von Virulenzfaktoren (esp, asa1, gelE, GelE, cylA, β-Hämolyse) zwischen den Stämmen der verschiedenen Herkunftsbereiche bestanden. In Bezug auf das Auftreten von Biofilm-Bildung zeigte sich ein erhöhtes Vorkommen bei Stämmen aus Urin sowie invasiver Herkunft (insgesamt jeweils ca. 70 % mäßige und starke Biofilm-Bildner) im Vergleich zu E. faecalis Isolaten aus Wunden oder Faeces (je ca. 40 %). Statistische Auswertungen bzgl. des Zusammenhangs eines oder einer Kombination von Virulenzfaktoren mit der Menge an gebildetem Biofilm wiesen darauf hin, dass Isolate, die das esp Gen besaßen, in erhöhtem Maße zur Biofilm-Bildung befähigt waren. Dies zeigte einen gewissen Einfluss des Zellwandproteins auf die Fähigkeit zur Biofilm-Bildung bei E. faecalis. Allerdings wurden stets auch Stämme identifiziert, die die Fähigkeit zur Biofilm-Bildung trotz des Fehlens der jeweils untersuchten genetischen Determinante bzw. der Determinanten aufwiesen, so dass auf das Vorhandensein weiterer, unbekannter Einflussfaktoren auf den Mechanismus der Biofilm-Bildung bei E. faecalis geschlossen werden konnte. Unter 78 untersuchten E. faecium Isolaten aus verschiedenen klinischen Bereichen konnte lediglich ein Stamm (1,3 %) als mäßiger Biofilm-Bildner charakterisiert werden, so dass die Fähigkeit bei dieser Spezies in der hier untersuchten Region unter diesen Bedingungen kaum nachgewiesen werden konnte. Einen Schwerpunkt dieser Arbeit bildete die Untersuchung zum Vorkommen von Virulenzfaktoren und Biofilm-Bildung bei E. faecalis Isolaten aus Vaginalabstrichen. Bzgl. des Auftretens von Virulenzfaktoren und Biofilm-Produktion konnte kein Unterschied zwischen Stämmen assoziiert mit Bakterieller Vaginose und Isolaten einer Vergleichsgruppe festgestellt werden. Allerdings zeigte eine Gegenüberstellung mit den untersuchten E. faecalis Stämmen aus anderen klinischen Bereichen, dass die 80 Isolate aus Vaginalabstrichen eine ähnlich hohe Inzidenz bestimmter Virulenzfaktoren wie Stämme aus Faeces, Urin, Wunden oder invasiver Herkunft sowie eine mit den Isolaten aus Urin und invasiver Herkunft vergleichbar hohe Fähigkeit zur Biofilm-Bildung aufwiesen (ca. 75 % mäßige und starke Biofilm-Bildner). Dies deutete auf eine Verbreitung der Biofilm-Bildungsfähigkeit bei E. faecalis Stämmen der Vaginalflora und somit auf eine große Bedeutung der Eigenschaft für Isolate dieser Herkunft hin. Die statistische Auswertung der Korrelationen von Virulenzfaktoren mit der Menge an gebildetem Biofilm lieferte ähnliche Ergebnisse wie die Analysen bzgl. der 150 E. faecalis Isolate aus anderen klinischen Bereichen und untermauerte die Annahme, dass zusätzliche Faktoren zu den hier untersuchten Determinanten bei E. faecalis vorhanden sein müssen, die Einfluss auf den Mechanismus der Biofilm-Bildung nehmen. Deshalb konzentrierte sich ein weiterer Teil der vorliegenden Arbeit auf die Herstellung und Charakterisierung von E. faecalis Biofilm-Spontanmutanten, um bisher noch ungeklärte Mechanismen oder neue Faktoren zu erkennen, die Einfluss auf die Biofilm-Bildung bei E. faecalis nehmen. Die Untersuchung einer Mutante (1.10.16) und ihres Wildtypstamms lieferte erstmals den phänotypischen Nachweis des HMW-Komplexes der drei Bee-Proteine sowie die Identifizierung konservierter Pili-Motive dieser Proteine. Des Weiteren schien die in diesem Cluster ebenfalls codierte Sortase-1 dasjenige Enzym zu sein, das höchstwahrscheinlich die Bindung des Proteins Bee-2 innerhalb dieses HMW-Komplexes katalysiert. Insofern lieferten diese Untersuchungen neue, konkrete Hinweise zur Rolle des bee Genclusters bei der Pili-Biogenese und Biofilm-Bildung von E. faecalis. Darüber hinaus stellen Erkenntnisse aus der Charakterisierung von zwei weiteren hergestellten Biofilm-Spontanmutanten viel versprechende Ausgangspunkte für zukünftige Untersuchungen dar, die ein weitergehendes Verständnis der molekularen Mechanismen der Biofilm-Bildung bei E. faecalis erzielen könnten.