Efficient organogenesis of an Australian passionfruit hybrid (Passiflora edulis x Passiflora edulis var. flavicarpa) suitable for gene delivery

An efficient regeneration protocol based on organogenesis from cotyledon explants and suitable for gene delivery has been developed for an Australian passionfruit hybrid. Multiple shoots were regenerated from 30-day-old cotyledon explants on Murashige and Skoog (MS) medium containing 6-benzylvaminopurine (BAP) and coconut water. Media pulsing experiments were conducted to investigate the effect on organogenesis of exposure time of the explants to MS containing 10 mu M BAP and 10% (v/v) coconut water, i.e. passionfruit regeneration medium (PRM). Continuous exposure of these explants to PRM maximised the number of shoots produced to 12.1 per explant. However, periods on hormone-free medium improved the appearance of the shoots and increased the number of explants with shoots from 75 to 84.6%. Further, shoots exposed for 7 days to half-strength MS supplemented with 10 mu M NAA (1-napthalene acetic acid) produced twice as many plantlets than those on half-strength MS alone. Transient GUS histochemical assays indicated delivery of the uidA gene via Agrobacterium tumefaciens.

In vitro culture of the allergenic weed Parthenium hysterophorus L

Excised stem, leaf segments and whole flower of the allergenic weed P. hysterophorus were cultured on Murashighe and Skoog's basal medium supplemented with hormones. Shoot buds readily formed in the stem callus cultured on MS Medium supplemented with IAA and BAP or Kinetin. The leaf callus formed roots alone in a wide variety of media. Suspension cultures were initiated from the leaf and stem callus. The leaf callus elicited a positive patch test response for delayed hypersensitivity in 4 patients suffering from Parthenium dermatitis, thus indicating its ability to synthesise the allergenic principle(s).

Plant regeneration from protoplasts of Capsicum annuum L cv. California Wonder

Plant regeneration from mesophyll protoplasts of pepper, Capsicum annuum L. cv. California Wonder has been demonstrated via shoot organogenesis, Protoplasts isolated from fully expanded leaves of 3-week-old axenic shoots when cultured in TM medium supplemented with 1 mgl(-1) NAA, 1 mgl(-1) 2, 4-D, 0.5 mgl(-1) BAP (CM 1) resulted in divisions with a frequency ranging from 20-25%. Antioxidant ascorbic acid and polyvinylpyrrolidone (PVP) in the medium and incubation in the dark helped overcome browning of protoplasts. Microcalli and macrocalli were formed in TM medium containing 2 mgl(-1) NAA and 0.5 mgl(-1) BAP (CM II) and MS gelled medium containing 2 mgl(-1) NAA and 0.5 mgl(-1) BAP (CM III), respectively, Regeneration of plantlets was possible via caulogenesis, Microshoots, 2-5 per callus appeared on MS gelled medium enriched with 0.5 mgl(-1) IAA, 2 mgl(-1) GA and 10 mgl(-1) BAP (CM IVc). Rooting of microshoots was obtained on half strength gelled medium containing 1 mgl(-1) NAA and 0.5 mgl(-1) BAP, Protoplasts isolated from cotyledons failed to divide and degenerated eventually.

Direct somatic embroygenesis from immature embryos of rosewood (Dalbergia latifolia Roxb.)

Direct regeneration of somatic embryos was obtained from immature zygotic embryos of Dalbergia latifolia. Immature embryos dissected from green pods 90 d after flowering gave the highest frequency of somatic embryo formation. Preculture on high 2,4-D medium for 4 weeks induced direct somatic embryogenesis, which was expressed during the second culture phase in the presence of low 2,4-D along with a high sucrose concentration. Embryos were separated and transferred to the maturation medium containing MS + 0.5-1.0 mg/L BAP, where embryos developed into plantlets. Somatic embryos failed to convert into complete plants without BAP treatment. This method of direct regeneration of somatic embryos without a callus phase has direct application for genetic manipulation studies.

Development of tissue culture and virus-induced gene silencing for Calendula officinalis

Calendula officinalis is grown widely as an ornamental plant across Europe. It belongs to the large. Asteraceae family. In this study, the aim was to explore the possibilities to use Calendula officinalis as a new model organism for flower development and secondary mechanism studies in Asteraceae. Tissue culture of Calendula officinalis was established using nine different cultivars. Murashige & Skoog (MS) medium with four different combinations of plant growth regulators were tested. Of all these combinations, the medium containing 1mg/l BAP, 0.1 mg/l IAA, and 1mg/l Zeatin achieved highest frequency of adventitious shoot regeneration from hypocotyl and cotyledon explants. Virus-induced gene silencing is a recent developed genetic tool for charactering the gene functions in plants, and extends the range of host plants that are not accessible for Agrobacterium transformation. Here, tobacco rattle virus (TRV)-based VIGS technique was tested in calendula (cv. Single Orange). We used TRV carrying Gerbera hybrid phytoene desaturase (PDS) gene fragment to induce PDS silencing in calendula. Vacuum infiltration and syringe infiltration methods both resulted in photo-bleaching phenotypes in leaves, bracts and petals. Loss-of-function phenotypes occurred on calendula 13 days post-infiltration. In conclusion, the data indicates that calendula explants can be regenerated through tissue culture which is a prerequisite for development of stable transformation methods. However, further optimization is still needed to improve the frequency. In addition, VIGS was applied to silence PDS marker gene expression indicating that this method has potential for gene functional studies in future.

Regeneration of plantlets from leaf disc cultures of rosewood: control of leaf abscission and shoot tip necrosis

A method for mass production of rosewood (Dalbergia latifolia Roxb.) trees through leaf disc organogenesis was developed and standardized. Compact callus was initiated from mature leaf discs on Murashige and Skoog (MS) basal medium supplemented with 1.0 mg 1?1 2,4-dichlorophenoxy acetic acid (2,4-D), 5.0 mg 1?1 ?-naphthaleneacetic acid (NAA), 1.0 mg 1?1 6-benzylaminopurine (BAP) and 10% coconut water (CW). High frequency (15�20 shoots/g callus) regeneration of shoot bud differentiation was obtained on MS (3/4 reduced major elements) or Woody Plant Medium (WPM) or modified Woody Plant Medium (mWPM) supplemented with BAP (5.0 mg 1?1) and NAA (0.5 mg 1?1). Leaf abscission and shoot tip necrosis was controlled using mWPM. About 90% of the excised shoots were rooted in the mWPM supplemented with 2.0 mg 1?1 ?-indolebutyric acid (IBA) and 1.0 mg 1?1 caffeic acid. The in vitro-raised rooted plantlets were hardened for successful transplantation to soil. The transplanted plants were exposed to various humidity conditions and 80% transplant success was achieved. The in vitro-raised leaf-regenerated plants grew normally and vigorously in soil.

In vitro micropropagation of scented geranium (Pelargonium graveolens L. Her. ex Ait: syn P. roseum willd)

The objective of this study was to develop a rapid and efficient system for regenerating shoots from nodal explants of scented geranium (Pelargonium graveolens L. Her. ex Ait: syn. P. roseum willd). Single node stem explants were inoculated in MS media containing different combinations of 6-benzylaminopurine (BAP) with indole-3-acetic acid (IAA) or naphthalene acetic acid (NAA) (0, 0.5, 1.0, 2.0 mg/l) in a 4x4 factorial experiment. Multiple shoots were induced in media supplemented with BAP and IAA, Maximum number of shoots (56 per explant) were observed in the medium containing BAP and IAA at 1 mg/l each, 30 days after inoculation. Micro shoots were subcultured once in every four weeks. Adventitious shoots were induced from in vitro grown leaves and petioles. Several regenerated shoots were rooted on MS half-strength medium supplemented with 0.5 mg/l indole-3-butyric acid (IBA) and the plantlets were hardened in the growth chamber. This micropropagation system could be used for rapid and large-scale production of scented geranium.

In vitro plant regeneration from different seedling explants of blackgram [Vigna mungo (L.) Hepper] via organogenesis

Callus induction and morphogenesis from different blackgram explants were tested on MS basal medium supplemented with B5 vitamins, IAA, NAA, IBA, KIN and BAP individually and in combinations. The explants were hypocotyl, epicotyl, axillary bud, cotyledonary node and immature leaf. The optimal levels of the frequency of callus induction was 22.8 mu M of IAA or 16.1 mu M NAA and in combination with 2.2 mu M of BAP. Among the seedling explants, hypocotyl was found to be more efficient in producing callus. Shoots mere induced from callus cultures of hypocotyls, epicotyls, axillary bud, cotyledonary node and immature leaf with varying frequencies in the medium containing KIN (2.3-9.3 mu M) or BAP (2.2-8.8 mu M) and in combination with IAA (2.8 mu M) or NAA (2.6 mu M). Multiple shoots were obtained using cotyledonary node segments. The regenerated shoots rooted best on MS basal medium containing 9.8 mu M IBA. Seventy three per cent of the shoots produced roots, and 80-85% of the plantlets survived under greenhouse condition.

Clonal propagation of Phyllanthus amarus: A hepatoprotector

Background: The micropropagation protocol for Phyllanthus amarus, an important medicinal herb used widely for the treatment of hepatitis in ethnomedicinal systems, was standardized with shoot tip and single node explants. Materials and Methods: The micropropagation was carried out for the hyperproducing ecotype (phyllanthin content 463.828 ppm; hypophyllanthin content: 75.469 ppm) collected from Aanaikatti, Coimbatore, and grown in mist chamber, CPMB, TNAU. For micropropagation studies, the leaves were trimmed off and the shoot tips (6 mm long) and nodal segments (single node) were used for initiation. Results: Shoot tips and single node explants gave a maximum of 6.00 and 7.00 multiple shoots per explant with Benzyl Amino Purine (BAP) (1.0mg/L mg/L). Upon subculturing, a shoot length of around 7 cm with an average of eight internodes per shoot was observed after 20 days in the elongation medium supplemented with BAP (0.2 mg/Lmg/L) and Indole Acetic Acid (IAA) (2.0 mg/L). Seven to ten adventitious roots developed when the elongated microshoots were cultured in half strength MS medium with Indole Butyric Acid (IBA) (2.0 mg/Lmg/L) and NAA (1.0 mg/L mg/L) in 15-20 days after transfer. The rooted shoots acclimatized successfully to field conditions. Conclusion: A method for successful micropropagation of the valuable medicinal plant was established which will provide a better source for continuous supply of plants for manufacturing drugs.

Depression biased non-Hebbian spike-timing-dependent synaptic plasticity in the rat subiculum

The subiculum is a structure that forms a bridge between the hippocampus and the entorhinal cortex (EC), and plays a major role in the memory consolidation process. Here, we demonstrate spike-timing-dependent plasticity (STDP) at the proximal excitatory inputs on the subicular pyramidal neurons of juvenile rat. Causal (positive) pairing of a single EPSP with a single back-propagating action potential (bAP) after a time interval of 10 ms (+10 ms) failed to induce plasticity. However, increasing the number of bAPs in a burst to three, at two different frequencies of 50 Hz (bAP burst) and 150 Hz, induced long-term depression (LTD) after a time interval of +10 ms in both the regular-firing (RF), and the weak burst firing (WBF) neurons. The LTD amplitude decreased with increasing time interval between the EPSP and the bAP burst. Reversing the order of the pairing of the EPSP and the bAP burst induced LTP at a time interval of -10 ms. This finding is in contrast with reports at other synapses, wherein prebefore postsynaptic (causal) pairing induced LTP and vice versa. Our results reaffirm the earlier observations that the relative timing of the pre- and postsynaptic activities can lead to multiple types of plasticity profiles. The induction of timing-dependent LTD (t-LTD) was dependent on postsynaptic calcium change via NMDA receptors in the WBF neurons, while it was independent of postsynaptic calcium change, but required active L-type calcium channels in the RF neurons. Thus the mechanism of synaptic plasticity may vary within a hippocampal subfield depending on the postsynaptic neuron involved. This study also reports a novel mechanism of LTD induction, where L-type calcium channels are involved in a presynaptically induced synaptic plasticity. The findings may have strong implications in the memory consolidation process owing to the central role of the subiculum and LTD in this process.

Micropropagación in vitro del clon de banano (Musa sp.) enano ecuatoriano (AAA)

Se establecieron in vitro yemas apicales de banano (Musa sp.) para su micro propagación durante tres sub-cultivos en un medio nutritivo artificial conteniendo sales minerales (MS), tiamina HCI, sacarosa y mio-inositol; variando con fines de estudio, la consistencia física del medio de cultivo (líquido y semi-sólido) y las concentraciones de reguladores de crecimiento: AIA= O y 1 mg/1 y 6-BAP= 5, 7 y 10 mg/1. Durante el establecimiento y multiplicación de los ex plantes se utilizó un cuarto de crecimiento para la incubación con temperaturas de 25 ± 1 ºc e intensidad lumínica de 2 000 lux. Inicialmente se establecieron in vitro 240 yemas apicales para su adaptación, de las cuales un 85 % (204) se adaptaron satisfactoriamente, el 15 % restante fueron descartados por contaminación, fenolización de las paredes del cormo o muerte de los ex plantes por no adaptación. La mayor contaminación se produjo por hongos y en menor medida por bacterias. La proliferación de hijos fue mayor en los medios de cultivo de consistencia semi-sólido en los tres sub-cultivos, correspondiendo los mejores resultados a la variante semi-sólida de los medios MS + 1mg/1 AIA+ 10 mg/16-BAP con promedio de 3.7 hijos por ex plante y 11 hijos en total, seguido por el medio MS_ + O mg/ AIA + 7 mg/1 6-BAP con 3.6 hijos por ex plante y 10.8 en total al final de los tres sub-cultivos. La menor proliferación se presentó en la variante líquida del medio MS + 1 mg/1 AIA + 10 mg/16-BAP con un promedio de 2.1 hijos por explante y 6.3 hijos en total. No se observó tendencia alguna en la proliferación de hijos con el aumento de los sub-cultivos, siendo evidente la influencia de la consistencia del medio de cultivo y la variación en los niveles de reguladores de crecimiento. El nivel más alto de 6-BAP (10 mg/1) utilizado indujo a la formación de multiyemas en los medios de cultivos líquidos, presentándose éstas a partir del II sub­ cultivo. Los medios de consistencia líquida favorecieron el crecimiento in vitro de los explantes, expresándose en un incremento en la altura y peso. Así mismo los medios líquidos indujeron a un desarrollo y crecimiento de raíces en todos los tratamientos estudiados.

Estudio preliminar del cultivo in vitro de ápices caulinares de quequisque (Xanthosoma sagittifolium L. Shott)

El presente trabajo se realizó en el Laboratorio de Cultivo de Tejidos Vegetales del Programa Recursos Genéticos Nicaraguenses (REGEN-UNA). En los ensayos realizados fueron estudiados 9 Concentraciones de hipoclorito de sodio en la desinfectación de los explantes de quequisque y se determinó que concentraciones entre 55% y 70% v/v, fueron las más adecuadas. Sin embargo, al estudiar el efecto del BAP, ANA y el efecto del Hipoclorito de Sodio sobre la tasa de crecimiento del tallo, se observó que las altas concentraciones de cloro utilizados en el proceso de desinfección del explante y la utilización de ANA en el medio nutritivo de establecimiento reducen la tasa de crecimiento. Por otra parte se observó que las concentraciones de BAP utilizadas no tuvieron ningún efecto sobre la tasa de crecimiento. En el estudio del efecto de 4 concentraciones de sacarosa (23 g, 30 g, 37 g y 44 g) las plantas mostraron una tasa de crecimiento similar. En la tasa de multiplicación acelerada, donde se estudió el efecto de la consistencia del medio sobre el ahijamiento no se observó diferencias y en la tasa de enraizamiento donde se evaluaron 3 niveles de AIA (0.0 mg/l y 0.1 mg/l). También no se encontró diferencia en cuanto a la formacion de raíces. El comportamiento de las Vitroplantas de quequisque en condiciones de vivero reflejo resultados satisfactorios las cuales mostraron una buena capacidad de adaptación siguiendo un normal crecimiento y desarrollo.

Estudio de la conservación in vitro a tasas minimas de crecimiento en piña (Ananas comosus L.) mediante el efecto de osmoreguladores y la dilucion de las sales Murashige y Skoog (1962) a temperaturas de 24ºC y 16 ºC

En el presente estudio se necesitó establecer explantes de piña (Ananas comosus L.) del cultivar Cayena lisa, de los cuales se utilizaron yemas apicales y axilares seleccionadas por su buen estado fisiológico y morfológico. Estas se establecieron en condiciones in vitro utilizando el medio de cultivo básico Murashige & Skoog MS (1962), suplementado con 2 mg/1 de 6-Bencil aminopurina (6-BAP) y 0.02 mg/1 de ácido naftalen acético (ANA) en condiciones controladas de temperatura, humedad relativa e intensidad lumínica. Una vez que se logró micropropagar la cantidad de explantes necesarios para la conservación, se procedió a la aplicación de los inhibidores del crecimiento (manito!y sorbitol) en concentraciones de 10, 20 y 30 g/1 y de la dilución de las sales MS al 25, 50 y 75%, interactuando con temperaturas de 24 oc y 16 oc. A los 120 días de haber permanecido las yemas axilares en las diferentes variantes de medios de cultivo sujetas a estudio, se observó mayor deterioro fisiológico y morfológico de las plántulas en los tratamientos con 1O, 20 y 30 g/1 demanitol y sorbitol. En las variables altura, número de hojas y color de las hojas se experimentaron menores incrementos mensuales, sin embargo se registraron mayores daños, especialmente en las hojas, las cuales presentaron un mayor porcentaje con color verde clorótico a temperaturas de 24ºc de 16 °C. La sobrevivencia fue mayor a temperatura de 16ºc, por el contrario en las diluciones de las sales MS el deterioro fisiológico y morfológico de lasplántulas fue menor, observándose mayor sobrevivencia, presentando mayores porcentajes de coloración verde oscuro y un pequeño porcentaje de plántulas atípicas a temperaturas de 24 °C y 16 °C. También fue notoria la presencia deplántulas atípicas en el manito! y sorbitol a temperatura de 24 °C. Únicamente en el tratamiento a 30 g/1 de sorbitol se observó el fenómeno de vitrificación a temperatura de 24ºc en un 15%. Las diluciones de las sales indujeron mejores resultados en altura, número de hojas y color de las hojas en ambas temperaturas, sus características fenotípicas y genotípicas se mantuvieron iguales a pesar de la reducción del crecimiento

Establecimiento y micropropagación de jengibre (Zingiber officinale Roscoe) colectado en el departamento de Carazo

El presente estudio se realizó en el laboratorio de cultivo de tejidos vegetales del Programa Recursos Genéticos Nicaragüenses (REGEN), perteneciente a la Facultad de Agronomia de la Universidad Nacional Agraria (UNA), ubicada en el km 12 1/2 de la carretera norte, Managua, Nicaragua. La realización del ensayo abarcó el tiempo comprendido entre los meses mayo y septiembre de 1997. El objetivo del mismo fue lograr el establecimiento de plántulas de jengibre (Zingiber officinale Roscoe) y la definición del medio de cultivo adecuado para la micropropagación de este cultivo. La fase de establecimiento se inició con 16 explantes los cuales se implantaron en un medio de cultivo sólido conteniendo sales minerales Murashige y Skoog (MS) (1962) más 2.5 mg/l de 6-BAP. En la fase de micropropagación se utilizaron diferentes concentraciones de 6-BAP (0.0, 2.5 y 5.0 mg/l) y dos consistencias del medio de cultivo (sólido y liquido), durante 3 subcultivos. El experimento se estableció utilizando el esquema diseño de Bloques Completamente al Azar (BCA). A los datos de las variables cuantitativas se les realizó un análisis de varianza (ANDEVA). En la fase de establecimiento el 18.75% de las plantas presentaron contaminación bacteriana, no se observó contaminación con hongos y el 81.25 % se desarrollaron satisfactoriamente. La mayor proliferación de hijos se obtuvo siempre en los medios de cultivo de consistencia sólida durante los 3 subcultivos, se utilizaron 12 repeticiones por tratamiento, en las cuales se evaluaron las variables número de hijos, número de hojas, altura de planta, número de raíces y longitud de raíces. El medio de cultivo que indujo a la producción del mayor número de hijos fue al que se le adicionó 5.0 mg/l de 6-BAP con un promedio de 1.55 hijos por explante. El mayor número de ralees se registró en el medio de cultivo sólido con 2.5 mg/1 del regulador del crecimiento 6-BAP, presentando un promedio de 6.19 raíces por planta. Los medios de consistencia líquida favorecieron tanto la altura de las plantas como el número de hojas. No hubo tendencia a aumentar o disminuir el número en las variables altura de planta, número de hijos y número de raíces con respecto al número de subcultivos.

Inducción de callos y micropropagación a partir de yemas adventicias de dos cultivares de quequisque (Xanthosoma sagittifolium (L) Schott

El presente estudio tuvo el objetivo de determinar el efecto combinado de los reguladores de crecimiento, tipos de explantes y genotipos estudiados en la inducción de callos y la micropropagación a partir de (YA) (inducción de yemas adventicias y generación de plantas), en los genotipos de quequisque Blanco y Masaya (Xanthosoma sagittifolium (L.) Schott). En el estudio de inducción de callos, se evaluaron medios de cultivo, tipos de explantes (hojas, ápices, peciolos y meristemos), uso de medios fresco y genotipos. En la fase de inducción de yemas adventicias se evaluaron medios de cultivos y genotipos; en la generación de plantas se utilizó un medio de cultivo (AIA 1.5 mgL-1 + 6-BAP 0.5 mgL-1). Para el análisis se representó gráficamente los datos no paramétricos evaluados en los diferentes estudios. Se obtuvo callos a partir de ápices, peciolos y meristemos, excepto en hojas. Los ápices presentaron mayor potencial para la formación de callos. El 2,4-D (1 - 5 mgL-1) fue la auxina que indujo a callos en un mayor número de medios, observándose la formación de callos en un promedio de 38.88 % de los medios que contenían 2,4-D a partir de explantes de ápices y 5.55 % en peciolos. El medio que contenía 6-BAP (2 mgL-1) indujo a callos en un promedio de 62.5 % de los meristemos de ambos genotipos. Al trasladar los explantes de peciolos del medio inicial a un medio fresco conteniendo ambos (2 mgL-1 2,4-D), se indujo a la formación de callos en un promedio de 29.6 %para ambos genotipos. El genotipo Blanco presentó mayor predisposición genética a la generación de callos que el Masaya. Se obtuvo (YA) en ambos genotipos, el genotipo Blanco presentó formación de (YA) en 100% de los medios estudiados y el Masaya en 85.71 %. El 6-BAP produjo mayor porcentaje de (YA) en comparación a la Kinetina, el 6-BAP (3 mgL-1) fue el mejor medio inductor de (YA) para ambos cultivares, en Masaya (85.71 %), y en Blanco (53.3 %) de los explantes sembrados. En la regeneración de plantas se encontró un efecto remanente de las citocininas utilizadas en la fase anterior, el cultivar Masaya presentó mayor formación de plantas.