Molecular mechanisms for the regulation of skin homeostasis

L'ubiquitination est une modification des protéines conservée, consistant en l'addition de résidus « ubiquitine » et régulant le destin cellulaire des protéines. La protéine « TRAF-interacting protein » TRAIP (ou TRIP) est une ligase E3 qui catalyse l'étape finale de l'ubiquitination. TRAIP est conservé dans l'évolution et est nécessaire au développement des organismes puisque l'ablation de TRAIP conduit à la mort embryonnaire aussi bien de la drosophile que de la souris. De plus, la réduction de l'expression de TRAIP dans des kératinocytes épidermiques humains réprime la prolifération cellulaire et induit un arrêt du cycle cellulaire en phase Gl, soulignant le lien étroit entre TRAIP et la prolifération cellulaire. Comme les mécanismes de régulation de la prolifération jouent un rôle majeur dans l'homéostasie de la peau, il est important de caractériser la fonction de TRAIP dans ces mécanismes. En utilisant des approches in vitro, nous avons déterminé que la protéine TRAIP est instable, modifiée par l'addition d'ubiquitine et ayant une demi-vie d'environ 4 heures. Nos analyses ont également révélé que l'expression de TRAIP est dépendante du cycle cellulaire, atteignant un pic d'expression en phase G2/M et que l'induction de son expression s'effectue principalement au cours de la transition Gl/S. Nous avons identifié le facteur de transcription E2F1 comme en étant le responsable, en régulant directement le promoteur de TRAIP. Aussi, TRAIP endogène ou surexprimée est surtout localisée au niveau du nucléole, une organelle nucléaire qui est désassemblée pendant la division cellulaire. Pour examiner la localisation subcellulaire de TRAIP pendant la mitose, nous avons imagé la protéine TRAIP fusionnée à une protéine fluorescente, à l'intérieur de cellules vivantes nommées HeLa, à l'aide d'un microscope confocal. Dans ces conditions, TRAIP est majoritairement localisée autour des chromosomes en début de mitose, puis est arrangée au niveau de l'ADN chromosomique en fin de mitose. La détection de TRAIP endogène à l'aide d'un anticorps spécifique a confirmé cette localisation. Enfin, l'inactivation de TRAIP dans les cellules HeLa par interférence ARN a inhibé leur capacité à s'arrêter en milieu de mitose. Nos résultats suggèrent que le mécanisme sous-jacent peut être lié au point de contrôle de l'assemblage du fuseau mitotique. - Ubiquitination of proteins is a post-translational modification which decides the cellular fate of the protein. The TRAF-interacting protein (TRAIP, TRIP) functions as an E3 ubiquitin ligase mediating addition of ubiquitin moieties to proteins. TRAIP interacts with the deubiquitinase CYLD, a tumor suppressor whose functional inactivation leads to skin appendage tumors. TRAIP is required for early embryonic development since removal of TRAIP either in Drosophila or mice by mutations or knock¬out is lethal due to aberrant regulation of cell proliferation and apoptosis. Furthermore, shRNA- mediated knock-down of TRAIP in human epidermal keratinocytes (HEK) repressed cell proliferation and induced a Gl/S phase block in the cell cycle. Additionally, TRAIP expression is strongly down- regulated during keratinocyte differentiation supporting the notion of a tight link between TRAIP and cell proliferation. We thus examined the biological functions of TRAIP in epithelial cell proliferation. Using an in vitro approach, we could determine that the TRAIP protein is unstable, modified by addition of ubiquitin moieties after translation and exhibits a half-life of 3.7+/-1-6 hours. Our analysis revealed that the TRAIP expression is modulated in a cell-cycle dependent manner, reaching a maximum expression level in G2/M phases. In addition, the expression of TRAIP was particularly activated during Gl/S phase transition and we could identify the transcription factor E2F1 as an activator of the TRAIP gene promoter. Both endogenous and over-expressed TRAIP mainly localized to the nucleolus, a nuclear organelle which is disassembled during cell division. To examine the subcellular localization of TRAIP during M phase, we performed confocal live-cell imaging of a functional fluorescent protein TRAIP-GFP in HeLa cells. TRAIP was distributed in the cytoplasm and accumulated around mitotic chromosomes in pro- and meta-phasic cells. TRAIP was then confined to chromosomal DNA location in anaphase and later phases of mitosis. Immune-detection of endogenous TRAIP protein confirmed its particular localization in mitosis. Finally, inactivating TRAIP expression in HeLa cells using RNA interference abrogated the cells ability to stop or delay mitosis progression. Our results suggested that TRAIP may involve the spindle assembly checkpoint.

HARNESSING iNKT CELLS WITH RECOMBINANT CD1d FUSION PROTEINS TO REDIRECT INNATE AND ADAPTIVE IMMUNITY TO THE TUMOR

Les thérapies du cancer, comme la radiothérapie et la chimiothérapie, sont couramment utilisées mais ont de nombreux effets secondaires. Ces thérapies invasives pour le patient nécessitent d'être améliorées et de nombreuses avancées ont été faites afin d'adapter et de personnaliser le traitement du cancer. L'immunothérapie a pour but de renforcer le système immunitaire du patient et de le rediriger de manière spécifique contre la tumeur. Dans notre projet, nous activons les lymphocytes Invariant Natural Killer T (iNKT) afin de mettre en place une immunothérapie innovatrice contre le cancer. Les cellules iNKT sont une unique sous-population de lymphocytes T qui ont la particularité de réunir les propriétés de l'immunité innée ainsi qu'adaptative. En effet, les cellules iNKT expriment à leur surface des molécules présentes aussi sur les cellules tueuses NK, caractéristique de l'immunité innée, ainsi qu'un récepteur de cellules T (TCR) qui représente l'immunité adaptative. Les cellules iNKT reconnaissent avec leur TCR des antigènes présentés par la molécule CD1d. Les antigènes sont des protéines, des polysaccharides ou des lipides reconnus par les cellules du système immunitaire ou les anticorps pour engendrer une réponse immunitaire. Dans le cas des cellules iNKT, l'alpha-galactosylceramide (αGC) est un antigène lipidique fréquemment utilisé dans les études cliniques comme puissant activateur. Après l'activation des cellules iNKT avec l'αGC, celles-ci produisent abondamment et rapidement des cytokines. Ces cytokines sont des molécules agissant comme des signaux activateurs d'autres cellules du système immunitaire telles que les cellules NK et les lymphocytes T. Cependant, les cellules iNKT deviennent anergiques après un seul traitement avec l'αGC c'est à dire qu'elles ne peuvent plus être réactivées, ce qui limite leur utilisation dans l'immunothérapie du cancer. Dans notre groupe, Stirnemann et al ont publié une molécule recombinante innovante, composée de la molécule CD1d soluble et chargée avec le ligand αGC (αGC/sCD1d). Cette protéine est capable d'activer les cellules iNKT tout en évitant l'anergie. Dans le système immunitaire, les anticorps sont indispensables pour combattre une infection bactérienne ou virale. En effet, les anticorps ont la capacité de reconnaître et lier spécifiquement un antigène et permettent l'élimination de la cellule qui exprime cet antigène. Dans le domaine de l'immunothérapie, les anticorps sont utilisés afin de cibler des antigènes présentés seulement par la tumeur. Ce procédé permet de réduire efficacement les effets secondaires lors du traitement du cancer. Nous avons donc fusionné la protéine recombinante αGC/CD1d à un fragment d'anticorps qui reconnaît un antigène spécifique des cellules tumorales. Dans une étude préclinique, nous avons démontré que la protéine αGC/sCD1d avec un fragment d'anticorps dirigé contre la tumeur engendre une meilleure activation des cellules iNKT et entraîne un effet anti-tumeur prolongé. Cet effet anti-tumeur est augmenté comparé à une protéine αGC/CD1d qui ne cible pas la tumeur. Nous avons aussi montré que l'activation des cellules iNKT avec la protéine αGC/sCD1d-anti-tumeur améliore l'effet anti- tumoral d'un vaccin pour le cancer. Lors d'expériences in vitro, la protéine αGC/sCD1d-anti- tumeur permet aussi d'activer les cellules humaines iNKT et ainsi tuer spécifiquement les cellules tumorales humaines. La protéine αGC/sCD1d-anti-tumeur représente une alternative thérapeutique prometteuse dans l'immunothérapie du cancer. - Les cellules Invariant Natural Killer T (iNKT), dont les effets anti-tumoraux ont été démontrés, sont de puissants activateurs des cellules Natural Killer (NK), des cellules dendritiques (DC) et des lymphocytes T. Cependant, une seule injection du ligand de haute affinité alpha-galactosylceramide (αGC) n'induit une forte activation des cellules iNKT que durant une courte période. Celle-ci est alors suivie d'une longue phase d'anergie, limitant ainsi leur utilisation pour la thérapie. Comme alternative prometteuse, nous avons montré que des injections répétées d'αGC chargé sur une protéine recombinante de CD1d soluble (αGC/sCD1d) chez la souris entraînent une activation prolongée des cellules iNKT, associée à une production continue de cytokine. De plus, le maintien de la réactivité des cellules iNKT permet de prolonger l'activité anti-tumorale lorsque la protéine αGC/sCD1d est fusionnée à un fragment d'anticorps (scFv) dirigé contre la tumeur. L'inhibition de la croissance tumorale n'est optimale que lorsque les souris sont traitées avec la protéine αGC/sCD1d-scFv ciblant la tumeur, la protéine αGC/sCD1d-scFv non-appropriée étant moins efficace. Dans le système humain, les protéines recombinantes αGC/sCD1d-anti-HER2 et anti-CEA sont capables d'activer et de faire proliférer des cellules iNKT à partir de PBMCs issues de donneurs sains. De plus, la protéine αGC/sCD1d-scFv a la capacité d'activer directement des clones iNKT humains en l'absence de cellules présentatrices d'antigènes (CPA), contrairement au ligand αGC libre. Mais surtout, la lyse des cellules tumorales par les iNKT humaines n'est obtenue que lorsqu'elles sont incubées avec la protéine αGC/sCD1d-scFv anti- tumeur. En outre, la redirection de la cytotoxicité des cellules iNKT vers la tumeur est supérieure à celle obtenue avec une stimulation par des CPA chargées avec l'αGC. Afin d'augmenter les effets anti-tumoraux, nous avons exploité la capacité des cellules iNKT à activer l'immunité adaptive. Pour ce faire, nous avons combiné l'immunothérapie NKT/CD1d avec un vaccin anti-tumoral composé d'un peptide OVA. Des effets synergiques ont été obtenus lorsque les traitements avec la protéine αGC/sCD1d-anti-HER2 étaient associés avec le CpG ODN comme adjuvant pour la vaccination avec le peptide OVA. Ces effets ont été observés à travers l'activation de nombreux lymphocytes T CD8+ spécifique de la tumeur, ainsi que par la forte expansion des cellules NK. Les réponses, innée et adaptive, élevées après le traitement avec la protéine αGC/sCD1d-anti-HER2 combinée au vaccin OVA/CpG ODN étaient associées à un fort ralentissement de la croissance des tumeurs B16- OVA-HER2. Cet effet anti-tumoral corrèle avec l'enrichissement des lymphocytes T CD8+ spécifiques observé à la tumeur. Afin d'étendre l'application des protéines αGC/sCD1d et d'améliorer leur efficacité, nous avons développé des fusions CD1d alternatives. Premièrement, une protéine αGC/sCD1d dimérique, qui permet d'augmenter l'avidité de la molécule CD1d pour les cellules iNKT. Dans un deuxième temps, nous avons fusionné la protéine αGC/sCD1d avec un scFv dirigé contre le récepteur 3 du facteur de croissance pour l'endothélium vasculaire (VEGFR-3), afin de cibler l'environnement de la tumeur. Dans l'ensemble, ces résultats démontrent que la thérapie médiée par la protéine recombinante αGC/sCD1d-scFv est une approche prometteuse pour rediriger l'immunité innée et adaptive vers le site tumoral. - Invariant Natural Killer T cells (iNKT) are potent activators of Natural Killer (NK), dendritic cells (DC) and T lymphocytes, and their anti-tumor activities have been well demonstrated. However, a single injection of the high affinity CD1d ligand alpha-galactosylceramide (αGC) leads to a strong but short-lived iNKT cell activation followed by a phase of long-term anergy, limiting the therapeutic use of this ligand. As a promising alternative, we have demonstrated that when αGC is loaded on recombinant soluble CD1d molecules (αGC/sCD1d), repeated injections in mice led to the sustained iNKT cell activation associated with continued cytokine secretion. Importantly, the retained reactivity of iNKT cell led to prolonged antitumor activity when the αGC/sCD1d was fused to an anti-tumor scFv fragments. Optimal inhibition of tumor growth was obtained only when mice were treated with the tumor-targeted αGC/CD1d-scFv fusion, whereas the irrelevant αGC/CD1d-scFv fusion was less efficient. When tested in a human system, the recombinant αGC/sCD1d-anti-HER2 and -anti-CEA fusion proteins were able to expand iNKT cells from PBMCs of healthy donors. Furthermore, the αGC/sCD1d-scFv fusion had the capacity to directly activate human iNKT cells clones without the presence of antigen-presenting cells (APCs), in contrast to the free αGC ligand. Most importantly, tumor cell killing by human iNKT cells was obtained only when co- incubated with the tumor targeted sCD1d-antitumor scFv, and their direct tumor cytotoxicity was superior to the bystander killing obtained with αGC-loaded APCs stimulation. To further enhance the anti-tumor effects, we exploited the ability of iNKT cells to transactivate the adaptive immunity, by combining the NKT/CD1d immunotherapy with a peptide cancer vaccine. Interestingly, synergistic effects were obtained when the αGC/sCD1d- anti-HER2 fusion treatment was combined with CpG ODN as adjuvant for the OVA peptide vaccine, as seen by higher numbers of activated antigen-specific CD8 T cells and NK cells, as compared to each regimen alone. The increased innate and adaptive immune responses upon combined tumor targeted sCD1d-scFv treatment and OVA/CpG vaccine were associated with a strong delay in B16-OVA-HER2 melanoma tumor growth, which correlated with an enrichment of antigen-specific CD8 cells at the tumor site. In order to extend the application of the CD1d fusion, we designed alternative CD1d fusion proteins. First, a dimeric αGC/sCD1d-Fc fusion, which permits to augment the avidity of the CD1d for iNKT cells and second, an αGC/sCD1d fused to an anti vascular endothelial growth factor receptor-3 (VEGFR-3) scFv, in order to target tumor stroma environment. Altogether, these results demonstrate that the iNKT-mediated immunotherapy via recombinant αGC/sCD1d-scFv fusion is a promising approach to redirect the innate and adaptive antitumor immune response to the tumor site.

Régulation de la lipoprotéine lipase macrophagique et de LOX-1 par des facteurs métaboliques. Implications dans l’athérosclérose associée au diabète de type 2.

Les maladies cardiovasculaires (MCV) sont la principale cause de décès dans les pays occidentaux et constituent la principale complication associée au diabète. La lipoprotéine lipase (LPL) est une enzyme clé du métabolisme des lipides et est responsable de l'hydrolyse des lipoprotéines riches en triglycérides (TG). Plusieurs études ont démontré que la LPL sécrétée par les macrophages dans la paroi artérielle est pro-athérogénique. La dysfonction endothéliale caractérise les stades précoces du processus athérosclérotique. Il a été observé qu’un récepteur nouvellement identifié des lipoprotéines de basse densité oxydées (LDLox), le récepteur de type lectine des LDLox (LOX-1), est fortement exprimé dans les lésions athérosclérotiques humaines et dans l’aorte de rats diabétiques, suggérant un rôle clé de LOX-1 dans la pathogénèse de l’athérosclérose diabétique. Au vu du rôle potentiel de la LPL macrophagique et du LOX-1 dans l’athérosclérose associée au diabète de type 2, nous avons évalué la régulation de ces deux molécules pro-athérogéniques par des facteurs métaboliques et inflammatoires augmentés dans le diabète, soit la leptine, l’acide linoléique (LA) et la protéine C-réactive (CRP). Nos résultats démontrent que : 1) Dans les cellules endothéliales aortiques humaines (HAECs), LA augmente l’expression protéique de LOX-1 de façon temps- et dose-dépendante; 2) La pré-incubation de HAECs avec des antioxydants et des inhibiteurs de la NADPH oxydase, de la protéine kinase C (PKC) et du facteur nucléaire-kappa B (NF-kB), inhibe l’effet stimulant de LA sur l’expression protéique de LOX-1; 3) Dans les HAECs traitées avec LA, on observe une augmentation d’expression des isoformes classiques de la PKC; 4) LA augmente de manière significative l’expression génique de LOX-1 ainsi que la liaison des protéines nucléaires extraites des HAECs à la séquence régulatrice NF-kB présente dans le promoteur du gène de LOX-1; 5) LA augmente, via LOX-1, la captation des LDLox par les cellules endothéliales. Pris dans leur ensemble, ces résultats démontrent que LA augmente l’expression endothéliale de LOX-1 in vitro et appuient le rôle clé de LA dans la dysfonction endothéliale associée au diabète. Au vu de nos études antérieures démontrant qu’une expression accrue de LPL macrophagique chez les patients diabétiques de type 2 et que l’augmentation de facteurs métaboliques dans cette maladie, soit l’homocystéine (Hcys), les acides gras et les produits terminaux de glycation (AGE), accroissent l’expression de la LPL macrophagique, nous avons par la suite déterminé l’effet, in vitro, de deux autres facteurs métaboliques et inflammatoires surexprimés dans le diabète, soit la leptine et la CRP, sur l’expression de la LPL macrophagique. Les concentrations plasmatiques de leptine sont élevées chez les patients diabétiques et sont associées à un accroissement des risques cardiovasculaires. Nous avons démontré que : 1) Dans les macrophages humains, la leptine augmente l’expression de la LPL, tant au niveau génique que protéique; 2) L’effet stimulant de la leptine sur la LPL est aboli par la pré-incubation avec un anticorps dirigé contre les récepteurs à la leptine (Ob-R), des inhibiteurs de la PKC et des antioxydants; 3) La leptine augmente l’expression membranaire des isoformes classiques de la PKC et la diminution de l’expression endogène de la PKC, abolit l’effet de la leptine sur l’expression de la LPL macrophagique; 4) Dans les macrophages murins, la leptine augmente le taux de synthèse de la LPL et augmente la liaison de protéines nucléaires à la séquence protéine activée-1 (AP-1) du promoteur du gène de la LPL. Ces observations supportent la possibilité que la leptine puisse représenter un facteur stimulant de la LPL macrophagique dans le diabète. Finalement, nous avons déterminé, in vitro, l’effet de la CRP sur l’expression de la LPL macrophagique. La CRP est une molécule inflammatoire et un puissant prédicteur d’événements cardiovasculaires. Des concentrations élevées de CRP sérique sont documentées chez les patients diabétiques de type 2. Nous avons démontré que : 1) Dans les macrophages humains, la CRP augmente l’expression de la LPL au niveau génique et protéique et la liaison de la CRP aux récepteurs CD32 est nécessaire pour médier ses effets; 2) La pré-incubation de macrophages humains avec des antioxydants, des inhibiteurs de la PKC et de la protéine kinase mitogénique activée (MAPK), prévient l’induction de la LPL par la CRP; 3) La CRP augmente l’activité de la LPL, la génération intracellulaire d’espèces radicalaires oxygénées (ROS), l’expression d’isoformes classiques de la PKC et la phosphorylation des kinases extracellulaires régulées 1/2 (ERK 1/2); 4) Les macrophages murins traités avec la CRP démontrent une augmentation de la liaison des protéines nucléaires à la séquence AP-1 du promoteur du gène de la LPL. Ces données suggèrent que la LPL puisse représenter un nouveau facteur médiant les effets délétères de la CRP dans la vasculopathie diabétique. Dans l’ensemble nos études démontrent le rôle clé de facteurs métaboliques et inflammatoires dans la régulation vasculaire de la LPL et du LOX-1 dans le diabète. Nos données suggèrent que la LPL et le LOX-1 puissent représenter des contributeurs clé de l’athérogénèse accélérée associée au diabète chez l’humain. Mots-clés : athérosclérose, maladies cardiovasculaires, diabète de type 2, macrophage, LPL, cellules endothéliales, LOX-1, stress oxydatif, leptine, LA, CRP.

Étude des interactions protéiques impliquant NPM-MLF1 dans la leucémie myéloïde aiguë.

Différentes translocations génomiques sont fréquemment associées à l'apparition de leucémies myéloïdes aiguës (LMA). Ces translocations génomiques résultent de l’assemblage de deux gènes conduisant à la production d'une protéine de fusion. C'est le cas de la translocation t (3; 5) (q25.1; q34) impliquant le suppresseur tumoral NPM et l'oncogène MLF1 donnant naissance à la protéine de fusion NPM-MLF1. Généralement, les gènes impliqués dans ces translocations contrôlent la croissance cellulaire, la différenciation ou la survie cellulaire. Cependant, pour NPM-MLF1 les causes du gain ou de la perte de fonction associée à la translocation demeurent inconnues car nous ne savons pas comment cette translocation peut favoriser ou participer à l'avènement de la LMA. Le but de ce travail est d’analyser le rôle de NPM-MLF1 dans le cancer et d’examiner comment son activité contribue à la leucémie en faisant des études d’interactions protéine/protéine. En effet, l’étude de la fonction d’une protéine implique souvent de connaître ses partenaires d’interactions. Pour ce faire, la technique de double hybride dans la souche de levure AH109 a été utilisée. Tout d’abord, les ADN complémentaires (ADNc) de MLF1, NPM1 et de NPM-MLF1, MLF1-Like (une partie de MLF1 de l’acide aminé 94 à 157) normaux et mutés du domaine MTG8-Like constitué des acides aminés (a.a.) 151 à 164 de MLF1 (excepté NPM) ont été clonés dans un vecteur d'expression de levure pGBKT7. Les ADNc de GFI-1, mSin3A, PLZF, HDAC1 et HDAC3 ont été clonés dans le plasmide pGADT7 de façon à créer des protéines de fusion synthétiques avec le domaine de liaison à l'ADN et de trans-activation de la protéine GAL4. Le plasmide pGBKT7 possède un gène TRP1 et pGADT7 un gène LEU2 qui permettent la sélection des clones insérés dans la levure. Aussi, le pGBKT7 a un épitope c-myc et pGADT7 un épitope HA qui permet de voir l’expression des protéines par buvardage de type Western. Après la transformation des levures les interactions protéine/protéine ont été observées en vérifiant l’expression des gènes rapporteurs HIS3, LacZ, MEL1, ADE2 de la levure en utilisant des milieux de sélection YPD/-Leu/-Trp, YPD/-Leu/-Trp/-His, YPD/-Leu/-Trp/-His/-Ade, YPD/-Leu/-Trp/+ X-Gal, YPD/-Leu/-Trp/ + X-α-Gal. Ensuite, les interactions trouvées par double-hybride ont été vérifiées dans les cellules érythroleucémiques K562 par immuno-précipitation (IP) de protéines suivies de buvardages Westerns avec les anticorps appropriés. NPM-MLF1, MLF1, MTG8, MLF1-Like surexprimés dans les cellules K562 ont été clonés dans le plasmide pOZ-FH-N. pOZ-FH-N possède un récepteur IL-2 qui permet de sélectionner les cellules qui l’expriment ainsi qu’un tag Flag-HA qui permet de voir l’expression des protéines par buvardage-Western. Les résultats du double-hybride suggèrent une interaction faible de NPM-MLF1 avec HDAC1, HDAC3 et mSin3A ainsi qu’une interaction qui semble plus évidente entre NPM-MLF1 et PLZF, GFI-1. NPM interagit avec GFI-1 et mSin3A. Aussi, MLF1 et MLF1-Like interagissent avec HDAC1, HDAC3, GFI-1, PLZF mais pas avec mSin3A. Les IP suggèrent que NPM-MLF1 interagit avec HDAC1, HDAC3, mSin3A et PLZF. MLF1 et MLF1-Like interagissent avec HDAC1, HDAC3 et mSin3A. L’interaction de NPM-MLF1 avec GFI-1, MLF1 et MLF1-Like avec PLZF et GFI-1 n’a pas encore été vérifiée par IP. Ainsi, nos observations permettent de suggérer que NPM-MF1, MLF1 et NPM pourraient jouer un rôle dans la transcription et la régulation de l’expression de certains gènes importants dans l’hématopoïèse et une variété de processus cellulaires parce qu’ils interagissent avec différents corépresseurs. En déterminant les partenaires protéiques de MLF1, NPM et NPM-MLF1, leurs fonctions et comment NPM-MLF1 influence et modifie le fonctionnement cellulaire normal; il sera possible de renverser le processus de LMA favorisé par la t (3; 5) NPM-MLF1 par la technologie d’interférence à l’ARN.

Modulation de l’expression du gène CFTR par le produit du gène FIC1 responsable de la cholestase familiale intra-hépatique progressive de type 1 : Identification des mécanismes moléculaires impliqués

Réalisé en cotutelle avec l'Université de Cergy-Pontoise

Étude du rôle régulateur de la lamine B1 dans l’activation plaquettaire : base moléculaire de la thromboprotection chez les patients porteurs d'anticoagulant lupique et d'anti-lamine B1

Les anticorps anti-phospholipides (aPL), tels que les anticoagulants lupiques (LAC), sont associés au développement récurrent de thromboses chez les patients atteints du lupus érythémateux disséminé (LED). Il a été observé que des titres élevés d’auto-anticorps antilamine B1 (anti-LB1), chez des patients porteurs de LAC, diminuent le risque de ces manifestations thrombotiques. Toutefois, la relation existant entre la lamine B1 (LB1), les anti-LB1 et la thromboprotection n’est toujours pas expliquée. Dans cette étude, nous avons donc cherché à comprendre comment la LB1 et les anti-LB1 induisent cette thromboprotection. Nous avons testé les effets d'anti-LB1 purifiés et de LB1 recombinante sur l'activation des cellules endothéliales et des plaquettes. Nous avons été en mesure de déterminer que la LB1, contrairement aux anti-LB1, possède une activité anti-plaquettaire. En effet, la LB1 réduit l’activation et l’agrégation plaquettaires in vitro et in vivo. Cette activité est due à une liaison directe de la LB1 aux plaquettes, suivie par une internalisation rapide dans des vésicules de clathrine. Par co-immunoprécipitation, nous avons découvert que la LB1 interagit avec le récepteur de l’insuline situé sur la membrane plaquettaire. La liaison de la LB1 à ce récepteur entraîne vraisemblablement son internalisation et l'inhibition d'une des cascades de signalisation normalement induite par le récepteur de l’insuline, menant éventuellement à l’inhibition des fonctions plaquettaires. L’ajout d’anti-LB1 purifiés dans nos expériences a permis d'augmenter de façon significative la persistance de la LB1 dans les plaquettes, une observation confirmée par la détection de LB1 uniquement dans les lysats de plaquettes prélevées chez des patients anti-LB1 positifs. iv Nos résultats suggèrent que la LB1 prend part aux mécanismes régulateurs des processus d’hémostase chez des sujets sains et que la présence d’anti-LB1, chez les patients lupiques, prolonge la persistance de cet auto-antigène dans les plaquettes, les empêchant ainsi de s’activer. Ce mécanisme expliquerait la diminution du risque de thrombose chez les patients LAC positifs porteurs d’anti-LB1 circulants.

Rôles physiopathologiques du complément dans le syndrome coronarien aigu et implications thérapeutiques

Les efforts investis pour diminuer les risques de développer un infarctus du myocarde sont nombreux. Aujourd’hui les médecins prennent connaissance des divers facteurs de risque connus prédisposant aux syndromes coronariens aigus (SCA) dans le but de prendre en charge les patients «à risque» [1]. Bien que le suivi rigoureux et le contrôle de certains facteurs de risque modifiables aient permis une meilleure gestion des cas de SCA, les cas d’infarctus persistent de manière encore trop fréquente dans le monde. Puisque d’importantes études ont démontré que les SCA pouvaient survenir sans même la présence des facteurs de risque conventionnels [2, 3], les chercheurs se sont penchés sur un autre mécanisme potentiellement responsable de l’avènement des SCA : l’inflammation. L’inflammation joue un rôle prépondérant dans l’initiation, la progression et les complications de l’athérosclérose [4, 5] mais aussi dans les situations post-infarctus [6, 7]. Au cours des dernières années, le contrôle du processus inflammatoire est devenu une cible de choix dans la prévention et le traitement des SCA. Cependant, malgré les efforts investis, aucun de ces traitements ne s’est avéré pleinement efficace dans l’atteinte du but ultime visé par une diminution de l’inflammation : la diminution de la mortalité. Le complément est un système complexe reconnu principalement pour son rôle primordial dans l’immunité [2]. Cependant, lorsqu’il est activé de manière inappropriée ou excessive, il peut être à l’origine de nombreux dommages cellulaires caractéristiques de plusieurs pathologies inflammatoires dont font partie les complications de l’athérosclérose et des événements post-infarctus. Le travail effectué dans le cadre de mon doctorat vise à établir les rôles physiopathologiques du complément dans les interactions de l’axe thrombose-inflammation caractéristiques des SCA dans le but ultime d’identifier des cibles thérapeutiques permettant le développement de nouvelles approches pour la prévention et le traitement de ces pathologies. Les principaux résultats obtenus durant mon cursus suggèrent d’abord que la voie alterne du complément peut représenter une cible thérapeutique de choix dans les maladies coronariennes aiguës puisque l’activation terminale du complément semble y être principalement causée par l’activation du cette voie. De faibles niveaux sériques de MBL (mannan-binding lectin) et une activation terminale négligeable du complément caractérisent plutôt la maladie coronarienne stable. En comparant l’activité relative de chacune des voies du complément chez des cohortes de patients traités ou non par un anticorps spécifique à la protéine C5 du complément (pexelizumab), un second volet démontre quant à lui qu’une inhibition de l’activation du C5 n’a pas d’effet bénéfique majeur sur l’inhibition de la formation du complexe sC5b-9 ou sur les événements cliniques subséquents. Par conséquent, nous avons exploré, à l’aide d’un modèle in vitro, les raisons de l’inefficacité du traitement. Les résultats révèlent que le blocage du C5 avec le pexelizumab inhibe la production de l’anaphylatoxine pro-inflammatoire C5a et du complexe terminal du complément sans toutefois avoir d’effet sur l’apoptose des cellules endothéliales produites induite par le sérum des patients atteints de STEMI. Finalement, une autre section stipule que l’atorvastatine diminue l’activation du complément induite par les plaquettes sanguines chez des patients hypercholestérolémiques, mettant en évidence l’importance du rôle de cette statine dans la réduction des effets délétères de l’activation du système du complément médié par les plaquettes. Ensemble, l’étude du rôle spécifique des différentes voies d’activation du complément dans des contextes pathologiques variés, l’analyse des effets d’une inhibition spécifique de la protéine C5 du complément dans la progression des SCA et la mise en évidence des interactions entre l’activation du complément et les plaquettes activées ont contribué au développement d’une meilleure connaissance des rôles physiopathologiques du complément dans la progression de la maladie coronarienne.

Caractérisation du co-transporteur Na+/myo-inositol SMIT2 dans les membranes en bordure en brosse de rein de lapin et d’intestin de rat

Le myo-inositol (MI) est un soluté organique impliqué dans diverses fonctions physiologiques de la cellule dont la signalisation cellulaire. Il est également un osmolyte compatible reconnu. Trois co-transporteurs de type actif secondaire responsables de son absorption ont été identifiés. Deux d’entre eux sont couplés au transport du sodium (SMIT1 et SMIT2) et le troisième est couplé au transport de protons (HMIT). L’objectif de cette étude a été la caractérisation du transport du MI par SMIT2 dans des membranes en bordure en brosse (BBMv) issues du rein de lapin et de l’intestin de rat ainsi qu’après expression dans les ovocytes de Xenopus laevis. La quantification de l’ARNm de SMIT1 et de SMIT2 dans le rein nous a appris que SMIT1 est majoritairement présent dans la médullaire alors que SMIT2 est principalement localisé dans le cortex. Ces résultats ont été confirmés par immunobuvardage en utilisant un anticorps dirigé contre SMIT2. Grâce à l’inhibition sélective de SMIT1 par le L-Fucose et de SMIT2 par le D-chiro-inositol (DCI), nous avons démontré que SMIT2 semble le seul responsable du transport luminal de MI dans le tubule contourné proximal avec un Km de 57 ± 14 µM. Pour ce qui est de l’intestin, des études de transport de MI radioactif ont démontré une absence de transport de MI chez le lapin alors que l’intestin de rat présente un transport de MI très actif. Une quantification par qRT-PCR nous a permis de constater que l’intestin de lapin ne semble pas posséder les transporteurs de MI nécessaires. Comme pour le rein, SMIT2 semble le seul transporteur de MI présent au niveau du pôle apical des entérocytes intestinaux chez le rat. Il est chargé du prélèvement du MI de l'alimentation avec un Km de 150 ± 40 µM. Les analyses fonctionnelles exécutées sur SMIT2 de rat en électrophysiologie après expression dans les ovocytes de Xenopus laevis donnent sensiblement les mêmes résultats que pour les BBMv de rein de lapin et d’intestin de rat. Dans les ovocytes, SMIT2 présente une grande affinité pour le MI (270 ± 19 µM) et le DCI (310 ± 60 µM) et aucune affinité pour le L-fucose. Il est ii également très sensible à la phlorizine (16 ± 7 µM). Une seule exception persiste : la constante d’affinité pour le glucose dans les BBMv d’intestin de rat est 40 fois plus petite que celle observée sur les ovocytes de Xenopus laevis. Nous avons également testé la capacité de certains transporteurs de sucre présents à la surface des membranes apicales des entérocytes à prélever le MI. Vu que l'inhibition de ces transporteurs (SGLT1 et GLUT5) ne changeait rien au taux de MI radioactif transporté, nous en avons conclu qu'ils ne sont pas impliqués dans son transport. Finalement, l’efflux de MI à partir du pôle basolatéral des entérocytes n’est pas effectué par GLUT2 puisque ce dernier lorsqu'il est exprimé dans des ovocytes, est incapable de transporter le MI.

The role of DcR3 in systemic lupus erythematosus and islet β-Cell viability and function

Le récepteur DcR3 (Decoy receptor 3) est un membre de la famille des récepteurs aux facteurs de nécrose tumorale (TNF). Il est fortement exprimé dans les tissus humains normaux ainsi que les tumeurs malignes. DcR3 est un récepteur pour trois ligands de la famille du TNF tels que FasL, LIGHT et TL1A. Étant une protéine soluble donc dépourvue de la portion transmembranaire et intracytoplasmique, le récepteur DcR3 est incapable d’effectuer une transduction de signal intracellulaire à la suite de son interaction avec ses ligands. De ce fait, DcR3 joue un rôle de compétiteur pour ces derniers, afin d’inhiber la signalisation via leurs récepteurs fonctionnels tels que Fas, HVEM/LTbetaR et DR3. Lors de nos précédentes études, nous avons pu démontrer, que DcR3 pouvaist moduler la fonction des cellules immunitaires, et aussi protéger la viabilité des îlots de Langerhans. À la suite de ces résultats, nous avons généré des souris DcR3 transgéniques (Tg) en utilisant le promoteur du gène β-actine humaine afin d’étudier plus amplement la fonction de ce récepteur. Les souris Tg DcR3 ont finalement développé le syndrome lupus-like (SLE) seulement après l’âge de 6 mois. Ces souris présentent une variété d'auto-anticorps comprenant des anticorps anti-noyaux et anti-ADN. Elles ont également manifesté des lésions rénales, cutanées, hépatiques et hématopoïétiques. Contrairement aux modèles de lupus murin lpr et gld, les souris DcR3 sont plus proche du SLE humain en terme de réponse immunitaire de type Th2 et de production d'anticorps d'anti-Sm. En péus, nous avons constaté que les cellules hématopoïétiques produisant DcR3 sont suffisantes pour causer ces pathologies. DcR3 peut agir en perturbant l’homéostasie des cellules T pour interférer avec la tolérance périphérique, et ainsi induire l'autoimmunité. Chez l'humain, nous avons détecté dans le sérum de patients SLE des niveaux élevés de la protéine DcR3. Chez certains patients, comme chez la souris, ces niveaux sont liés directement aux titres élevés d’IgE. Par conséquent, DcR3 peut représenter un facteur pathogénique important du SLE humain. L’étude des souris Tg DcR3, nous a permis aussi d’élucider le mécanisme de protection des îlots de Langerhans. Le blocage de la signalisation des ligands LIGHT et TL1A par DcR3 est impliqué dans une telle protection. D'ailleurs, nous avons identifié par ARN microarray quelques molécules en aval de cette interaction, qui peuvent jouer un rôle dans le mécanisme d’action. Nous avons par la suite confirmé que Adcyap1 et Bank1 joue un rôle critique dans la protection des îlots de Langerhans médiée par DcR3. Notre étude a ainsi élucidé le lien qui existe entre la signalisation apoptotique médiée par Fas/FasL et la pathogénèse du SLE humain. Donc, malgré l’absence de mutations génétiques sur Fas et FasL dans le cas de cette pathologie, DcR3 est capable de beoquer cette signalisation et provoquer le SLE chez l’humain. Ainsi, DcR3 peut simultanément interférer avec la signalisation des ligands LIGHT et TL1A et causer un phénotype plus complexe que les phénotypes résultant de la mutation de Fas ou de FasL chez certains patients. DcR3 peut également être utilisé comme paramètre diagnostique potentiel pour le SLE. Les découvertes du mécanisme de protection des îlots de Langerhans par DcR3 ouvrent la porte vers de nouveaux horizons afin d'explorer de nouvelles cibles thérapeutiques pour protéger la greffe d'îlots.

Les gènes et protéines BSP chez la souris et l’humain : clonage, caractérisation, expression sous forme recombinante et étude des fonctions biologiques

L’infertilité affecte environ 15% des couples en âge de se reproduire. Dans près de la moitié des cas, des facteurs masculins sont à la base de l’infertilité, quoique les causes exactes demeurent souvent inconnues. Les spermatozoïdes de mammifères subissent une série d’étapes de maturation avant d’acquérir la capacité de féconder un ovocyte. Les premiers changements ont lieu à l’intérieur de l’épididyme, où les spermatozoïdes gagnent la capacité de se mouvoir ainsi que de reconnaître et d’interagir avec l’ovocyte. Suite à l’éjaculation, ils doivent subir une seconde série de modifications à l’intérieur du tractus génital femelle, nommée capacitation. Nous avons préalablement démontré que chez le bovin, la famille de protéines BSP (Binder of SPerm) est essentielle à la capacitation. Des homologues des BSP ont aussi été isolés du fluide séminal de porc, de bouc, de bélier, de bison et d’étalon. Malgré la détection d’antigènes apparentés aux BSP dans le fluide séminal de souris et d’humain, les homologues des BSP n’ont jamais été caractérisés chez ces espèces. Nous avons émis l’hypothèse que des homologues des BSP seraient exprimés chez la souris et l’humain et joueraient un rôle dans la maturation des spermatozoïdes. Nous avons démontré que des séquences homologues aux BSP sont présentes dans les génomes murin et humain. Le génome murin contient trois séquences; Bsph1, Bsph2a et Bsph2b, tandis qu’une seule séquence (BSPH1) a été identifée chez l’humain. Les séquences d’ADNc de Bsph1, Bsph2a et BSPH1 ont été clonées, tandis que Bsph2b serait probablement un pseudogène. Les trois gènes sont exprimés uniquement dans l’épididyme et font partie d’une sous-famille distincte à l’intérieur de la famille des BSP. Chez les ongulés, les BSP sont exprimées par les vésicules séminales, sont ajoutées aux spermatozoïdes lors de l’éjaculation et représentent une proportion significative des protéines du plasma séminal. Au contraire, les BSP épididymaires ne sont retrouvées qu’en faibles quantités dans le fluide séminal. L’étude de leur rôle dans les fonctions spermatiques était donc plus difficile que chez les ongulés, où l’isolement des protéines natives du plasma séminal à l’aide de techniques de chromatographie était possible. Afin d’étudier sa fonction, nous avons exprimé BSPH1 recombinante dans E. coli. Les ponts disulfure des domaines de type-II caractéristiques de ces protéines ont fait en sorte que l’expression de BSPH1 fusionnée à une étiquette hexahistidine ou glutathion-S-transférase a donné lieu à des protéines insolubles dans les corps d’inclusion. La production de BSPH1 soluble a été possible grâce à l’ajout d’une étiquette thiorédoxine et l’expression dans une souche au cytoplasme oxidatif. BSPH1 a été purifiée par affinité et sa liaison aux partenaires connus des BSP, la phosphatidylcholine, les lipoprotéines de faible densité et la membrane des spermatozoïdes, suggérait que la protéine recombinante possédait sa conformation native et pouvait être utilisée pour des essais fonctionnels. La forme native de BSPH1 a été détectée dans le plasma séminal humain suite au fractionnement par gel filtration. La liaison de BSPH1 native à une colonne d’affinité à l’héparine a indiqué qu’elle partage aussi cette propriété de liaison avec la famille des BSP, et pourrait lier les GAGs semblables à l’héparine du tractus génital féminin. Une colonne d’immunoaffinité anti-BSPH1 a été préparée à l’aide d’anticorps générés contre des protéines recombinantes, et a permis d’isoler BSPH1 native à partir d’extraits de spermatozoïdes humains. Nos résultats montrent que BSPH1 native serait localisée dans les microdomaines « rafts » de la membrane. Sa masse moléculaire apparente était de 32 kDa, ce qui est supérieur à la masse prédite selon sa séquence en acides aminés, indiquant la présence probable de modifications post-traductionnelles, ou d’une migration anormale. L’effet de BSPH1 recombinante et des anticorps anti-BSPH1 sur la motilité, la viabilité et la capacitation a aussi été étudié. Les deux dernières variables ont été mesurées par un essai de cytométrie en flux, optimisé dans cette étude. Aucun effet des protéines recombinantes ou des anticorps sur la motilité et la viabilité des spermatozoïdes n’a été noté. Quoiqu’une stimulation modeste, quoique significative, de la capacitation ait été observée à la plus faible concentration de BSPH1, les concentrations plus élevées n’ont pas montré d’effet. De la même manière, les anticorps anti-BSPH1 n’ont pas eu d’effet significatif sur la capacitation. Ces résultats suggèrent que BSPH1 produite dans E. coli n’affecte pas la capacitation de façon marquée. Cependant, puisque BSPH1 native possède probablement des modifications post-traductionnelles, une protéine recombinante produite dans des cellules de mammifères pourrait affecter les fonctions spermatiques. De manière alternative, les BSP épididymaires remplissent peut-être un rôle différent dans les fonctions spermatiques que celles sécrétées par les vésicules séminales des ongulés. Les résultats décrits dans cette thèse pourraient contribuer à améliorer le diagnostic de l’infertilité masculine, ainsi que les techniques de reproduction assistée et éventuellement, pourraient mener au développement de contraceptifs masculins.

Rôle de l’extrémité C-terminale dans l’expression du canal calcique Cav1.2 à la membrane plasmique

Le canal calcique de type L, Cav1.2, joue un rôle clé dans le couplage excitation-contraction des myocytes ventriculaires. Il a été montré que la sous-unité Cavα1 était sujette à l’épissage alternatif et que ce phénomène pouvait mener à une protéine tronquée en C-terminal au niveau de l’exon 45 (Liao, Yong et al. 2005). D’autres groupes ont étudié différentes délétions au niveau de l’extrémité C-terminale (De Jongh, Warner et al. 1991; Gao, Cuadra et al. 2001). Les courants mesurés dans la configuration cellule entière, était significativement plus grands que le canal « pleine longueur ». Nous avons décidé de tester certaines de ces délétions (ΔC2030, ΔC1935, ΔC1856, ΔC1733, ΔC1700) en présence ou en absence de la sous-unité auxiliaire Cavβ3, susceptible d’interagir avec l’extrémité C-terminale de la sous-unité Cavα1 par l’intermédiaire de son domaine SH3 (Lao, Kobrinsky et al. 2008). Les résultats obtenus dans les ovocytes de Xénope ont mis en évidence que les sous-unités Cavα1.2 tronquées montraient des courants globaux plus élevés que le canal « pleine longueur » en présence de la sous-unité auxiliaire Cavβ3 et que les sous-unités Cavα1.2 tronquées donnaient des courants en absence de la sous-unité Cavβ3 contrairement à la sous-unité Cavα1.2 « pleine longueur ». Afin de vérifier si l’augmentation des courants macroscopiques était le résultat d’une augmentation du nombre de sous-unités Cavα1.2 à la membrane, nous avons choisi de quantifier la fluorescence spécifiquement due à cette sous-unité en utilisant la méthode de cytométrie de flux (FACS : « Fluorescence Activated Cell Sorting »). L’épitope HA a été inséré dans une région extracellulaire de la sous-unité Cavα1 du canal calcique Cav1.2 et un anticorps anti-HA couplé au FITC (« Fluorescein IsoThioCyanate ») a été utilisé pour observer la fluorescence. Nos résultats confirment que la sous-unité Cavα1-HA du canal calcique Cav1.2, s’exprime à la membrane plasmique en présence de la sous-unité auxiliaire Cavβ3, et qu’en absence de celle-ci, ne s’exprime que peu ou pas à la membrane. Les mêmes résultats ont été obtenus pour les trois délétions testées dans les mêmes conditions soit Cavα1.2-HA ΔC1935, Cavα1.2-HA ΔC1856 et Cavα1.2-HA ΔC1733. Ensemble, ces résultats suggèrent que l’augmentation des courants macroscopiques observés après une délétion partielle du C-terminal n’est pas causée par une augmentation du nombre de protéines Cavα1.2 à la membrane.

Rôle de la molécule CD47 sur le lymphocyte T dans la régulation de la réponse immunitaire

L’importance respective des lymphocytes T régulateurs naturels générés dans le thymus ou induits en périphérie dans la régulation immunitaire et la résolution de l’inflammation est désormais bien établie. Nous avons contribué à mettre en évidence une nouvelle voie d’induction de lymphocytes T régulateurs périphériques à partir de cellules T humaines CD4+CD25- naïves et mémoires. Nous avons montré que l’engagement de la molécule ubiquitaire transmembranaire CD47 sur la cellule T par un anticorps monoclonal ou par le peptide 4N1K (peptide dérivé du domaine carboxy-terminal de la thrombospondine-1 et spécifique du site de liaison à CD47) induisait des lymphocytes T CD4+ régulateurs exerçant une fonction suppressive sur les lymphocytes T effecteurs. Les propriétés suppressives induites par la thrombospondine-1 confortent les fonctions anti-inflammatoires de cette protéine de la matrice extracellulaire. L’inhibition exercée par les lymphocytes T régulateurs induits dépend du contact intercellulaire entre les cellules T régulatrices et leurs cibles, et est indépendante du TGF-. Nos résultats démontrent également le rôle de CD47 sur le lymphocyte T CD4+ dans la réponse immunitaire spécifique de l’antigène in vivo. En effet, les souris BALB/c déficientes pour CD47 présentent un biais de la sécrétion d’anticorps et de cytokines de type Th1, alors que les souris BALB/c sont décrites comme exprimant un profil de production de cytokines de type Th2. Nos travaux mettent en évidence le rôle de CD47 dans l’inhibition du développement d’une réponse cellulaire et humorale de type Th1 in vivo, confirmant de précédentes études in vitro réalisées avec des cellules T CD4+ humaines. Nous présentons également le rôle inhibiteur de l’engagement de CD28 in vitro sur la différenciation en cellules Th17 des lymphocytes T CD4+ naïfs isolés de souris BALB/c. Le mécanisme proposé est dépendant de la production de l’IL-2 et de l’IFN- et indépendant de la présence de lymphocytes T régulateurs. Notre étude du rôle de deux molécules transmembranaires CD47 et CD28 exprimées sur la cellule T CD4+, contribue à une meilleure connaissance des mécanismes impliqués dans la tolérance immunologique, la résolution de l’inflammation et la différenciation des cellules T "helper" CD4+.

Systèmes vésiculaires colloïdaux pour la vectorisation de la 1-β-D-arabinofuranosylcytosine

La 1-β-D-arabinofuranosylcytosine (ara-C) demeure l’agent anticancéreux principalement utilisé dans le traitement de la leucémie myéloblastique aiguë (LMA), malgré sa dégradation et son élimination rapide après une administration parentérale. Son encapsulation dans des vecteurs pharmaceutiques, majoritairement des liposomes, a permis de surmonter ces inconvénients. L’objectif général de ce projet de doctorat était de développer deux systèmes à libération prolongée, à base de phospholipides, de cholestérol et de poly(éthylène glycol) (PEG) afin d’encapsuler l’ara-C et ultimement, d’améliorer son efficacité dans le traitement de la LMA. Des Sphérulites® (vésicules multilamellaires d’un type particulier) ont d’abord été étudiées pour leur forte capacité d’encapsulation, due à leur mode de préparation. Par la suite, une formulation liposomale capable, d’une part de cibler spécifiquement les cellules leucémiques et, d’autre part, de promouvoir la libération intracellulaire de l’ara-C grâce à sa sensibilité au pH, a été mise au point. Les deux formulations se devaient d’avoir un faible diamètre, une stabilité en présence de fluides biologiques et des temps de circulation prolongés chez l’animal. Une préparation de Sphérulites®, composée de Phospholipon 90G, de Solutol HS15 et de cholestérol, a permis d’obtenir des vésicules de 300 nm de diamètre. Un dérivé lipidique de PEG a pu être fixé à leur surface, sans modifier la disposition concentrique des lamelles, ni changer leur stabilité. Les Sphérulites® PEGylées ont été chargées d’ara-C et injectées chez le rat par la voie intraveineuse. Elles ont démontré des temps de circulation significativement prolongés comparativement aux Sphérulites® sans PEG. Cependant, l’ara-C s’est retrouvée éliminée de la circulation sanguine très rapidement, révélant une libération précoce du principe actif à partir de ces vésicules. Les liposomes sensibles au pH (~150 nm) ont été obtenus suite à l’insertion d’un copolymère à base de dioctadécyle, de N-isopropylacrylamide (NIPAM) et d’acide méthacrylique. L’anticorps anti-CD33, soit complet soit son fragment Fab’, a été fixé à la surface des liposomes afin de cibler les cellules leucémiques. Les essais in vitro ont démontré la spécificité de la formulation pour différentes cellules leucémiques (CD33+), sa stabilité en présence de protéines plasmatiques et la libération intracellulaire d’un marqueur fluorescent et de l’ara-C. Enfin, des études menées chez la souris saine et immunodéprimée inoculée de cellules HL60 ont montré que la formulation exposant le fragment Fab’ possédait un profil pharmacocinétique et une biodistribution semblables à ceux des liposomes contrôles non-ciblés. L’encapsulation de l’ara-C a permis d’améliorer grandement ses temps de circulation après une administration intraveineuse. Cependant, bien que les immunoliposomes ont permis de prolonger la survie des souris leucémiques comparativement à l’ara-C libre, l’addition du polymère sensible au pH n’a pas permis d’apporter de réel avantage à la formulation lorsque administrée in vivo. Les résultats obtenus dans ce travail de thèse ont, dans un premier temps, mis en évidence que les Sphérulites® pourraient s’avérer utiles dans la vectorisation d’agents anticancéreux si leur capacité à retenir le principe actif in vivo était améliorée. Dans un second temps, les données présentées avec les immunoliposomes suggèrent qu’ils pourraient apporter un bénéfice notable dans le traitement de la LMA.

Caractérisation du risque associé au virus de l'hépatite E chez le porc

Dans cette étude, la bile d’un porc canadien naturellement infecté par une souche du virus de l’hépatite E (VHE) a été utilisée afin d’inoculer deux groupes de porcelets. Dans l’étude précoce (E), 4 porcelets âgés de 4 semaines et exempts de pathogènes spécifiques (SPF), ont été suivis jusqu’à 14 jours post-inoculation (pi). Dans l’étude tardive (L), 9 porcelets ont été suivis à chaque semaine jusqu’à l’abattage, soit 120 jours pi. À la nécropsie, la présence du VHE a été évaluée dans différents organes à 7, 14 et 120 jours pi. Des porcelets témoins (E=2 et L=3) ont été inoculés par de la bile exempte de VHE. Le virus a persisté chez certains animaux jusqu’à 84 à 105 jours pi dans le sérum malgré la présence d’anticorps IgG anti-VHE dans le sang, suggérant une virémie prolongée. L’excrétion virale dans les fèces s’est étalée également sur une période de 105 jours pi chez certains animaux. De plus, la détection de l’ARN viral dans les organes évalués s’est révélée presque nulle à l’âge d’abattage à l’exception de quelques vésicules biliaires, alors qu’on retrouvait l’ARN viral dans plusieurs organes à 7 et 14 jours pi. Pour évaluer la distribution du VHE chez les porcs commerciaux du Québec, un échantillonnage de porcs de trois abattoirs a été réalisé. Environ 100 échantillons de sang, fèces, foies et bile provenant des mêmes animaux en processus d’abattage ont été prélevés dans chacun des abattoirs, sur des porcs destinés à la consommation humaine. La détection de l’ARN viral et des anticorps du VHE a été réalisée à l’aide d’une RT-PCR nichée et d’un test ELISA adapté pour déceler les anticorps porcins anti-VHE. Chez les porcs d’abattoir, 12,9 % des échantillons de bile contenaient de l’ARN viral du VHE, alors que la détection virale était moindre dans les autres organes. Une séroprévalence en IgG de 26,0 % a été obtenue pour les sérums porcins analysés. Une analyse phylogénétique des différentes souches isolées pendant l’étude a démontré qu’elles sont du génotype 3. Ces données indiquent une exposition potentielle des travailleurs de l’industrie porcine au VHE porcin, notamment par les fèces, le sang et les organes et également pour les consommateurs par le biais des foies.

Development of a Blood Antigen Molecular Profiling Panel using Genotyping Technologies for Patients Requiring Frequent Transfusions

Contexte. Les phénotypes ABO et Rh(D) des donneurs de sang ainsi que des patients transfusés sont analysés de façon routinière pour assurer une complète compatibilité. Ces analyses sont accomplies par agglutination suite à une réaction anticorps-antigènes. Cependant, pour des questions de coûts et de temps d’analyses faramineux, les dons de sang ne sont pas testés sur une base routinière pour les antigènes mineurs du sang. Cette lacune peut résulter à une allo-immunisation des patients receveurs contre un ou plusieurs antigènes mineurs et ainsi amener des sévères complications pour de futures transfusions. Plan d’étude et Méthodes. Pour ainsi aborder le problème, nous avons produit un panel génétique basé sur la technologie « GenomeLab _SNPstream» de Beckman Coulter, dans l’optique d’analyser simultanément 22 antigènes mineurs du sang. La source d’ADN provient des globules blancs des patients préalablement isolés sur papiers FTA. Résultats. Les résultats démontrent que le taux de discordance des génotypes, mesuré par la corrélation des résultats de génotypage venant des deux directions de l’ADN, ainsi que le taux d’échec de génotypage sont très bas (0,1%). Également, la corrélation entre les résultats de phénotypes prédit par génotypage et les phénotypes réels obtenus par sérologie des globules rouges et plaquettes sanguines, varient entre 97% et 100%. Les erreurs expérimentales ou encore de traitement des bases de données ainsi que de rares polymorphismes influençant la conformation des antigènes, pourraient expliquer les différences de résultats. Cependant, compte tenu du fait que les résultats de phénotypages obtenus par génotypes seront toujours co-vérifiés avant toute transfusion sanguine par les technologies standards approuvés par les instances gouvernementales, les taux de corrélation obtenus sont de loin supérieurs aux critères de succès attendus pour le projet. Conclusion. Le profilage génétique des antigènes mineurs du sang permettra de créer une banque informatique centralisée des phénotypes des donneurs, permettant ainsi aux banques de sang de rapidement retrouver les profiles compatibles entre les donneurs et les receveurs.