Molecular screening of ADAMTSL2 gene in 33 patients reveals the genetic heterogeneity of geleophysic dysplasia.

Background Geleophysic dysplasia (GD, OMIM 231050) is an autosomal recessive disorder characterised by short stature, small hands and feet, stiff joints, and thick skin. Patients often present with a progressive cardiac valvular disease which can lead to an early death. In a previous study including six GD families, we have mapped the disease gene on chromosome 9q34.2 and identified mutations in the A Disintegrin And Metalloproteinase with Thrombospondin repeats-like 2 gene (ADAMTSL2). Methods Following this study, we have collected the samples of 30 additional GD families, including 33 patients and identified ADAMTSL2 mutations in 14/33 patients, comprising 13 novel mutations. The absence of mutation in 19 patients prompted us to compare the two groups of GD patients, namely group 1, patients with ADAMTSL2 mutations (n=20, also including the 6 patients from our previous study), and group 2, patients without ADAMTSL2 mutations (n=19). Results The main discriminating features were facial dysmorphism and tip-toe walking, which were almost constantly observed in group 1. No differences were found concerning heart involvement, skin thickness, recurrent respiratory and ear infections, bronchopulmonary insufficiency, laryngo-tracheal stenosis, deafness, and radiographic features. Conclusions It is concluded that GD is a genetically heterogeneous condition. Ongoing studies will hopefully lead to the identification of another disease gene.

Reactive electrophile species activate defense gene expression in Arabidopsis.

Compounds containing alpha,beta-unsaturated carbonyl groups are increasingly implicated as potent regulators of gene expression; some are powerful cytotoxins known to accumulate at the site of lesion formation in host-pathogen interactions. We used a robust measurement of photosynthetic efficiency to quantify the toxicity of a variety of lipid derivatives in Arabidopsis leaves. Small alpha,beta-unsaturated carbonyl compounds (e.g. acrolein and methyl vinyl ketone) were highly active and proved to be potent stimulators of expression of the pathogenesis-related gene HEL (PR4). These small volatile electrophiles were far more active than larger alkenal homologs like 2(E)-hexenal, and activated HEL expression in a manner independent of salicylate, ethylene, and jasmonate production/perception. Electrophile treatment massively increased the levels of unesterified cyclopentenone jasmonates, which themselves are electrophiles. Patterns of gene expression in response to electrophile treatment and in response to avirulent bacteria were compared, which revealed strikingly similar transcript profiles. The results broaden the range of known biologic effects of reactive electrophile species to include the activation of a pathogenesis-related gene (HEL) and genes involved in metabolism. Electrophiles can act as mediators of both genetic and biochemical effects on core defense signal transduction.

Role of neutrophils in "Leishmania" infection

Résumé : Dans le modèle murin d'infection avec le parasite protozoaire Leishmania major (L. major), la souche de souris C57BL/6 est résistante a |'infection et développe une réponse protectrice Thelper (Th) 1. Inversement, les souris de la souche BALB/c développent une réponse Th2 et sont sensibles a cette infection. A la suite d'une infection avec ce parasite, les neutrophiles sont les premières cellules présentes au site d'infection et sont recrutées de manière égale dans les souches résistantes et sensibles à L. major, Néanmoins, trois jours après l'infection, la majorité des neutrophiles disparaissent du site d'infection chez les souris C57BL/6, tandis que ils restent jusqu'a dix jours chez les souris BALB/c. Un rôle crucial des neutrophiles a été démontré durant l'infection avec L. major. En effet, la déplétion de ces cellules avant |'infection dans les souris BALB/c, conduit a une réduction du développement des lésions, associée à une baisse de la charge parasitaire et a une modification de la réponse immunitaire vers une réponse Th1 dans des souris normalement sensibles a |'infection, suggérant un rôle immunorégulateur de ces neutrophiles durant les premiers jours de l'infection. Dans la première partie de cette thèse, nous avons étudié le rôle des neutrophiles suite à l'infection avec L. major. Nous avons démontré que le parasite induisait des phénotypes de neutrophiles distincts chez les souris résistantes ou sensibles à L. major. Suite à l'exposition au parasite, les neutrophiles de souris C57BL/6 ont montré une expression élevée des récepteurs Toll-like 2, 7 et 9 ainsi que la sécrétion d'lL-12p7O et d'lL-10, alors que ceux de souris BALB/c sécrétaient de l'IL-12p40 et du TGFB. Nous avons ensuite démontré qu'en réponse à L. major, au contraire des neutrophiles de BALB/c, les neutrophiles de souris résistantes C57BL/6, libéraient la chimiokine CCL3 attirant les cellules dendritiques. Le rôle crucial de cette chimiokine dans la migration de la première de vague de cellules dendritiques au site d'infection ainsi que son rôle dans le développement de la réponse immunitaire subséquente a été établi. Ces résultats démontrent que les neutrophiles, suite a |'infection avec le parasite L. major, créent un microenvironnement capable de déterminer le développement d'une réponse immunitaire spécifique a un antigène. Dans un second temps, nous nous sommes intéressés au rôle des neutrophiles suite a l'infection avec d'autres espèces de Leishmania: L, doriovani et L. mexicaria, agents responsables de leishmaniose viscérale et cutanée chronique respectivement. Un rôle crucial des neutrophiles a été démontré dans la réponse protectrice suite a l'infection avec L. donovani, l'absence de ces cellules amenant à une susceptibilité au parasite accrue, associée avec une induction préférentielle d'une réponse Th2. Inversement, la déplétion des neutrophiles lors de l'infection avec L. mexicaria aboutit a une résistance accrue, comme constaté par la baisse dela charge parasitaire, la hausse de la réponse Th1 ainsi la baisse de la réponse Th2 dans les souris déplétées en neutrophiles. Néanmoins, malgré le rôle délétère des neutrophiles sur le développement d'une réponse protectrice suite à |'infection avec L. mexicana, ces cellules sont nécessaires pour une résolution correcte dela réponse inflammatoire. En résumé, cette étude révèle un rôle majeur des neutrophiles lors de |'infection avec plusieurs especes de Leishmania. Résumé pour un large public : Les neutrophiles font partie de la famille des globules blancs. A la suite d'une infection, ces cellules sont les premières a être recrutées au site d'infection et sont impliquées dans |'élimination des pathogènes. Dans cette thèse, nous nous somme donc intéressés au rôle que pouvaient jouer ces neutrophiles durant l'infection avec le parasite protozoaire Leishmania major (L. major). Dans le modèle murin d'infection avec L. major, la majorité des souches de souris utilisées dans la recherche, dont les souris de la souche C57BL/6, développent de petites lésions qui guérissent spontanément après quelques semaines (souris résistantes). ll existe néanmoins, quelques souches de souris, dont la souche de souris BALB/c, qui développent des lésions qui ne guérissent pas (souris sensibles). Il a été observé que lors de l'lnfection avec ce parasites les neutrophiles étaient les premières cellules recrutées au site de l'lnfection dans toutes les souches de souris, toutefois trois jours après le début dela réaction immunitaire, la majorité des neutrophiles disparaissent chez les souris C57BL/6, tandis qu'ils restent jusqu'à dix jours chez les souris BALB/c. De plus, un rôle crucial des neutrophiles a été démontré durant l'infection avec L. major. En effet, l'absence de neutrophiles durant les trois premiers jours de l'infection chez les souris sensibles à |'infection, rend ces souris résistantes. Ces résultats suggèrent donc un rôle régulateur de la réponse immunitaire des neutrophiles durant les premiers jours de l'infection. Dans la première partie de cette thèse, nous avons étudié le rôle des neutrophiles suite à l'infection avec L. major. Nous avons donc analysé la sécrétion des cytokines, molécules essentielles qui déterminent la réponse immunitaire, par les neutrophiles. Nous avons démontré que le parasite induisait une sécrétion de cytokines différente entre les souris résistantes ou sensibles a L. major. Nous avons ensuite démontré que seule la souche de souris résistante sécrétait la chimiokine CCL3, connue pour être impliquée dans le recrutement de différentes cellules au site d'infecti0n, dont les cellules dendritiques. Les cellules dendritiques sont un élément fondamental pour un bon déroulement d'une réponse immunitaire, de par leur rôle décisif de liaison entre une réponse précoce non-spécifique au pathogène et une réponse plus tardive spécifique au pathogène et nécessaire pour |'élimination de dernier. Nous avons démontré que les neutrophiles de souris résistantes sécrétaient CCL3 et recrutaient les cellules dendritiques au site d'infecti0n, jouant de ce fait un rôle essentiel dans le développement de la réponse immunitaire. Ces résultats démontrent que les neutrophiles, suite à l'infection avec le parasite L. major, créent un microenvironnement capable de déterminer le développement d'une réponse immunitaire. Dans un second temps, nous nous sommes intéressés au rôle des neutrophiles suite à l'lnfection avec d'autres espèces de Leishmania, L. donovani et L. mexicana. Nous avons pu montrer un rôle crucial de ces cellules dans la réponse à ces deux parasites. En effet, suite à |'infection avec L. donovani, un rôle protecteur des neutrophiles a été observé, leur absence menant à une susceptibilité accrue aux parasites. Dans le cas de l'infection avec L. mexicana, une réduction de |'infection a été observée en absence de neutrophiles, avec néanmoins une augmentation de la lésion, suggérant un rôle important de ces cellules dans le développement de la réponse immunitaire ainsi que dans le contrôle de la réponse inflammatoire. En résumé, cette étude révèle un rôle majeur des neutrophiles lors de l'lnfection avec plusieurs membres de la famille Leishrnania. Summary : Upon infection with the protozoan parasite Leishmania major (L. major), C57BL/6 mice show a resistant phenotype, developing a protective Thelper (Th) 1 response. ln contrast, BALB/c mice develop a Th2 response and are susceptible to infection. Following inoculation with the parasite, neutrophils are the first cells migrating at the site of infection and are equally recruited in both L. major- resistant and susceptible mouse strains. However, after three days of infection, almost all neutrophils disappear from the site of infection in C57BL/6 mice, while they persist until ten days in BALB/c mice. Neutrophils were shown to play a crucial role during infection with L. major. indeed, depletion of these cells in BALB/c mice prior to infection with the parasite led to a lower Iesion development, associated with a lower parasite burden and a modification in the immune response towards a Th1 response in these otherwise susceptible mice, suggesting an immunomodulatory role for neutrophils during the first days of infection. ln the first part of this thesis, we were interested in better understanding the role of neutrophils in infection with L. major. \/\/e found that this parasite was inducing distinct neutrophil phenotypes in L. major-resistant and susceptible mice. Upon exposition with L. major, C57BL/6 neutrophils were reported to express high level of Toll-like receptors 2, 7, 9 mRNA and secrete IL-12p70 and IL-10, while BALB/c neutrophils secreted homodimers of IL-12p40, and TGFB. We then demonstrated that in response to L. major, neutrophils from L. major-resistant C57BL/6 mice release the CCL3 dendritic cell attracting chemokine, which is critical for the first wave of dendritic cell migration to the site of infection and in the development of the subsequent immune response. Altogether, these results demonstrated that upon infection with L. major, neutrophils create a microenvironment that can determine the development of an antigen-specific immune response. ln the second part of the thesis we were interested in understanding the role of neutrophils upon infection with of other species of Leishmania: L. donovani causing visceral leishmaniasis and L. mexicana, agent of chronic cutaneous leishmaniasis. Upon infection with L. donovani, neutrophils were found to play a crucial role in the early protective response, their absence leading to an increased susceptibility to the parasite, associated with the preferential induction of a Th2 response. ln contrast, depletion of these cells early in infection with L. mexicana was leading to an increased resistance, as observed by a decreased parasite burden, increased Th1 and decreased Th2 response in neutrophil-depleted mice. However, despite the deleterious role of neutrophils on the development of a protective immune response upon L. mexicana infection, these cells were required for the proper resolution of the inflammatory response. Altogether, these results highlight a major immunomodulatory role for neutrophils in infection with several species of Leishmania.

Induction of cardiac Angptl4 by dietary fatty acids is mediated by peroxisome proliferator-activated receptor beta/delta and protects against fatty acid-induced oxidative stress.

RATIONALE: Although dietary fatty acids are a major fuel for the heart, little is known about the direct effects of dietary fatty acids on gene regulation in the intact heart. OBJECTIVE: To study the effect of dietary fatty acids on cardiac gene expression and explore the functional consequences. METHODS AND RESULTS: Oral administration of synthetic triglycerides composed of one single fatty acid altered cardiac expression of numerous genes, many of which are involved in the oxidative stress response. The gene most significantly and consistently upregulated by dietary fatty acids encoded Angiopoietin-like protein (Angptl)4, a circulating inhibitor of lipoprotein lipase expressed by cardiomyocytes. Induction of Angptl4 by the fatty acid linolenic acid was specifically abolished in peroxisome proliferator-activated receptor (PPAR)beta/delta(-/-) and not PPARalpha(-/-) mice and was blunted on siRNA-mediated PPARbeta/delta knockdown in cultured cardiomyocytes. Consistent with these data, linolenic acid stimulated binding of PPARbeta/delta but not PPARalpha to the Angptl4 gene. Upregulation of Angptl4 resulted in decreased cardiac uptake of plasma triglyceride-derived fatty acids and decreased fatty acid-induced oxidative stress and lipid peroxidation. In contrast, Angptl4 deletion led to enhanced oxidative stress in the heart, both after an acute oral fat load and after prolonged high fat feeding. CONCLUSIONS: Stimulation of cardiac Angptl4 gene expression by dietary fatty acids and via PPARbeta/delta is part of a feedback mechanism aimed at protecting the heart against lipid overload and consequently fatty acid-induced oxidative stress.

Diagnóstico molecular e frequência de anticorpos anti-Leishmania infantum chagasi em cães do município de Belém, Pará

A leishmaniose visceral é uma enfermidade cujo agente etiológico no Brasil é o protozoário Leishmania infantum chagasi. Os cães são considerados reservatórios urbanos da doença, sendo indicadores da ocorrência de casos humanos. O presente trabalho teve como objetivo diagnosticar a infecção por L. infantum chagasi em cães domiciliados e errantes do município de Belém, estado do Pará, através da reação em cadeia da polimerase (PCR) e da reação de imunofluorescência indireta (RIFI), empregando dois antígenos distintos. Amostras de sangue venoso de cães adultos, sem distinção de sexo ou raça, de diferentes bairros e épocas do ano da cidade de Belém-PA, foram colhidas em tubos sem e com anticoagulante para obtenção do soro e do DNA, respectivamente. Esses animais foram divididos em dois grupos: cães errantes capturados pelo Centro de Controle de Zoonoses (Grupo A) e cães domiciliados (Grupo B). Os soros foram analisados através do teste de RIFI para pesquisa de IgG utilizando-se dois antígenos distintos: 1) antígeno do kit Bio-Manguinhos/FIOCRUZ (Ag-PRO) contendo formas promastigotas de Leishmania sp. (complexo major-like); 2) Antígeno do Instituto Evandro Chagas (Ag-AMA) constituído por formas amastigotas de L. infantum chagasi. A avaliação dos dois antígenos foi realizada com as amostras reagentes a partir da titulação 1:80. Já a PCR foi realizada a partir do DNA extraído do sangue total dos animais e amplificado utilizando-se os iniciadores RV1e RV2. Das 335 amostras analisadas, 10,4% (35/335) foram reagentes na RIFI (Ag-PRO) e 0,9% (3/335) reagiram com o Ag-AMA. A distribuição das amostras positivas se deu da seguinte forma: Grupo A 14,8% (25/169) com Ag-PRO e 1,2% (2/169) com Ag-AMA; Grupo B 6% (10/166) com Ag-PRO e 0,6% (1/166) com Ag-AMA; sendo que todas as amostras positivas pelo teste de RIFI com o Ag-AMA também reagiram com o Ag-PRO e em nenhuma das amostras foi detectado o DNA de L. infantum chagasi. Os achados do presente estudo indicam que Belém ainda pode ser considerada área não endêmica para leishmaniose visceral canina e que a natureza do antígeno influencia no resultado da RIFI para a pesquisa de anticorpos anti-L. infantum chagasi em cães, sendo que a RIFI que utiliza formas promastigotas de Leishmania major-like como antígeno deve ser utilizada com cautela como método diagnóstico confirmatório em estudos epidemiológicos em áreas não endêmicas para LVC.

Morphological and immunohistochemical characterization of angiogenic and apoptotic factors and the expression of thyroid receptors in the ovary of tilapia Oreochromis niloticus in captivity

Morphological and immunohistochemical characterization of angiogenic and apoptotic factors and the expression of thyroid receptors in the ovary of tilapia Oreochromis niloticus in captivity were studied. The morphological evaluation of the ovaries was performed by histological paraffin embedded and stained with HE. The immunohistochemical expressions of CDC47, VEGF, Flk-1, angiopoietin, Tie-2 and thyroid receptor (TRα) were performed by the technique of streptavidein-biotin-peroxidase. Apoptosis was assessed using the TUNEL kit. The relative expression of thyroid hormone receptors (TRα and TRβ) was assessed by RT-PCR real time. The nuclear expression of CDC47 increased with the stage of maturation of the oocyte and was observed in the follicle cells. Apoptotic bodies were observed in the follicular cells of atretic follicles and postovulatory follicles from the ovaries of 150g and 350g fish. Expression of VEGF and its receptor Flk-1 was also observed in the follicular cells, and the expression of both increased with the maturity of the oocyte, with a higher intensity observed in the full-grown follicle. The expression of angiopoietin and of its receptor (Tie 2) was discrete and moderate respectively. TRα expression was independent of follicular development. However, the 350 g tilapia exhibited higher expression of TRβ compared with the 50 g tilapia. We conclude that the proliferative activity and the expression of VEGF and its receptor increase with follicular maturation and that the TRs expression increases with ovarian maturity in tilapia (Oreochromis niloticus).

Institutional environment in North Korea: market structure and overcoming institutional voids

Tutkimus sai innoituksensa, kun tutkija huomasi tarpeen liiketaloudelliselle, ajantasaiselle ja realistiselle tutkimukselle Pohjois-Korean markkinoista, joka kuvailisi markkinoiden olemassaolevia ja puuttuvia rakenteita sekä tutkisi mahdollisuuksia ylittää puuttuvat rakenteet. Institutionaalinen teoria valittiin sopivaksi viitekehykseksi kuvailla ja tutkia markkinarakennetta. Tutkimuskysymys muotoiltiin seuraavasti: “Miten ulkomaiset yritykset voivat reagoida puuttuviin markkinarakenteisiin Pohjois-Koreassa?”. Tutkimuskysymys jaettiin kolmeen osakysymykseen: (1) Millainen on Pohjois-Korean markkinoiden institutionaalinen ympäristö? (2) Mitkä ovat merkittävimmät puuttuvat markkinarakenteet Pohjois-Koreassa? (3) Mitä mahdollisuuksia ulkomaisilla yrityksillä voisi olla reagoida puuttuviin markkinarakenteisiin? Tutkimus toteutettiin kvalitatiivisena, koska tutkimuskysymys on deskriptiivinen. Aineisto kerättiin asiantuntijahaastattelun ja kvalitatiivisen sisällönanalyysin keinoin. Primääriaineiston muodostavat 2 asiantuntijahaastattelua ja sekundääriaineiston muodostavat 95 artikkelia, jotka kerättiin 40 lähteestä. Aineisto analysoitiin kvalitatiivisen sisällönanalyysin keinoin. Aineisto koodattiin, luokiteltiin ja esitettiin kokonaisuuksina luokittelurungon avulla, joka laadittiin tutkimusta varten muodostetun teoreettisen viitekehyksen mukaan. Tulokset ja johtopäätökset voidaan tiivistää seuraavasti. (1) Pohjois-Korean markkinan instituutioihin vaikuttaa kaksoisrakenne, jossa muodollinen, sosialistinen rakenne ja epämuodollinen, markkinalähtöinen rakenne toimivat päällekkäin. (2) Puuttuvia rakenteita on sekä markkinan kontekstissa että markkinatasolla. Puutteet ovat osittain seurausta vanhojen rakenteiden korvaantumisesta uusilla, jotka eivät ole institutionalisoituneet. (3) Yritykset voivat käyttää samoja mahdollisuuuksia reagoida puuttuviin markkinarakenteisiin Pohjois-Koreassa, joita kehittyvien markkinoiden yhteydessä on esitetty. Sen tulkittiin vähentävän käsitystä, jonka mukaan Pohjois-Korean markkina on liian erikoinen yritystoiminnalle. (4) Kasvava keskiluokka sekä yrittäjyyden ja naisten yhä merkittävämpi rooli liike-elämässä aiheuttavat alhaalta ylöspäin suuntautuvaa kehitystä markkinoilla. Nämä ovat merkkejä viimeaikaisesta kehityksestä, jotka eivät ole saaneet laajaa huomiota länsimaisessa mediassa. Se korostaa tarvetta liiketaloudelliselle, ajantasaiselle jatkotutkimukselle Pohjois-Korean markkinoista.

Institutional environment in North Korea: market structure and overcoming institutional voids

The research was sparked by an exchange in South Korea, as the author identified a gap in research that provides economic, up to date and realistic information about the North Korean market in English language. A need for a research was identified that would describe the market’s existing and missing market structures and explore possibilities to overcome the missing market structures. Institutional theory was chosen as a suitable framework to describe and explore the market. The research question was formulated as follows: “How can foreign companies overcome institutional voids in the North Korean market?”. To answer the research question, it was divided into three sub-questions as follows: (1) What is the institutional environment in North Korea like? (2) What are the major institutional voids in the North Korean market? (3) What possibilities do foreign companies have to overcome institutional voids? The research is qualitative by nature due to the descriptive and exploratory nature of the research question. Data collection consisted of expert interview and content analysis, resulting in primary data of two interviews and secondary data of 95 articles from 40 different sources. The data was analyzed with the systematical technique of content analysis. The data was coded, classified and presented as concepts with the help of a classification system that was build following the theoretical framework adapted for this study. The findings can be summarized as follows. (1) The market institutions are characterized by an overlapping dual system of formal, socialist structures and informal, market-oriented structures. (2) Institutional voids prevail on both the market’s contextual and on the market level. They are partly result of old institutions being replaced by new institutions that lack institutionalization. (3) Identified possibilities to overcome institutional voids correspond with possibilities drawn from previous research. This decreases the image of North Korea as an impossibly unique market to operate in. (4) Emerging middle class, rapidly growing entrepreneurial activities and women’s increasing role in business drive a down-to-up change in the market. This signals the recent development of the market, yet has been overlooked in the Western media. Thus there is a need for further economic, up to date research concerning North Korea.

Définition du mécanisme de localisation des ARNm cen et ik2 aux centrosomes chez la Drosophile

L’organisation cellulaire repose sur une distribution organisée des macromolécules dans la cellule. Deux ARNm, cen et ik2, montrent une colocalisation parfaite aux centrosomes. Ces deux gènes font partie du même locus sur le chromosome 2L de Drosophila melanogaster et leur région 3’ non traduite (3’UTR) se chevauchent. Dans le mutant Cen, le transport de Ik2 est perturbé, mais dans le mutant Ik2, la localisation de cen n’est aucunement affectée. Ces résultats suggèrent que cen est le régulateur principal de la co-localisation de cen et ik2 aux centrosomes et que cette co-localisation se produit par un mécanisme impliquant la région complémentaire au niveau du 3’UTR des deux transcrits. La localisation de cen au niveau des centrosomes dans les cellules épithéliales de l’embryon est conservée dans différentes espèces de Drosophile : D. melanogater, D. simulans, D. virilis et D. mojavensis. Cependant, la localisation de ik2 n’est pas conservée dans D. virilis et D. mojavensis, deux espèces dont les gènes cen et ik2 sont dissociés dans le génome. Ces résultats suggèrent que la proximité de Cen et Ik2 dans le génome est importante afin d’avoir un événement de co-localisation de ces deux transcrits. J’ai généré différentes lignées de mouches transgéniques dans lesquelles un transgène contenant la séquence GFP fusionnée à différentes partie de Cen (partie codante, 3’UTR, Cod+3’UTR) qui sont sous le contrôle du promoteur UAS et qui sont gal4 inductibles. La région codante de l’ARNm cen était suffisante pour avoir un ciblage précis du transcrit aux centrosomes.

Anàlisi polifàsica de soques de "Pseudomonas fluorescens" potencials agents de biocontrol de malalties de fruiters

Molts bacteris del grup fluorescent del gènere Pseudomonas són capaços de controlar malalties de les plantes causades per fongs i bacteris fitopatògens (ACBs) o mostren activitat com a bacteris promotors del creixement de les plantes (BPCPs). S'han descrit diversos metabòlits que intervenen de manera important en la seva activitat com a ACBs i BPCPs entre els quals en destaquen el 2,4-diacetilfloroglucinol (Phl), àcid fenazin-1-carboxílic (PCA), Pirrolnitrina (Prn), àcid cianhídric (HCN), àcid 3-indolacètic (IAA), sideròfors i quitinases. L'objectiu principal del nostre treball ha estat la comparació de les característiques d'un grup de Pseudomonas del grup fluorescent utilitzant una aproximació polifàsica amb la finalitat d'establir possibles relacions entre algunes de les característiques i la capacitat d'actuar com a ACB o BPCP. Atesa la importància en el biocontrol de la producció de metabòlits com Phl, PCA i Prn, l'objectiu preliminar ha estat la recerca i obtenció de soques productores d'aquests metabòlits. Per assolir aquest objectiu s'ha emprat una aproximació molecular basada en la detecció dels gens biosintètics implicats en la seva producció en lloc de la detecció directa dels metabòlits per evitar els efectes que poden tenir les condicions de cultiu en la inducció o repressió de la seva síntesi. S'han realitzat diferents protocols basats (i) en la cerca assistida de productors mitjançant l'ús de marcadors fenotípics i posterior confirmació per PCR i, (ii) en l'ús de la PCR per a la detecció dels gens directament dels extractes bacterians, d'enriquiments d'aquests extractes i la realització de la hibridació en colònies per al posterior aïllament. La cerca assistida de productors de Phl mitjançant marcadors fenotípics i posteriorment la utilització de tècniques moleculars (amplificació per PCR del gen phlD), ha estat el millor mètode en el tipus de mostres processades en el nostre treball, on la proporció de productors és relativament baixa. En total s'han aïllat a partir de diversos ambients 4 soques portadores dels gens de la síntesi de PCA, 15 de Phl i 1 de Prn. S'ha constituït una col·lecció de 72 soques de Pseudomonas del grup fluorescent que inclou 18 aïllats propis portadors dels gens biosintètics necessaris per la producció de Phl PCA i Prn; 6 soques de referència procedents de col·leccions de cultius tipus, 14 soques productores dels diferents antibiòtics cedides per altres investigadors i una selecció de 34 soques procedents d'un treball previ realitzat en el nostre grup de recerca. A la col·lecció s'hi troben soques candidates a ACB i BPCP de diverses malalties i plantes. Les 72 soques s'han caracteritzat fenotípica i genotípicament. La caracterització fenotípica s'ha portat a terme mitjançant la identificació a nivell d'espècie amb galeries API 20NE i proves bioquímiques específiques; la producció de metabòlits com PCA, Phl, Prn, IAA, HCN, quitinases i sideròfors mitjançant l'ús de diferents tècniques; antagonisme in vitro en diversos medis enfront dos fongs (Stemphylium vesicarium i Penicillium expansum) i tres bacteris fitopatògens (Erwinia amylovora, Pseudomonas syringae pv. syringae i Xanthomonas arboricola pv. juglandis); l'eficàcia de la inhibició de la infecció en bioassaigs in vivo sobre material vegetal enfront els fongs P. expansum en poma i S. vesicarium en fulles de perera i enfront el bacteri E. amylovora en fruits immadurs de perera i, finalment, en assaigs de promoció de creixement en dos portaempelts comercials de Prunus. Cal destacar que P. expansum causa la podridura blava en pomes i peres en postcollita, S. vesicarium la taca bruna de la perera i E. amylovora el foc bacterià de les rosàcies. El nombre de soques de Pseudomonas, sobre el total de les 72 estudiades, productores d'IAA (4) i quitinases (6) és baix, mentre que és elevat en el cas del HCN (32), que a més està associat a la producció de Phl. Els resultats obtinguts en l'antagonisme in vitro han mostrat en el cas dels bacteris que és dependent del patogen indicador i del medi de cultiu. La presència o absència de ferro no sembla ser un factor que potencií l'antagonisme. En el cas dels fongs no s'ha observat però, influència del medi de cultiu emprat. En el total de 72 soques s'ha observat un percentatge baix de soques que manifesten antagonisme en tots els medis assajats vers 3 o 4 dels patògens (7). Solament 2 d'aquestes 7 soques han mostrat ser també efectives en bioassaigs d'inhibició de les infeccions causades per 2 dels 3 patògens assajats. Algunes de les soques efectives en els bioassaigs no són antagonistes in vitro en cap dels medis assajats enfront el mateix patogen. En el cas de la promoció del creixement, s'han observat més soques promotores del creixement del portaempelts de prunera Marianna 2624 que no en l'híbrid de presseguer-ametller GF677 i les eficàcies assolides són també majors en el cas de Marianna 2624, detectant una elevada especificitat soca/portaempelts La caracterització genotípica s'ha realitzat mitjançant l'anàlisi dels polimorfismes en la longitud dels fragments de restricció de DNA ribosomal (RFLP-rDNA) i l'anàlisi dels polimorfismes en la longitud dels fragments de macrorestricció genòmica de DNA cromosòmic separats per electroforesi en camp polsant (MRFLP-PFGE). Ambdues anàlisis van mostrar una gran heterogeneïtat genètica entre les soques caracteritzades i no s'ha pogut relacionar les agrupacions obtingudes amb les característiques fenotípiques o capacitat d'actuar com a ACB o BPCP. Els patrons de macrorestricció genòmica (MRFLP-PFGE) del bacteri model P. fluorescens EPS288 són estables en el temps i independents de les condicions de cultiu assajades al laboratori o en mostres naturals, mostrant ser una tècnica eficaç en la identificació de reaïllats de mostres naturals inoculades prèviament amb el bacteri. Una selecció de soques que comparteixen el fet de produir floroglucinol s'han caracteritzat mitjançant RFLP i seqüenciació del gen phlD. S'ha establert una relació entre les agrupacions obtingudes en les anàlisis RFLP-rDNA, RFLP-phlD i les seqüències del gen. En l'anàlisi filogenètica de les seqüències del gen phlD s'ha observat un elevat grau de polimorfisme obtenint-se 3 agrupacions principals. Les agrupacions semblen relacionar-se amb els patrons de producció de metabòlits (Phl, HCN i Prn en una primera agrupació; Phl i HCN en la segona i solament Phl en la tercera), però aquestes no s'han pogut relacionar amb l'origen geogràfic de les soques o la seva activitat com a ACBs i/o BPCP. Amb les dades obtingudes de la caracterització fenotípica i genotípica s'ha realitzat una anàlisi multivariant (correspondències, correlacions d'Spearman i de freqüències amb variables categòriques). S'ha demostrat la importància de disposar d'una tècnica que permeti depurar una col·lecció de soques descartant les soques genèticament idèntiques, ja que influeixen en els resultats de les anàlisis. Pels tres patògens assajats com a indicadors i els dos portaempelts emprats, no s'ha observat cap correlació entre la inhibició de la infecció o la promoció del creixement amb les característiques fenotípiques i genotípiques de les soques que fos significatiu i consistent en les tres tècniques emprades.

Influence of dietary protein intake and glycemic index on the association between TCF7L2 HapA and weight gain

BACKGROUND: Genetic polymorphisms of transcription factor 7-like 2 (TCF7L2) have been associated with type 2 diabetes and BMI. OBJECTIVE: The objective was to investigate whether TCF7L2 HapA is associated with weight development and whether such an association is modulated by protein intake or by the glycemic index (GI). DESIGN: The investigation was based on prospective data from 5 cohort studies nested within the European Prospective Investigation into Cancer and Nutrition. Weight change was followed up for a mean (±SD) of 6.8 ± 2.5 y. TCF7L2 rs7903146 and rs10885406 were successfully genotyped in 11,069 individuals and used to derive HapA. Multiple logistic and linear regression analysis was applied to test for the main effect of HapA and its interaction with dietary protein or GI. Analyses from the cohorts were combined by random-effects meta-analysis. RESULTS: HapA was associated neither with baseline BMI (0.03 ± 0.07 BMI units per allele; P = 0.6) nor with annual weight change (8.8 ± 11.7 g/y per allele; P = 0.5). However, a previously shown positive association between intake of protein, particularly of animal origin, and subsequent weight change in this population proved to be attenuated by TCF7L2 HapA (P-interaction = 0.01). We showed that weight gain becomes independent of protein intake with an increasing number of HapA alleles. Substitution of protein with either fat or carbohydrates showed the same effects. No interaction with GI was observed. CONCLUSION: TCF7L2 HapA attenuates the positive association between animal protein intake and long-term body weight change in middle-aged Europeans but does not interact with the GI of the diet.

Messenger RNA expression of Pabpnl1 and Mbd3l2 genes in oocytes and cleavage embryos

Objective: To identify genes specifically expressed in mammalian oocytes using an in silico subtraction, and to characterize the mRNA patterns of selected genes in oocytes, embryos, and adult tissues. Design: Comparison between oocyte groups and between early embryo stages. Setting: Laboratories of embryo manipulation and molecular biology from Departamento de Genetica (FMRP) and Departamento de Ciencias Basicas (FZEA) - University of Sao Paulo. Sample(s): Oocytes were collected from slaughtered cows for measurements, in vitro fertilization, and in vitro embryo culture. Somatic tissue, excluding gonad and uterus tissue, was collected from male and female cattle. Main Outcome Measure(s): Messenger RNA levels of poly(A)-binding protein nuclear-like 1 (Pabpnl1) and methyl-CpG-binding domain protein 3-like 2 (Mbd3l2). Result(s): Pabpnl1 mRNA was found to be expressed in oocytes, and Mbd3l2 transcripts were present in embryos. Quantification of Pabpnl1 transcripts showed no difference in levels between good-and bad-quality oocytes before in vitro maturation (IVM) or between good-quality oocytes before and after IVM. However, Pabpnl1 transcripts were not detected in bad-quality oocytes after IVM. Transcripts of the Mbd3l2 gene were found in 4-cell, 8-cell, and morula-stage embryos, with the highest level observed in 8-cell embryos. Conclusion(s): Pabpnl1 gene expression is restricted to oocytes and Mbd3l2 to embryos. Different Pabpnl1 mRNA levels in oocytes of varying viability suggest an important role in fertility involving the oocyte potential for embryo development. (Fertil Steril (R) 2010; 93: 2507-12. (C) 2010 by American Society for Reproductive Medicine.)

Diagnóstico molecular e frequência de anticorpos anti-Leishmania infantum chagasi em cães do município de Belém, Pará

A leishmaniose visceral é uma enfermidade cujo agente etiológico no Brasil é o protozoário Leishmania infantum chagasi. Os cães são considerados reservatórios urbanos da doença, sendo indicadores da ocorrência de casos humanos. O presente trabalho teve como objetivo diagnosticar a infecção por L. infantum chagasi em cães domiciliados e errantes do município de Belém, estado do Pará, através da reação em cadeia da polimerase (PCR) e da reação de imunofluorescência indireta (RIFI), empregando dois antígenos distintos. Amostras de sangue venoso de cães adultos, sem distinção de sexo ou raça, de diferentes bairros e épocas do ano da cidade de Belém-PA, foram colhidas em tubos sem e com anticoagulante para obtenção do soro e do DNA, respectivamente. Esses animais foram divididos em dois grupos: cães errantes capturados pelo Centro de Controle de Zoonoses (Grupo A) e cães domiciliados (Grupo B). Os soros foram analisados através do teste de RIFI para pesquisa de IgG utilizando-se dois antígenos distintos: 1) antígeno do kit Bio-Manguinhos/FIOCRUZ (Ag-PRO) contendo formas promastigotas de Leishmania sp. (complexo major-like); 2) Antígeno do Instituto Evandro Chagas (Ag-AMA) constituído por formas amastigotas de L. infantum chagasi. A avaliação dos dois antígenos foi realizada com as amostras reagentes a partir da titulação 1:80. Já a PCR foi realizada a partir do DNA extraído do sangue total dos animais e amplificado utilizando-se os iniciadores RV1e RV2. Das 335 amostras analisadas, 10,4% (35/335) foram reagentes na RIFI (Ag-PRO) e 0,9% (3/335) reagiram com o Ag-AMA. A distribuição das amostras positivas se deu da seguinte forma: Grupo A 14,8% (25/169) com Ag-PRO e 1,2% (2/169) com Ag-AMA; Grupo B 6% (10/166) com Ag-PRO e 0,6% (1/166) com Ag-AMA; sendo que todas as amostras positivas pelo teste de RIFI com o Ag-AMA também reagiram com o Ag-PRO e em nenhuma das amostras foi detectado o DNA de L. infantum chagasi. Os achados do presente estudo indicam que Belém ainda pode ser considerada área não endêmica para leishmaniose visceral canina e que a natureza do antígeno influencia no resultado da RIFI para a pesquisa de anticorpos anti-L. infantum chagasi em cães, sendo que a RIFI que utiliza formas promastigotas de Leishmania major-like como antígeno deve ser utilizada com cautela como método diagnóstico confirmatório em estudos epidemiológicos em áreas não endêmicas para LVC.

Ação da IL-18 sobre a expressão do receptor dectina-1 e produção de citocinas por monócitos humanos desafiados com diferentes cepas de Paracoccidioides brasiliensis

Estudos têm demonstrado que o reconhecimento inicial de microrganismos é mediado por receptores celulares expressos em células da imunidade inata denominados receptores de reconhecimento de padrões (PRRs). Assim, a interação entre moléculas de superfície dos patógenos e receptores homólogos presentes na membrana celular de monócitos, modula a fagocitose, a ativação da célula e conseqüentemente a produção de citocinas. Trabalhos têm demonstrado a importância da estimulação de receptores toll-like 2 e 4 (TLR2 e TLR4), receptores de manose (MR) e dectina-1 de monócitos, tanto em infecções bacterianas como fúngicas, culminando com indução de produção de várias citocinas. A IL-18 é uma citocina indutora de IFN-g e possui uma ação extremamente importante, por ser capaz de promover tanto uma resposta do tipo Th1 ou Th2, dependendo do contexto de estimulação e do microambiente de citocinas. Em trabalho recente demonstramos que a IL-18 possui uma ação importante sobre o aumento da expressão de MR em monócitos humanos, e o reconhecimento do Paracoccidioides brasiliensis via esse receptor causaria aumento do crescimento fúngico no interior da célula. Dessa forma, os objetivos do presente projeto foram: 1) Avaliar a ação da IL- 18 sobre a expressão do receptor dectina-1 por monócitos humanos desafiados in vitro com diferentes cepas do P. brasiliensis; b) Avaliar a participação da dectina-1 na indução da produção de IL-18, TNF-a e IL-10 por monócitos desafiados in vitro com diferentes cepas do P. brasiliensis. Assim, monócitos de indivíduos normais tratados in vitro com IL-18 foram desafiados com diferentes de cepas do P. brasiliensis, e a expressão do receptor dectina-1 foi avaliada pela técnica de citometria de fluxo. A dosagem de IL-18, TNF-a e IL-10 no sobrenadante de cultura de monócitos desafiados com P. brasiliensis foi realizada utilizando a técnica de ELISA . Os resultados mostraram que a ...

Avaliação do envolvimento do receptor dectina-1 na atividade fungicida e na produção de metabólitos do oxigênio por neutrófilos e monócitos humanos desafiados com Paracoccidioides brasiliensis

Fundação de Amparo à Pesquisa do Estado de São Paulo (FAPESP)